Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Abstract

Konfokal mikroskopi, kemik iliği gibi kompleks dokuların içinde çok sayıda hücre tipinde lokalizasyonu analizi için tercih edilen yöntemdir. Birçok durumda bu nedenle bir hakem-bağımlı önyargı tanıtan ve arası güvenilirlik azaltılması riskini taşıyan, manuel sayım dayanır Ancak, hücresel lokalizasyonu analizi ve ölçümü zordur. Hücre tipleri kendi oluşma sıklığı güçlü farklılık özellikle Dahası, rastgele pozisyon iki hücre sonuçları arasında eş-lokalizasyonu olmadığını değerlendirmek için genellikle zordur. Burada, kemik iliği hücre eş-lokalizasyonu tarafsız ölçümü için bir yöntem verilmektedir. protokol kemik iliği dahil tüm kemirgen uzun kemiklerin histolojik bölümleri elde etmek için kullanılan numune hazırlama, yanı sıra boyama protokolü ve yüksek çözünürlüklü görüntülerin satın açıklar. Hematopoetik olmayan HEMAT tanınması itibaren uzanan bir analiz iş akışıBu hücreler arasında doğrudan temasların miktarının 2-boyutlu (2D), kemik iliği görüntülerde opoietic hücre tipleri sunulmaktadır. Bu da belli bir hücre türü çevreleyen hücresel mikroçevresinin hakkında bilgi almak için, bir mahalle analizini içerir. Iki hücre türünün eş-lokalizasyonu rasgele hücre konumlandırma sadece sonucu veya hücreler arasında tercihli ilişkileri gösterir olup olmadığını değerlendirmek için, hematopoietik olarak stromal hücrelerin durumunda bu hipotezi test etmek için uygun olan bir simülasyon aracı, kullanılır. Bu yaklaşım, kemik iliği ile sınırlı değildir, ve histolojik verilerin tekrar üretilebilir, kantitatif analiz olanak sağlamak üzere diğer dokulara uzatılabilir.

Introduction

Nedeniyle optik görüntüleme dahil olmak üzere mikroskopi son hızlı teknolojik gelişmelere, tüm doku kapsamında hücrelerin analizi immunologlar için giderek erişilebilir hale gelmiştir. süspansiyon tek hücrelerin karakterizasyonu hücresel ve moleküler fonksiyonunu anlamak için değerli ve vazgeçilmez yöntemi temsil eder. Ancak, (mikro) ANATOMİK ortam içinde hücrelerin analizi bu tip bağışıklık tepkilerinin geliştirilmesi gibi karmaşık işlemler işbirliği çeşitli hücre tipleri arasındaki etkileşimleri anlamak için gereklidir.

Mikroskopist görüntülerden nitel bilgi elde etmek için nispeten kolay olsa da, kısmen, bu alanda analiz yöntemleri görüntü elde etme mümkündür ne göre geride gerçeğine, bu verileri ölçmek için bir sorun olmaya devam etmektedir. Birçok araştırmacı hala zaman alıcı onların histoloji görüntüleri manuel hücre sayım güveniyorböylece farklı değerlendiriciler arasında bir önyargı tanıtan ve diğer gruplar tarafından çoğaltmayı engelleyen. Çoğu zaman, bir temsilci görüntü zor okuyucu böyle bir olayın istatistiksel alaka yargılamak için yapım, bir yayında hücresel pozisyon veya ortak lokalizasyon bir açıklama altını seçilir.

Birlikte görüntü verilerinin tam bilgi içeriği nadiren istismar olduğu gerçeği ile, bu daha hızlı, tarafsız ve kapsamlı bir yaklaşım histolojik görüntüleri analiz etmek gerektiğini vurgulamaktadır.

Kemik iliği yetişkin omurgalıların hemopoeziste organı gibi önemli yaşamsal fonksiyonları alır karmaşık bir doku vardır. Hematopoetik hücrelerin ^1,2 için doğum yeri olan ve B lenfosit gelişimi ³ önemli bir rol oynayan yanı sıra, aynı zamanda bağışıklık reaksiyonları ⁴ başlatılan ve olgun, sirkülasyon B hücreleri ⁵ destekleyen bir siteye olarak görür. I muhafaza Buna ek olarak, onun rolüolarak bağışıklık hafızasına sahip oluşturan çeşitli hücre tipleri ^6-9 orada bulunan tespit edilmiş olarak mmunological olarak giderek artan bellek, son on yıl içinde takdir hale gelmiştir.

Karmaşık doku, kemik iliği mimarisi ve fonksiyonları arasındaki ilişki hala zor kalır. T ve B hücresi bölgeleri gibi makro bölümlerinde düzenlenir, ikincil lenfoid organların farklı olarak, kemik iliği açık bir makro bölümlere ayrılmasını yoksundur. Şimdiye kadar, kemik iliğinde farklı bölmeleri kemik korteks ya da damar yakınlıkları ile tanımlanır. Bu tür destek kök hücreleri, B hücreleri ya da uzun süreli plazma hücreleri (PC gibi bağışıklık hafıza hücre popülasyonlarında (bakımı), CD4 ⁺ ve gelişimi gibi bir dizi işlem kemik iliğinde çeşitli yerleşik stromal hücre popülasyonlarının önemi CD8 ^{+ hafızalı} T hücreleri) açık bir şekilde kemik iliği mikro-bölümlendirme belirli bir derecede olduğunu gösterir.

10 birkaç. Kemik iliğinde görselleştirme ve stromal hücrelerin karakterizasyonu nedeniyle uzun, ince dendritik uzantıları kemik iliği boyunca bir ağ oluşturan morfolojik özellikleri zordur, ve uygun belirteçler eksikliği stromal subpopülasyonunun ayırt etmek.

Bu nişler kendi hücresel ve moleküler Compositio açısından ortak özellikleri paylaşan ne kadar henüz olarak belli değiln ve elemanları belli bir niş benzersiz kılıyor. Stromal hücrelerin yanı sıra, hematopoietik hücre tipleri niş bazı en azından bazı sinyaller sağlayarak önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Açıkçası, niş bileşiminin karmaşıklığı yerinde kendi analizini gerektirir ve immunolojistlerden ve hematolog hücresel bileşenleri arasındaki mekansal ilişkileri analiz ederek, örneğin kemik iliği mikromimarisine, yakınlaştırmak için giderek daha önemli hale gelmiştir.

Burada, bir strateji sunulmuş bir otomatik ve tarafsız bir şekilde kemik iliğinde hücresel ortak yerelleştirme ve mahalle ilişkileri ölçmek için. Floresan hücreleri ve floresan olmayan hematopoietik hücreler, undekalsifiye kemik, bütün kemiğin kapsayan konfokal imajların ediniminin histolojik kesitlerin hazırlanması, hem de hücresel c otomatik görüntü analizine kimerik farelerin üretilmesi de dahil olmak üzere barındıran ayrıntılı bir iş akışıo-lokalizasyon ve simülasyon aracı ile rastgele konumlandırma onun doğrulama / ayrımcılık (Şekil 8) sağlanır.

Protocol

Hayvan deneyleri, hayvan refahı (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) için uygun eyalet komiteleri tarafından onaylanmış ve güncel kılavuzlarda ve yönetmeliklere (hayvan deneyi lisans G0194 / 11) uygun olarak yapıldı.

Floresan Kemik İliği Kimerik Fareler 1. Nesil

Not: ⁹ daha önce anlatıldığı gibi, kemik iliği stromal hücreleri görselleştirmek için floresan kemik iliği kimerik farelerin üretilmesi gerçekleştirilir.

1. Del-Cre ışınlama için onları hazırlamak için (tandem kırmızı floresan proteini (tdRFP) yayg ^11-13 ifade fareler) ROSA-tdRFP fareler x tedavi başlayın. Alternatif olarak, floresan protein yerde bir ifade ile herhangi bir gerginlik kullanılır. Iki gün ışınlamadan önce, içme suyu yoluyla Neomisin, 1 mg / ml ve 1 mg / vitamin mi (A, D3, E, C) uygulayınız.
2. Bir Sezyum-137 gama-ışıma wi ile 3.8 Gray ile iki kez fareler saçmak3 saatlik bir aralık ince. Bunun için, ilgili irradiator için uygun bir ışınlama pasta kafese fareler yerleştirin.
   NOT: Farelerin ışınlama için, bizim Enstitüsü anestezi gerektirmez. Işınlama için anestezi ile ilgili yerel kurumsal politikalar izleyin. Ağrı belirtileri varsa ışınlama sonrası günde karprofen derialtı (sc) 5 mg / kg ile hayvanları davranın.
3. Sonraki gün, transfer tampon maddesi ^9, C57BL / 6 verici farelerinin uzun kemik hazırlanabilir 3 x 10 ^6, kemik iliği hücrelerinin bir damardan enjeksiyonu ile farelerin sulandırın. Kadar 2 hafta boyunca Neomisin üzerinde fare ve vitamin tutun ve bu süre içinde kendi refahını ve ağırlığı izlemek. Spesifik deneysel tedavi başlamadan önce bağışıklık sisteminin yeniden sağlamak için en az 4 hafta bekleyin (bağışıklık) ^9.
4. Fareler Kurban ve bir diseksiyon gemide koyun,% 70 etanol ile bacakları sterilize. EuthanizYerel Kurumsal politikalarına uygun e fareler. Bizim Enstitü servikal dislokasyon gerçekleştirir.
5. Uyluk cilt kaldırmak için forseps ve makas kullanın. Femoral kemik maruz kas dokusu çıkarın. Forseps ve makas kullanılarak kalça ve diz ekleminden femur kemiği luxate. Kırmak veya kemik kesmek için dikkatli olun.
6. Dikkatle makas kullanılarak kemik, kas dokusu ve kıkırdak büyük parçalar kalan kaldırın. Laboratuvar kağıt mendil ile kemik sürtünme kalan kas dokusu çıkarın. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir petri çanağı içinde temizlenmiş toplama kemikleri.
7. 6 saat - 4 için% 4 paraformaldehid (PFA, elektron mikroskobu dereceli) bütün femur kemikleri düzeltildi.
8. PFA atın ve PBS O / N% 10 sakaroz kemikleri kuluçkaya yatmaktadır. Bir sonraki gün,% 20 sukroz O / N kemikleri inkübe edin. gün sonra,% 30 sakaroz O / N kemikleri kuluçkaya yatmaktadır.

Bones 2. Cryosectioning

NOT: 1 sonra6 -% 30 sakaroz 24 saat, kemikleri dondurma ve Kawamoto en bant yöntemi ^14,15 göre bunları cryosection.

1. Bir kuru buz ve aseton ile büyük bir beher (2000 ml hacim) hazırlanması (yaklaşık 2: 1 hacim oranında, örneğin, kuru buz, 400 ml aseton içinde, 200 mi) bir duman başlığı altına. (- 50 ml yaklaşık 30) içinde hekzan ile - (250 ml hacim 150) küçük bir behere koyun. (Don büyük beher dışında görünene kadar, yaklaşık 10 dakika) soğumasını bekleyin karışımı.
2. Süper Cryoembedding Orta (SCEM) ile işaretlenmiş cryomold ¾ doldurun; tam da kalıp kenarlarına dokunmayın özen, dalmış kadar dikkatlice içine kemikleri yerleştirin. Büyük forseps ile sadece hekzan yüzeyine dokunmadan kalıp tabanı ile beher içine cryomold tutun.
   1. SCEM dondurma dış kenarlarını edelim (donukluk ile gösterilir, bu yaklaşık 15 sn sürer). Sonra tam hekzan içine kalıp açılır ve fre let it2 dakika - 1 için Eze. Dondurulmuş örnek çıkarın ve selofan sarın ve daha sonra alüminyum folyo (kurumasını örnek korumak ve ışığa maruz kalmasını önlemek için). Cryosectioning kadar -80 ° C'de saklayın.
3. Femoral kemiklerin cryosectioning için sert dokular için bir standart mikrotom ve mikrotom bıçakları kullanın.
4. -24 ° C'ye kadar mikrotom numune ve bıçak sıcaklığını ayarlayın. Örnek kesmeden önce yaklaşık 15 dakika mikrotomla içinde bekletin.
   1. SCEM veya optimum kesme sıcaklığı (Ekim) orta metal numune tutucu örnek blok Fix. Blok gerekirse yönünü ayarlayın. Kemik tamamen açılıncaya kadar örnek Trim ve iliği görünür. 7 um bölüm kalınlığı (ilk bölüm atmak) ayarlayın.
   2. Bir geyik deri-kaplı ahşap spatula kullanarak örnek blok üstünde yapışkan tarafı Kawamoto bant bir parça Fix. Daha sonra, örnek kesme ve kesittir, böylece bant edeceküst tarafta yer alan. Forseps kullanarak bir slayt cam bandı aktarın. Scotch bant ile slayt cam bandı sabitleyin.
5. Bölümler en az 30 dakika kurumasını bekleyin ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın. Birlikte sopa önlemek için tek slaytlar arasındaki ayırıcılar ile plastik slayt kutulara lekesiz ve monte slaytlar saklayın. Lekeli ve monte slaytlar 4 ° C'de bir hafta kadar karton slayt klasörler için saklanabilir.

3. Resim Koleksiyonu

1. Ortak immunofloresan protokolleri ^9'a göre çözülme ve leke cryosections. Örneğin bir nükleer boya, doku bütünlüğünün görselleştirmek için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) içerir.
   Not: Leke, örneğin, RFP stromal hücreler (anti-TTT-biyotin antikoru ve streptavidin Alexa Fluor 555), sıçan anti-ana temel protein (MBP) antikoru ve anti-fare-Alexa Fluor 647 antikoru ile leke eozinofilleri görselleştirmek B hücreleri,Anti-κ hafif zincir-Floresein-izo-tiyosiyanat (FITC) ve anti-λ1 hafif zincir-FITC ile antikorlar sıçan anti-B220-Alexa Fluor 594 antikoru ve PC (boyama işleminin detayları ^9'da tarif edilmiştir).
2. Lekeli bölümleri bağlayın: bölümündeki Fluoromount bir damla koymak ve sonra dikkatlice hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek iken, bir # 1 cam kapak kayma ile kaplayın. Daha sonra, boyama için uygun lazer hatları ile donatılmış bir aracı olan lazer tarama konfokal mikroskobu gerçekleştirmek.
3. Stromal hücreler aşağıdaki ayarları uygulayın, Wimasis aracını kullanarak kemik iliği hematopoetik hücrelerin otomatik eş-lokalizasyon analizi için görüntüleri kaydetmek için:
   1. Bir 20X objektif lens ve 708,15 x 708,15 um bir görüş alanı kullanın. Otomatik analiz için, karşılaştırılabilir sonuçlar tutmak için 2.048 x 2.048 piksel (px) tutarlı, tüm görüntülerin boyutunu tutmak.
   2. (Örn stromal yapıları için bir kanal kaydetmek, (örneğin, DAPI, 405 nm) ve ilgi hematopoietik hücreler (ek kanallar, örneğin, 3 kanal, eozinofiller, B hücreleri ve bilgisayarlar için 488/594/633 nm).
   3. 4 ¹⁶ ortalama satırını kullanarak Tutanak görüntüleri. İdeal olarak, tek komşu görüntüleri alarak tüm femur bölüm kapsayacak. Alternatif olarak, kemik iliği (cisim yanı sıra epifiz) çeşitli bölgelerinden gelen komşu olmayan fotoğraf çekmek.
      NOT: Bitişik görüntüleri (örtüşen alanlarda hücrelerin tekrarlanan analiz önlemek için) arasındaki örtüşme üretmek için dikkatli olun.
4. Bir mikroskopi görüntü dosyası formatında görüntü kaydetmek. Kontrol ve gerekirse, resim görüntüleyici / analiz yazılımı tüm kanallar için kontrastını ayarlamak.
5. Görüntü dosyası başına İhracat 3 .jpg dosyaları: DAPI kanalı (kırmızı / yeşil / mavi (RGB) formatında, sarı kodlu sahte renk), stroma kanalı için bir .jpg dosyası (gri tonlama) ve bir .jpg için bir .jpg dosyası Dosya içerenhematopoetik hücreleri için kanallar (3 kanal maksimum RGB formatı, örneğin, FITC (PC'ler, yanlış renk: yeşil) / Alexa Fluor 594 (B hücreleri, yanlış renk: mavi) / Alexa Fluor 647 (eozinofiller, yanlış renk: kırmızı)) .

4. Otomatik Görüntü Analizi

1. Görüntü segmentasyonu, eş-lokalizasyon ve mahalle analizi (Tartışma) kantifikasyonunu gerçekleştirmek için bir görüntü analizi aracını kullanın.
2. Wimasis araçlarını kullanarak, aşağıdaki gibi devam edin:
   1. Bir alt çizgi ve görüntü türünü belirten bir sayı ile takip aynı dosya adıyla görüntü başına 3 .jpg dosyaları setleri yükleyin.
   2. Hematopoietik hücreler ile .jpg dosya _1 kullanarak, stroma kanalı .jpg dosya DAPI kanalı, _3 .jpg dosya _2. Image1_1.jpg (hematopoetik hücreleri), Image1_2.jpg (DAPI kanalı) ve Image1_3.jpg (Stroma kanalı) Örneğin:. Müşteri hesabı üzerinden resim yüklemek.
   3. Hücre temas ölçümü içinİlgili alanda tıklayarak hücre iletişim aracını seçin. Hücre civarı ölçümü için, hücre civarı aracını seçin ve (hücrelerin kenarlarından ölçülür) um tercih civarı yarıçapı girin.
   4. Sonuçları indirin.
      NOT: Bu sonuçlar özet ek olarak, .jpg hematopoietik hücrelerin ve tespit edilen nesnelerin sınırları stroma kanalı gösteren dosyaları vurgulanan, hem de her görüntü için ölçümler ihtiva eden tek .csv dosyaları olarak verilmiştir .csv dosyası, Yüklenen tüm görüntüler için verileri içerir.
3. Kişiden ölçümler bir örnek Temsilcisi Sonuçlar gösterilen stromal hücreler, ya da diğer hematopoetik hücre tipleri temas, kırmızı, yeşil veya mavi hücre frekansları ile temas (hematopoetik hücreler (kırmızı, yeşil veya mavi hücrelerin) sıklığını belirlemek Şekil 4). Frekansları belirlemek için, görüntünün başına verilen kontak sayıları bölmektoplam hücre görüntü başına sayar.
   1. Bireysel fareler ile deneyler için, tek fareler için tüm görüntülerin toplam temas sayımları Özetle ve tüm görüntülerin toplam hücre sayımlarının toplamı ile bölünmesi.
4. Aşama 4,3 (tarif edildiği gibi civarı ölçümlerinden, stromal hücreler ve / veya diğer hematopoietik hücre tiplerine tercihli yakınlık içinde, kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin frekanslarından seçilmiş bir mesafe olan kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin sıklığını belirlemek Ayrıca bakınız Temsilcisi Sonuçlar, Şekil 4).

Rastgele Kemik İliği Konumlandırma 5. Simülasyon

1. Analiz kemik iliği histolojik görüntülerde rasgele hücre konumlandırma simülasyonları çalıştırmadan önce, önceden aşağıdaki dosyaları hazırlamak: Hücre iletişim aracı, DAPI kanalı için orijinal .jpg dosyaları ve orijinal .jpg dosyaları tarafından sağlanan tek .csv dosyaları stromal kanalı.
2. Gerçekleştirmek içingörüntülerin bir dizi toplu simülasyonları (örneğin, bir femur bölümünden tüm görüntüleri), bir klasördeki tüm orijinal .jpg dosyaları (_1, _2 ve _3) ve ilgili tek .csv dosyalarını toplamak.
   NOT: rastgele kemik iliği hücre konumlandırma için simülasyon aracı istek üzerine mevcuttur.
3. Kutu "Otomatik yük görüntü verisi" kontrol simülasyon aracını başlatın.
   NOT: Program .csv dosyasından hücre sayımları ve ortalama hücre boyutunu otomatik olarak okuyacaktır. Bu değerler "Hücre sayısı" ve "Hücre boyutu AVG" (Şekil 5A) için kutularında görüntülenir.
4. .csv Dosyaları, yani, kendi adlarına ortak faktör için ortak etiketi girin. Toplu modu simülasyonu için kullanılması gereken görüntü setleri numarasını girin.
5. (Dosya adı biten _3) ile stroma kanalından oluşturulan .jpg dosyasını yükleyin.
6. DAPI kanal maskesini üretmek için ayarları girin:
   1. Kutusunu "kontrol? Maskesi uygulayın "10 (- 255 aralığında 0) bir ikili maske içine DAPI görüntü dönüştürmek için eşiğini ayarlayın.
   2. Kutusunu işaretleyin "dilate?" "? 8-bit" kutusunu işaretleyin ve 5 px genişlemesi notu ayarlayın. "/ Erozyon? W" kutusunu işaretleyin.
   3. Simüle görüntülerin analizi için kullanılan civarı yarıçapı (mahalle yarıçapı) için istenen değeri girin. (Piksel ölçekleme xy: 0.346 um) 2048 X 2048 piksel boyutunda ile 708,15 x 708,15 um'lik bir görüntü için, 29 piksel, 10 um gelmektedir.
7. Kutusunu işaretleyin "Otsu kullanılsın mı?" Stromal yapıların otomatik tespiti için Otsu algoritması ¹⁷ kullanmak için.
   NOT: Bu iletişim ve civarı aracı tarafından kullanılan aynı algoritma. Kaydedilen görüntü ve simüle görüntünün otomatik analizinde aynı görüntü segmentasyon algoritması kullanılarak karşılaştırılabilir veri tutmak için çok önemlidir.
8. Ar hematopoetik hücreler için ayarları girine dairesel şekiller olarak simüle.
   NOT: kırmızı, yeşil ve mavi hücreler hücre sayıları doğrudan (ayrıca bkz 5.6 adım) .csv dosyasından yüklenir.
   1. Kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin px ortalama çapı hesaplamak için simülasyon aracını kullanın. Görüntü için toplam hücre sayısı bölü px görüntüde her hücre türünün toplam alanı olarak tek bir hücre ortalama alanı belirler. Formülü kullanarak bir diskin yarıçapı hesaplamak için ortalama alanını kullanın. Ortalama çapı belirlemek için yarıçapı ikiye katlayın.
9. Nesne bölütleme fonksiyonları içeren bir görüntü analizi yazılımı ile analiz hücre tiplerinin hücre boyutu dağılımı ölçülür. Bütün hematopoietik hücre tipleri ⁽¹⁸ ve Şekil 5B) için σ belirler.
   NOT: Kaydedilen hücrelerin hücre boyutu dağılımları otomatik görüntü analizi ile tespit olmadığından, gerçek dağıtımları bir yaklaşım olarak bir Gauss dağılımı kullanın. t genişliğiO dağılım eğrisi σ tarif edilmektedir ve çeşitli hücre tipleri için oldukça farklı olabilir. (Daha fazla bilgi için, Şekil 5B bakınız).
   1. Hareketsiz görüntü analiz aracı ile tam bir hücre olarak tanınan küçük nesneyi açıklar px çapı: Bu ölçümlerden, "hücre boyutu cutoff" belirler.
10. Grafik kullanıcı arabirimi (Şekil 5A) üzerinde ilgili kutulara parametreleri girin.
    1. Px bir çap olarak, kesilmiş hücre boyutunu, yani, simülasyonda izin verilen minimum hücre boyutunu girin.
    2. (Adım 5.9 dan itibaren), kırmızı, yeşil ve mavi hücreler için hücre boyutu dağılımının simülasyonu için px σ girin.
    3. Alt bölümünde "Maske hücreler" in "Sil" kutusunu işaretleyin. Bu maskenin bir no-go alanı ile en az bir piksel ile örtüşmektedir, bu ayar ile, program, bir hücre için yeni bir pozisyon seçti. Hücre üst üste kaçının "kutusunu işaretleyin? ̶1 'dir; alt bölüm "Hücre dışlama" olarak.
    4. Px iki hücre merkezleri arasında izin verilen minimum mesafeyi girin.
       NOT: minimum mesafe kaydedilmiş görüntülerden tespit edilmesi gerekmektedir. Yanlış ölçülen minimum mesafeler kaydedilmiş ve simüle görüntülerin karşılaştırılması için önyargılı / yapay sonuçlara yol açacaktır.
    5. Örtüşme merkezden merkeze asgari mesafe ile tanımlanır, eğer% 100 örtüşme maksimum alan ayarlayın.
    6. 1.000 tekrarlara simülasyon aracı ayarlayın.
    7. Kutusunu işaretleyin "otomatik kaydetme hücreleri?" .rect Dosyaları (metin biçimi) olarak partinin her görüntünün tüm tekrarlar için simüle nesnelerin koordinatlarını kaydetmek için. Kutusunu işaretleyin "otomatik kaydetme görüntüleri?" Her simüle görüntü için bir .tiff dosyasını kaydetmek için. Kaydedilen dosyalar için ortak bir etiket girin.
       NOT: "? Kaydetme hücreleri" seçeneği gerçek simüle ima kaydederken karşılaştırıldığında, simülasyon çalışma süresini ve toplam veri boyutu azaltırges. .rect dosyaları dikdörtgen gibi simüle hücre koordinatları kaydetmek ve gerekirse daha iyi taklit edilmesini görüntü içine dönüştürülebilir.
11. "Çalıştır simülasyon" üzerine tıklayarak simülasyonu başlatın.
    NOT: simülasyon aracı otomatik olarak tekrarlanan simülasyonlar her set için, kırmızı, yeşil, mavi, ve stromal hücreler, kırmızı, yeşil ve mavi hücreler için ortalama temas sayısı ve civarı sayıları dahil olmak üzere her görüntünün 1.000 simülasyonları için bir .csv dosyası oluşturur . Ayrıca, tüm bu değerler için, standart sapma (STD) ve ortalama standart hata (SEM) ile 1.000 simülasyon ortalamaları verilmektedir.
12. Iletişim frekansları ve 1.000 simüle resimlerden biri dizi civarı frekansları ortalama belirleyin. Bunun için, görüntü başına kaydedilen hücre sayımı ile ortalama temas ve civarı sayıları bölmek. Kaydedilen görüntünün otomatik eş-lokalizasyon analiz sonuçlarına frekansları karşılaştırın.
13. Uygun Amerika Uygulaanalizi ¹⁹ bağlı STICAL yöntemler (Şekil 7, biz iki-kuyruklu Wilcoxon işaretli sıra testi kullanılır).

Representative Results

Kawamoto bant yöntemi ile undekalsifiye kemik cryosections Kesme diyafizinde gibi olan epifiz alanlarında hem de tüm kemik hala mineralize kemiğe bağlı endosteal bölgede kemik iliği, sağlam bir bölüm olarak kesilmesini sağlayan ve onların Trabeküler kemik yüksek yoğunluklu (Şekil 1). Bölümlerin Nükleer boyama hazırlanmasında küçük çatlaklar tam olarak önlenemez, ancak, sinüzoidler ve arterlerin yapısı yanı sıra parankim retiküler ağ bozulmadan kalır ortaya koymaktadır.

Bir kırmızı floresan kimerik kemik iliği bir immunofloresan boyama örnek ve sonraki analiz olarak, bir eozinofiller için boyama (majör temel protein, MBP), PC'ler (κ ve λ hafif zincir) ve B hücreleri (B220) gösterilir. Fareler şap ip tavuk γ globulin (NP-CGG) bağlanmış 100 ug 4-hidroksi-3-nitrofenilasetil hapten, 4 hafta sonra ile aşılanmıştırsulandırma, 21 gün sonra PBS iv NP-CGG 50 mikrogram ile artırdı ve boost gün sonra 30 analiz. otomatik bir görüntü analizi de retiküler işlemlerin çok küçük fragmanları da dahil olmak üzere, stromal yapıları çok hassas kabul edilmesine neden olmuştur. Stromal hücrelerin hücre sayısı, burada sunulan sistemi ile tespit edilemez yana görüntü tüm fragmanları tespit etmek için (Şekil 2), herhangi bir eşiği, stroma kanalı tanıtıldı (ayrıca bölümüne bakınız). PC'ler ve eozinofiller B hücreleri daha büyük ve aynı zamanda bir daha heterojen bir şekil gösterir. Her üç hücre tipleri de ilk bakışta kabul edilmiştir. Hücresel kümeleri ve özellikle B hücrelerinin, iyi ayrıldı. analiz aracı yukarıda belirtilen hücre tipleri (eozinofiller, PC'ler, B hücreleri) için optimize edilmiştir. Diğer hücre tipleri için ayarlamalar gerekebilir. Hücre iletişim aracı tarafından oluşturulan .csv dosyalarını hematopoetik hücreler için aşağıdaki ilgili ölçümler içerir:Her hücre popülasyonu için hücre sayımı; px her hücre popülasyonu için toplam alanı; iletişim (bu durumda eozinofillerde) kırmızı hücrelerin sayısı, yeşil hücreler (burada PC'ler) veya kırmızı, yeşil, mavi ya da gri hücreler (stromal hücreler) ile mavi hücreler (burada B hücreleri). Hücre civarı aracı tarafından oluşturulan .csv dosyalarını hematopoetik hücreler için aşağıdaki ölçümleri içerir: Her hücre popülasyonu için hücre sayımı; px her hücre popülasyonu için toplam alanı; kırmızı, yeşil, mavi, gri ve hücreler (stromal hücreler) ile kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin civarı sayısı.

Görüntü analiz araçları kalitesini doğrulamak için, otomatik analiz sonuçları 6 eğitimli değerlendiriciler (Şekil 3) bir el ile sayma ile karşılaştırılmıştır. Tüm değerlendiriciler analiz için aynı görüntü aldı. Stromal yapıları ve hematopoetik hücreler dikkatle bir görüntü analiz aracı ile özetlenen ve ilgi bu bölgeler kaydedilir ve analiz edildi. Stromal yapılar için, görüntünün başına toplam alanıOtomatik ve manuel analiz arasında karşılaştırıldı oldu. Eğitimli değerlendiriciler tam tanımak için elle sayılır (Şekil 3A) stroma toplam alanının boyutu için gözlenen büyük varyans tarafından yansıtılan stromal yapılar, zor görünüyordu. Burada, otomatik analiz eğitimli değerlendiriciler tarafından tespit ortalama alana yakın bir değer belirledi. El ile sayılmıştır bütün hücreler için, otomatik analiz aracı bir hücre biraz daha düşük bir miktarda tespit edilmiştir. Ancak, PC'ler ve eozinofiller için, sayı manuel sayımları için gözlemlenen arası varyans aralığında hala. otomatik analizi ile tespit B hücrelerinin sayısı, ancak, hafif bir şekilde aralığı (Şekil 3A), aşağıda idi. otomatik analizi ile tespit edildiği üzere ortalama hücre boyutu (px bölge) bilgisayarlar 512 piksel eozinofiller için 436 piksel, ve B hücreleri için 317 piksel eğitimli değerlendiriciler eozinofiller için bilgisayarlar 515 piksel, 464 piksel büyüklüğünde belirlenen süre ve B hücreleri için 291 piksel. Böylece, ortalama cB hücreleri, bilgisayarlar ve otomatik analizi ile tayin eozinofiller için ell boyutu kılavuzu gözlemcinin (Şekil 3B) tarafından belirlenen ortalama hücre boyutları ile karşılaştırılabilir olmuştur. Bu otomatik bir görüntü analiz aracı artık aday kemik iliği hücresi hücre tiplerinin doğrudan temas ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, belirli bir hücre tipi komşu stromal hücreler ve başka hematopoietik hücreler tip hücrelerin frekansı tespit edilebilir. Kemik iliği PC'ler ve kişilerine analizi hücrelerini, eozinofiller, B hücreleri stroma ve diğer PC'ler 10 ve 20 mikron (Şekil 4A) içinde bu hücre tipleri komşu bilgisayarların yanı sıra frekans gösterilir. Buna ek olarak, bir stroma, çeşitli hematopoietik hücre tipleri iletişim frekansları (Şekil 4B) ölçülebilir.

Simülasyon aracı ile bu hücrelerin rasgele kemik iliği konumlandırma bir simülasyon uygulamadan önce, bir Gaus hücre boyutu dağılımına açıklayan parametrelersian dağılımı tespit edilmesi gerekir. Simetrik ve "çan şekilli" bir eğri olarak görselleştirilebilen bir normal dağılım için, sadece iki parametre tespit edilmesi gerekmektedir: eğrinin en üst noktası bulunduğu eğrisi (konumundadır, yani, merkezi konumunu ) ve simetrik eğrinin genişliği (bu yukarıda belirtilen σ parametresi tarafından tarif edilmiştir). Bu prosedür PC'ler, eozinofil ve B hücreleri (Şekil 5B) için burada gösterilmiştir. Ölçülen hücre boyutu dağılımları B hücreleri için, σ tarif dağılım eğrisinin genişliği bilgisayarlar ve eozinofiller için daha küçük olduğunu göstermektedir. Px tanımlanan σ değerleri ise simülasyon için, üç hücre popülasyonları için ölçülen σ göreli değerleri, (yani, B hücreleri her zaman bir iki dar boyutu PC daha dağıtımı 've eozinofiller' simüle edilmiştir) muhafaza Kaydedilen hücrelerin görünümünü maç set (Şekil6B). Bu B hücreleri için 2 px bir σ ve PC'ler ve eozinofil hem de 4 px σ uygulamak için götürdü. hücre boyutu, kesme ölçülen hücre boyutu dağılımları belirlenmiştir. 17 piksel çapı giden 220 piksel bir kesim dairesel bir nesne (yaklaşık 7 um) ve B hücreleri için 20 piksel çapı elde edilen bilgisayarlar ve eozinofiller, 300 piksel nesnenin boyutu bir kesim, için (yaklaşık 6 um) kullanıldı simülasyonu için.

Hücreler simülasyon aracı tarafından yerleştirilen izin verilir simüle rastgele görüntüdeki alanları tanımlamak için, bir maske, bir kemik iliği histolojik görüntü (Şekil 6A) DAPI kanalında nükleer sinyaller elde edildi. Bir 10 değeri ikili görüntü (üst panel, sağ görüntü) oluşturmak için en uygun yoğunluk eşik değeri olduğu tespit edilmiştir. Otsu algoritması tarafından belirlenen eşik sabit yoğunluğu benzer, görüntüdeki tüm çekirdeklerin tam tanıma (üst panel, orta resim) yol açmaz50 veya 150 eşikleri (alt panel, sol ve orta resim) stromal hücreler (Şekil 4B) ile PC'ler, eozinofil, ya da B hücrelerinin kişileri .The alaka simülasyon aracı (Şekil 7) kullanılarak test edilmiştir. Bu analiz, bu popülasyonları destekleyen stromal niş kavramı doğrultusunda PC'ler ve B hücreleri (Şekil 7A) için simülasyon kıyasla kaydedilen görüntülerde daha yüksek temas oranları saptandı. Bu 5 ayrı floresan kimerik fareler (Şekil 7B, D) 'de teyit edilmiştir. Bunun aksine, herhangi bir belirgin bir fark eozinofil (Şekil 7A, C) halinde belirlenmiştir.

Kawamoto bandı yöntemi ile cryosectioned bir fare femur bir uzunlamasına kesit Şekil 1. Genel floresan görüntü. Bant yöntemi kestirme sağlardokunulmamış endosteal bölgesiyle g maddeleri, diyafiz hem de epifiz alanlarda undekalsifiye kemikten her ikisi de. Bir naif C57BL / 6 fare bir 7 mikron kalınlığında kemik bölümü arteriyollerin (yeşil) ve çekirdekler için (mavi, DAPI) görselleştirmek için Sca-1 için, hücre dışı matriks proteini laminin (kırmızı) için boyandı. 1446 x 1,088 mm 47 fayans, çözünürlük 1.360 x 1.024 piksel kaydedildi ve genel görüntü oluşturmak için dikişli edildi. Bu görüntü 10X objektif lens (0.45 NA) ile, bir geniş alan floresan mikroskop satın alındı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Stromal ve hematopoetik kemik iliği hücrelerinin Şekil 2. Otomatik algılama. Kırmızı floresan chi bir femur kemik bölümüboost gün sonra 30 meric fare stroma, MBP (kırmızı, eozinofiller), κ ve λ hafif zincir (yeşil, PC'ler) ve B220 (mavi, B hücreleri) görselleştirmek için RFP (gri) için boyandı. Sol: Orijinal görüntü 20X objektif lens (0.8 NA) ve 708,15 x 708,15 um bir görüş alanını kullanarak, bir konfokal mikroskop satın aldı. Sağ: Parçalı görüntü. tanınan nesnelerin özetliyor vurgulanır. beyaz dikdörtgenler alt görüntülerde gösterilen alanı işaretlemek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil eğitimli değerlendiriciler tarafından otomatik görüntü analizi 3. Doğrulama. (A), bir (stroma yapılar) stromal yapıları ve eğitimli değerlendiriciler tarafından sayılır hematopoietik hücrelerin toplam hücre adedindeki toplam alanı 10 Otomatik görüntü analizi ile elde edilen hücre sayıları ile karşılaştırıldığında (PC), iki (eozinofil) ve bir resim (B hücreleri). Noktalar münferit raters temsil etmektedir (n = 5-6). Çubuklar, ortalama değerler veya otomatik olarak tespit değerleri göstermektedir. Otomatik analizi ile belirlenen ortalama nesne boyuta göre elle sayıldı nesnelerin (B), Nesne büyüklüğü dağılımı. Çeşitli hücre tiplerinin farklı frekanslar için ortaya koymak üzere, kişisel bilgisayarlar, bir görüntüde iki ve B hücrelerinde, 10, eozinofilleri sayılmıştır. Nokta bireysel nesneleri temsil eder. Hatları ortalama gösterir. (C) eğitimli değerlendiriciler tarafından stromal yapıların Manuel özetleyen. Sol: Orijinal görüntü. Orta: manuel olarak analiz görüntü örnekleri. Sağ:. Otomatik analizi ile tespit stromal yapılar bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

"Şekil 4" src = "/ files / ftp_upload / 52.544 / 52544fig4highres.jpg" width = "700" />
Femoral kemik iliğinden PC'ler, eozinofiller B hücreleri ve stromal hücrelerin Şekil 4. Otomatik co-lokalizasyon analizi. (A) Sol: stromal yapıları, eozinofiller, B hücreleri ya da artırmak gün sonra 30 floresan kimerik farelerin diğer bilgisayarlar ile doğrudan temas halinde PC sıklığı. Orta ve sağ: 10 mikron civarında veya stromal yapıları, eozinofiller, B hücreleri veya diğer PC'ler 20 mikron civarında PC'ler sıklığı. Bu rakam (doğrudan temas, 10 mikron civarı) bölümleri. Zehentmeier ark değiştirilmiş stromal yapıları ile doğrudan temas PC'ler, eozinofiller ve B hücrelerinin ⁹ (B) Frekans vardır. 52-515 PC'ler, 918-3179 eozinofiller, 10-21 görüntüleri 4.146-13.063 B hücreleri, iki bağımsız deneyden elde edilen, boost gün sonra 30 5 floresan kimerik farelerden sayıldı. Noktalar münferit faresini temsil etmektedir. Hatları medyan göstermektedir.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Kemik iliği PC'ler, eozinofiller ve B hücrelerinin hücre boyutu dağılımı 5. belirlenmesi Şekil. Simülasyon aracının grafiksel kullanıcı arayüzü (GUI) (A) ekran görüntüsü. (Yeşil κ ve λ hafif zincir) PC'ler (B) hücre boyutu dağılımı (px alan), eozinofiller (MBP, kırmızı) ve B hücreleri Volocity yazılımı (üst panel) ile nesne tanıma sonra ölçülen (B220, mavi) histogramlarda gösterilir. Femur kemik iliği görüntüleri (alt panel), PC'ler (sarı kaplaması), sarı, mavi (bindirme mor) eozinofil ve B hücreleri (gri kaplaması) kırmızı olarak işaretlenmiştir algıladı. Görüntü segmentasyonu, PC'ler için 180 px minimum boyutu eşiğini ayarlayarak yapıldıEozinofiller için 300 piksel ve B hücreleri için 220 piksel. 250 nesneler, PC için eozinofiller için 650 nesneler ve B hücreleri için 3.000 nesneleri ölçüldü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Simüle rastgele hücre konumlandırma için maske 6. Üretimi Şekil. (A) çeşitli eşik uygulanmasıyla üretilmektedir ikili görüntüler ile DAPI orijinal DAPI kanalı (sarı) gibi kaplamalar gösterilmiştir. ikili görüntüde (eşik 10 set) üretilen maske (alt panel, sağ resim) altında görüntülenir. Siyah alanlar no-go alanları temsil, beyaz alanlar (B). Kaydedildi görüntü hücreleri yerleştirilmek üzere izin verilen alanları temsil (solda) ve ilgili simüle görüntü (sağ) görsel yüksek göstermekbenzerlik. Eozinofiller (MBP), PC'ler (κ ve λlight zinciri), B hücreleri (B220) ve (RFP) görüntülenir stromal hücreler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Vs kaydedilen görüntülerde simüle stromal yapıları ile hematopoetik hücre tiplerinin Şekil 7. Doğrudan temas. Stromada ile doğrudan temas PC'ler, eozinofiller ve B hücrelerinin (A) Frekans artışı gün sonra 30 floresan kimerik farelerin kaydedilen görüntülere göre simüle. Hatları görüntüleri (nokta) simüle ve kaydedilen karşılık gelen connect. Temsili bir fare görüntüleri her arsa gösterilmiştir. Stroma ile doğrudan temas PC'ler, eozinofiller ve B hücrelerinin (B) Frekansları 5 kayıtlı görüntülere göre simüle iki bağımsız deneyin tek tek fareler. Wilcoxon rank testi, iki kuyruklu (PC'ler imzaladı: *** p = 0.0001; * p = 0,0371; * p = 0,0161; p = 0.0012 **; **** p <0.0001; eozinofiller: *** p = 0.0007 p = 0,1055; * p = 0,0161, p = 0,4143; *** p = 0.0007; B hücreleri: **** p <0.0001 ** p = 0.0020; *** p = 0.0005 ** p = 0.0012 ; **** p <0.0001). Nokta tek tek görüntüleri temsil eder. Çubuklar, ortalama göstermektedir. P değeri 0.05 anlamlı farklılıklar kabul edilir. Ns: rakamlar Yıldız aşağıdaki P değerleri gösterir p> 0.05; *: P = 0.05; **: P = 0.01; ***: P 0.001; ****: P 0.0001. Bu rakam (stromal yapıları ile bilgisayarların doğrudan temas) parçaları Zehentmeier ark değiştirilmiş. ⁹ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

700 "/>
. - Hematopoetik hücre için ölçüm yaklaşımının Şekil 8. Komple iş akışı fare kemik iliği stromal hücre etkileşimleri yaklaşımı üç ana bölüme ayrılır: 1. fare kemik iliği bölümleri hazırlanır ve ham veri lazer tarama konfokal mikroskopi, 2 ile toplanır . Kaydedilen görüntülerin otomatik analizi ve kemik iliği hücrelerinin rastgele konumlandırma simülasyon kaydedildi ve simüle görüntülerden elde edilen 3. kişi ve mahalle sayıları karşılaştırıldığında, yapılır. girdi (resim dosyaları) ve otomatik analiz çıktı (metin dosyası) mavi gösterilir, girişi (resim dosyaları) ve çıkış (metin dosyaları ve isteğe bağlı, görüntü dosyaları) simülasyon aracının yeşil gösterilir. tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Discussion

Modern optik görüntüleme yöntemleri ilerlemelere rağmen, histolojik verilerin analizi hala sık sık uygun ölçüm araçları ve yöntemleri, eksikliği veya ilgi küçük bir alanda odaklanmak önyargılı analizler tarafından engellenir. Burada sunulan sinerjik yaklaşım görüntü tüm kemik iliği bölgeyi kapsayan analiz, otomatik segmentasyon ve çeşitli hematopoetik ve stromal hücre tipleri, eş-lokalizasyon analizi nesne tanıma ve Yeni müşteriler tarafından sağlanan olmayan rastgele meydana kişileri nihayet bir doğrulama aracı birleştirir tasarlanmış simülasyon yazılımı.

Kemik iliği dahil olmak üzere tüm kemiklerin Histoloji nedeniyle bir bölümünde bulunan çeşitli doku yoğunlukları gerçekleştirmek için zor olmuştur - bir yandan çok zor, mineralize kemik üzerine, kolayca kesme bozulmakta, diğer yandan son derece kırılgan kemik iliği üzerinde birlikte kemik ile. Alternatif olarak, kemik bölümleri Pres kesme için bant yöntemi olaraktasyonlu burada ^14,15 ve böylece sağlam (Şekil 1) kemik içi alanları bırakarak, doku stabilize avantajına sahiptir. Osteoblastların zengin olmanın yanı sıra, bu alanlar, kök hücre bakımı ²⁰ bir rol oynadığı öne sürülmüştür.

gelişimsel süreçleri ve kemik iliğinde hücresel bakım stromal hücrelerin önemli rolü giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bununla birlikte, bu nadir ve kırılgan hücrelerin analizi, iki nedenden dolayı zor olduğu kanıtlanmıştır: İlk olarak, kemik iliğinden izole edilmesi zordur; İkinci stromal nüfusta heterojenliğin derecesi bilinmemektedir ve bu nedenle tek bir stroma hücreleri için tarif edilmiş olan bazı belirteçler kullanılarak, önemli bir nüfus kaçırma olabilir. Floresan kemik iliği şimeralar yaratılması için bir yöntem floresan işarete yararlıdır ve daha sonra, bir bütün olarak, kemik iliği stromal hücre popülasyonunu analiz etmek. Bununla birlikte, belirtilmelidir ki, bu MIKemik iliği ce tüm mezenkimal hücreler endotel hücreleri ve osteoblastlar dahil, görsel edilir. Bu gibi kimerik farelerin veriler incelendiğinde hesaba katılması gerekmektedir. Ayrıca, ışınlama kalan alıcı kökenli hematopoietik hücrelerin tehlikesi vardır olsa da bu hücreler, tipik haliyle, sadece bu şekilde, histolojik analiz ⁹ etkilemeyen verici CD45 ⁺ hücreleri ile karşılaştırıldığında görüş alanı başına çok küçük bir alanı kaplar. Açıktır ki, bu yöntem, stromal (alt) popülasyonlarının daha spesifik olarak saptanması ile daha sonraki bir aşamada birleştirilmelidir. Şu anda, bu hücrelerin analizi çoğunlukla aynı anda analiz edilebilir parametrelerin sayısına bir sınır empoze nedeniyle yukarıda belirtilen nedenlerle histoloji ile yapılır. Çok parametre gelişimi bu sınırları aşmak için yardımcı olacaktır mikroskopi analizi.

Görüntü analizi sırasında, segmentasyon, orijinal Otsu algoritması kullanılarak yapıldı. EsasenBu kümelenme tabanlı eşikleme yöntemi otomatik bir ikili görüntüde ¹⁷ sonuçlanan, belirli bir kanalda en istatistiki farklılık iki gruba ön planda (sinyal) ve arka plan (gürültü) piksel optimal ayrılması için yoğunluk eşiğini belirler. Burada, Otsu yöntemi orijinal görüntünün doğal logaritma versiyonuna tatbik edilmiştir, yani:

Otsu için giriş image = ln (Giriş görüntü)

Otsu yöntemi arka plan olarak loş hücreleri tespit edebilir çünkü bu floresan görüntüleri için daha iyi çalışır. Logaritmik fonksiyon ekleme Otsu algoritması iki farklı sınıfa daha iyi hücrelerin ayrılması ve arka plan için izin verir. Ancak, tek başına yoğunluk eşikleme tam tek nesneleri algılamak için yeterli değildir. Görüntülerde iyi ayrılmış nesneleri tespit zaman verimli çalışır, ancak kümeler içinde yer alan ayrı tek hücrelere yeterli değildir. Hücre tiplerinin bazı itibariyle buBu tür eozinofiller veya B hücreleri gibi, sık sık dokuda birlikte kümelenmiş, bizim için ilgi vardı, DAPI kanal onların çekirdekleri k = 10 ^21. The ile yoğunluğu histogram k-means kümeleme dayalı bir algoritma kullanılarak dilimli edildi Hücre segmentasyon algoritması (10 kutularına kümelenmiş) dimmest piksel parlak arsa ve sürekli hücre benzeyen nesnelerin oluşumu için bakacağız. Bu nesneler daha sonra hücreler olarak tanımlanacaktır. Tüm pikseller kullanıldığı zaman, elde edilen çekirdek daha sonra küme ayrılması için diğer kanallar için uygulanan bir maske oluşturmak için genişlemiştir.

Dolayı ara bağlantısı için bu analiz kompakt hematopoietik hücreler için uygun olduğu, ancak bu büyük, yayılmış hücre sınırlarını belirlemek mümkün değildir olduğu gibi, stromal hücreler ile ilgili olarak sınırlı olduğunu belirtmek gerekir onların Bir retiküler ağ oluşturmak dendritik uzantıları. Bu durumda, hücre, stromal hücreleri için önemli olansağlanamaz. Stroma özgü promoterlerin kontrolü altında kaderi eşleme muhabir ile tek hücrelerin etiketlenmesi lenf düğümlerinde ve foliküler dendritik hücrelerin etiketlenmesi için ("Brainbow" sistemi ²² kullanılarak) nöronlar için yayınlanmış olana göre, bu sorunu çözmek ^23.

30 piksel aşağıdaki nesneler hariç tüm kanallar için bir noyz düşürme adımı uygulanması ek olarak, boyut dışlama hematopoietik nesne tanıma sürecinde olan ancak hücrelerin stroma değildi. Hariç tutulabilir kesit tarafından kesildi hücrelerin Küçük parçaları; Bununla birlikte, zarar hücre kesin bir tanıma lehine bu durumda ihmal edilebilir. Iki üç boyutlarından analiz ve simülasyon uzanan bu sınırlamanın üstesinden gelecektir. yöntemlerinin geliştirilmesi kesinlikle th yardımcı olacak, çok foton mikroskopi veya hafif levha mikroskopisi / SPIM örn bütün bağlar hücresel dağılımı, çalışmasaygıdır. Çok bileşenli alanlarıyla kompleks hücre bileşimini incelemek için, aynı zamanda, in situ analiz edilmektedir parametre sayısının artırılması gerekli hale gelir. Sitometrik miktar ile kombinasyon halinde histolojik bilgilerin çok parametreli analizi için ümit ^{verici, 25} son ²⁴ yayınlanmıştır.

iletişim analizi iki nesne örtüşme miktarının gerçekleştirildi. Doğrudan temas, en az bir pikselin bir örtüşme olarak tanımlandı. Önemli olarak, bu analiz, mikroskop görüntü çözünürlüğü ile sınırlıdır ve bu nedenle mikroskop kullanılır objektif merceğinin sayısal açıklığı ve iğne deliği boyutu, hem de dalga boyu ve uyarma moduna bağlıdır. Burada gösterilen analizde, florokrom kombinasyonları ile 0.8 NA, 20X objektif 488, 561, 594 ile heyecanlı ve bir foton uyarma kullanarak 633 nm uygulandı. Bu nedenle, yanal çözünürlük arasında değerleri0.372 ve 0.483 mikron elde edildi. Bu iddialar, çeşitli hücre alt yan yana hakkında yapılmasını sağlar; Ancak, hücresel etkileşimleri dahil varsayılan moleküler mekanizmaları hakkında herhangi bir bilgi vermemektedir. Ek olarak, 2-foton intravital mikroskobiyle gibi diğer yöntemler, bu hücreler arası kontaklar ⁹ karakterize etmek için gereklidir. Bu etkileşimler ²⁶ aslında fonksiyonel olup olmadığını Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı sistemler onaylamak için yardımcı olabilir.

Doku nişler hücresel mikroçevreyi değerlendirmek amacıyla, doğrudan hücre kişileri analiz etmek, ama aynı zamanda belli bir ilgi hücre tipi ("civarı analizi") Mahallesi'nde hücre tipleri ölçmek için değil, sadece çok önemlidir. Daha önce böyle bir çekirdeğin ²⁷ pozisyonuna göre gemilerin olarak hücreleri ve doku yapıları arasındaki mesafeleri ölçüldü çalışmalar yayınlandı. Biz determin ilgilenmişlerdir yanasitoplazmik hacme nükleer değişen oranları ile kısmen çeşitli hücre tiplerinin mesafe uygulayarak, yüzey arasındaki mesafeyi ölçmek için tercih edilir. Bu amaçla, px um değerleri dönüştürme sonra cell's sınırından Öklid mesafe belirleyerek civarı çapındaki hesaplanmıştır. Öklid mesafesi iki piksel ve formül ²⁸ ile tarif edilebilir arasındaki doğrusal mesafe:

Örneğin bir Öklid mesafesi, hedef hücrenin sınırlarının piksel 10 um içinde kendi sınırları piksel hücreler bu hücre komşu olarak sayıldı.

Şu anki haliyle, analiz sadece bir hücre temas veya bu nedenle sadece bir ikili EVET / HAYIR karakterizasyonu sağlayan, aynı ya da farklı türde başka bir hücre tarafından yaklaştı belirler. Hücrenin gerçek sayısıBunun belli bir yarıçap içinde ilgi hücre başvurun ya da olan lar hesaplanmaz. Bir sonraki adım, temas veya hücreleri komşu grup büyüklüğü tespit ve aynı tip farklı hedef hücreleri arasında mukayese edilebilir şekilde güncel analiz genişletmek olacaktır. Bu tür hematopoetik aksesuar hücrelerin değişen katkısı ^29-33 tartışılan edildiği için kemik iliği plazma hücreleri için hayatta kalma niş, kemik iliği nişler, bileşimi hakkında önemli ek bilgi sağlayacaktır.

nesne tanıma algoritmaları Wimasis uzmanları kendi ticari olarak temin özel çözüm hizmeti kullanılarak ve istek üzerine temin edilir ile birlikte optimize edilmiştir. Başka bir seçenek de Definiens, Volocity veya IMARIS veya CellProfiler gibi ücretsiz olarak görüntü analizi için, ticari olarak temin edilebilen yazılımı ya da kullanılmasıdır.

otomatik hücre segmentasyon ve görüntü analiz araçları biziki parametre, yani nesnenin boyutuna ve çeşitli hücre popülasyonunda hücre sayısına göre 6 eğitimli değerlendiriciler tarafından sağlanan görüntü manuel olarak analiz verileri ile sonuçları karşılaştırarak geçerli yeniden. Şekil 3B'de, hematopoietik hücreler (PC, eozinofiller ve B hücreleri) için ortalama nesne boyut olarak gösterildiği gibi, onların daha düzensiz bir şekle kıyasla muhtemelen nedeniyle, plazma hücreleri ve eosinofiller için el ile boyut tayini için daha yüksek bir varyans ile, her iki yöntem arasındaki benzerlik B hücrelerine. hücre sayıları otomatik algılama elle tespit olanlardan biraz daha düşük değerler vermiştir. Bu B hücrelerinin durumunda bu değerlerin altında iken Özellikle, bunlar muhtemelen bir marker olarak kullanılmıştır B220 ifadesinin yüksek bir heterojen için, eozinofiller ve PC'lerde durumunda manuel değerler aralığında hala B hücreleri için. B220 yukarı regüle kemik iliği B hücresi farklılaşması sırasında olduğu bilinmektedir, ve B düşük olan hücreler yanı sıra yüksek ıB220 için ntensity boyama gözlenebilir. Düşük B220 sinyalleri ile B hücreleri erken evre B hücrelerinin dışlanmaya yol açmış olabilir uygulanan eşik, altına düştü. Otomatik algılama için bir alt eşik bu sorunu çözebilir. Dolayı daha az kompakt, daha dendritik için tespit zor stromal hücreler, ve gergin-out morfolojisi için, manuel algılama bireysel dereceleyiciler arasında yüksek sapmaların sonuçlandı. İlginçtir, stroma ortalama toplam alanı analizi de değerlendiriciler tarafından bireysel önyargı telafi etmek için uygun olduğunu belirten, otomatik olarak belirlenen toplam alana eşit oldu. Birlikte ele alındığında, bu veriler otomatik sonuçlar genellikle manuel analizlerin ortalama değerleri temsil ve iyi analiz arası değişkenliği azaltmak için uygun olduğunu göstermektedir.

Dokunun yapısal kısıtlamalar içindeki hücrelerin rastgele ve rastlantısal olmayan konumlandırma ayırt etmek amacıyla, bir simülasyon aracı geliştirilmiştir. Dursimülasyon ing, rastgele yerleştirilmiş hematopoetik hücreleri yapay bir görüntü kaydedilen her kemik iliği histolojik görüntü için oluşturulur. İlk olarak, stroma kanal görüntü orijinal biçiminde kullanılmaktadır. Bir maske, böylece ikili biçime görüntü dönüştürme, sabit yoğunluk tabanlı eşiği uygulayarak DAPI görüntü elde edilir; ikili maske sonra piksel tabanlı dilatasyon ve erozyon birden adımları uğrar. Maske simüle hücreler yerleştirilmek üzere izin görüntü alanında alanları tanımlar. simüle hücrelerinin merkezlerinin koordinatları muntazam bir rasgele sayı üreteci tarafından temin edilmiştir sınırları olan görüntü boyutu ile tespit yerlerde. Kaydedilen görüntülerin otomatik resim analizi ile belirlenen her topluluğu için hücre sayısı ve ortalama hücre boyutu hakkında bilgi simüle hematopoietik hücre popülasyonları tanımlamak için kullanılır. simüle hücre çapı tek boyutlu bir Gauss dağılımı gösterdiği kabul edilmektedir ki bu gerçek gelenHücre çapı rastgele seçilir: izin verilen minimum nesne boyutu için hücre boyutu cut-off tanıtıldı böylece çapı daha sonra değiştirilmiş. Halinde simüle hücre, bir veya daha fazla piksel bir No alanı ile üst üste ya da başka önceden yerleştirilmiş hücre (kaydedilen görüntüleri belirlenen merkezden merkeze 4 um), yeni bir rasgele koordinatları ile ilgili önceden belirlenmiş bir mesafede olacak şekilde konumlanır çap dokunulmaz iken seçilecektir. Simüle hücre sayısı kaydedilen görüntüde hücrelerinin sayısına eşittir kadar bu tekrarlanır.

aracı stromal yapılar doku içinde bir sabit matris olarak hareket ederken hematopoetik hücreler, kemik iliği içinde serbestçe yerleştirilmiş olabilir varsayımına dayanıyordu. aracı parankim alanları sinüzoidler karmaşık bir sistem ile geçti kemik iliğinde duruma optimize edilmiştir. Benzer bir modelleme yaklaşımı son zamanlarda amacıyla Frenette ve işçiler tarafından yayınlandıToplam Femoral Kemik iliği hacmi ²⁵ yaklaşık% 30 oluşturan hücreleri ve vasküler yapılar ile ilişkili olarak hematopoietik kök hücrelerin konumlandırma analiz eder. Bu etki için uygun hale getirmek için, burada sunulan bir simülasyon aletidir alanlarında maskesi dayanır hücrelerin yerleştirilmesi izin edildi. Bu çekirdekleri temsil nesneler 5-adım dilatasyon ile genişletilmiş edildiği bir nükleer leke görüntü kullanılarak elde edilmiştir İkiye sonra (Şekil 6). Düşük hücresel yoğunluk, yani, böyle bir kemik ve sinüzoidlerin gibi çekirdeklerin düşük yoğunluklu, sahip alanlar maske katkıda bulunmak ve bu nedenle alanları no-go olmayacak. Dilatasyon prosedürü bu no-go alanların yapay azalma önlemek için, 5-adım erozyonu dolayısıyla alanlar değişmeden (dolayısıyla "izin") yüksek yoğunluklu nükleer terk ederken, büyük dışlama alanları yeniden açılması, daha sonra uygulandı. Bu yöntem, kolaylıkla diğer lenfoid organlar için adapte edilebilir. T olanlardakonular gibi sitoplazmik etiketleme gibi diğer yöntemler maske oluşturmak için kullanılabilir, (yüksek sitoplazma / çekirdek oranı ile hücrelerin mevcut olduğu bölgelerde, örneğin) bu yöntem işe yaramayabilir vardı.

Hematopoietik hücreler ve büyüklüğü her bir hücre tipi hesaplanan ortalama çapı kabul ortalama olan bir Gauss rastgele sayı üreteci kullanılarak belirlenmiştir dairesel bir nesne olarak temsil edildi. dağıtım genişliği, bir görüntü analizi yazılımı ile belirlenen kaydedilen görüntülerin ölçülen hücre boyutu dağılımları dayanıyordu. Her hücre tipi için ölçülen hücre boyutu dağılımları tespit küçük hücresel parçaları otomatik görüntü analizi hariç olduğunu dikkate almak amacıyla, hücre boyutu kesme-off tanıtıldı (Şekil 5).

Doğal olarak, bu boyut ve şeklinin nispeten tek biçimli ancak hücrelerin bir halinde sorunlara neden olabilir hücre tipleri için çalışırBu parametrelere göre oldukça heterojen yeniden. Bu analizi, normal yaklaşık yuvarlak bir şekil sahip olması özelliğine sahiptir, kemik iliği (granülositler, hematopoietik projenitörlerinin ve limfositler) önemli hematopoietik hücre tipleri için optimize edildiği hususu not edilmelidir. Bununla birlikte, bu yöntem, dendritik hücreler ya da makrofajlar, güçlü, düzensiz hücre yapıları ile hücre tipleri için test edilmemiştir. Analiz tür hücreler geliştirilmiş hücre küme ayırma algoritmaları ²⁴ yanı sıra ayrıntılı şekil analiz ve sadece farklı büyüklükte ama aynı zamanda farklı şekilli hücrelerin simülasyonu için ihtiyacı da dahil olmak üzere, bizim otomatik görüntü analizi yanı sıra simülasyon yaklaşımı yeni zorluklar sunacak. Bir alternatif kaydedilen kesin şekiller ile çalışan bir simülasyon yaklaşım olacaktır. Bununla birlikte, bu yöntemin önemli model sisteminin belirleyici davranışı geliştirmek edebileceğine işaret edilmelidir.

Simüle deneyimlerini içindeney * yapılan örneğin, her kaydedilen görüntü için simülasyon 1.000 tekrarları üretildi. Bu birçok tekrarlar kullanarak yaklaşık% 3 simülasyon sürecin kendisi katkıda bağıl hata azaltacaktır. Hücre-hücre ko-lokalizasyon değerleri rastgeledir simülasyonlar hesaplanır Şöyle ki, eğer daha sonra simülasyon işleminin kendisi, N, görüntünün her simülasyonları sayısı, bir N ^-1/2 hata fonksiyonu ile karakterize edilir. Bu ölçülen eş-lokalizasyon değerlerinin birikmiş hata simülasyon süreci kendisi katkıdır. Böylece, N = 1,000 için katkıda hata 3.16% 'dir. Yalnızca .jpeg veya .tiff formatında .rect dosyaları olarak simüle görüntüleri (basit bir metin biçimi) ziyade fiili görüntüleri (yazılım ayrıca bir seçenek kaydederken Burada gösterilen simülasyonlar 1,000 tekrardan başına görüntü başına 60 dakika 20 için koştu ).

Birlikte ele alındığında, bu yaklaşım histolojik görüntünün bir tarafsız, yüksek verimlilik analizi için izin verirs ve istatistiksel ilgili verilerin oluşturulmasını sağlar. Bu, farklı koşullar altında hücresel lokalizasyonunu karşılaştırılmasında yararlı olabilir. Ayrıca, ileride zamansal bileşeni, örneğin kemik iliği, çeşitli hücre tiplerinin hareketleri üzerinde daha çok veri, kemik iliği hücre hareketleri modelleme yaklaşımı entegre edilebilir hale gelir. Bu yöntem, daha sonra dolaşıma kemik iliği hücrelerinin harekete geçirilmesi, örneğin, akut enflamasyon ³⁴ durumunda nötrofiller gibi sistem, bozulmaları simüle etmek için kullanılabilir. Ayrıca bağışıklık hücreleri bellek için bir depolama yeri olarak kemik iliği fonksiyonunu aydınlatmak için, bir de hayatta kalma faktörleri için rekabet modeli için uzanan hayal edebilirsiniz. Aynı zamanda, farklı niş arasındaki olası çapraz-karışma ele yanı sıra niş indüksiyonu edilebilir. Birlikte, bu fizyolojik değişiklikleri anlamak için yardımcı olacaktır w (örneğin, kök hücrelerin rejeneratif davranış için tetikler)ell otoimmün hastalıklar, neoplaziler, ya da akut iltihap durumunda, örneğin bir bütün olarak sistemin patolojik düzensizlikler gibi. Deney ve modelleme yinelemeli bir kavram bir parçası olarak, yeni hipotez, bu da yine deneysel olarak test edilebilir simülasyonlar göre üretilebilir ve böylece daha fazla doku karmaşıklığına olan çeşitli hücre tiplerinin fonksiyonu ve etkileşimi anlamaya yardımcı olur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).