A Time Differential farvningsteknik Kombineret med Full Bilateral Gill Denervation til Uddannelse Ionocytes i Fish

Abstract

Branchialfodder ionocytes (ICS) er de funktionelle enheder til ionisk regulering i fisk. Hos voksne er de fundet på filamental og lamellar epiteler af gælle hvor de transporterer ioner, såsom Na ^+, Cl ^- og Ca ²⁺ via en række forskellige ionkanaler, pumper og vekslere. Den teleost gill er extrinsically innerveret af ansigtet (VI), glossopharyngeal (IX) og vagus (X) nerver. De IX og X nerver er også den ydre kilde til branchial IC innervation. Her er to teknikker, der anvendes til at studere innervation, proliferation og distribution af IC'er beskrevet: en tidsforskel farvningsteknik og en fuld bilateral gill denervering teknik. Kort fortalt guldfisk udsat for en vital mitokondrie-specifikke farvestof (f.eks MitoTracker Rød) som etiketter (rød fluorescens) allerede eksisterende ICS. Fisk blev enten lov til at komme for 3-5 dage, eller umiddelbart gennemgik en komplet bilateral gælle denervering. Efter 3-5 dages restitution, det gdårligdomme er høstet og fastsat for immunhistokemi. Vævet derefter farvet med en α-5 primære antistof (mål Na ⁺ / K ⁺ ATPase, der indeholder celler), sammenholdt med et sekundært antistof, som mærker alle (både nye og eksisterende) IC'er grøn. Ved hjælp af konfokal billedbehandling, blev det påvist, at allerede eksisterende IC'er synes gul (mærket med både en levedygtig mitokondrie-specifik farvestof og α-5) og nye IC'er fremtræder grønt (mærket med α-5 kun). Begge teknikker, der anvendes i tandem kan anvendes til at studere innervation, proliferation og distribution af IC'er på gill filament når fiskene udsættes for miljømæssige udfordringer.

Introduction

ICs er den funktionelle enhed for ionisk regulering i fisk og findes på de epiteliale overflader af gill filamenter og lameller ^4,6-8,10. Selv om en række forskellige undertyper er blevet beskrevet, der besidder unikke egenskaber, mange af IC'er er karakteriseret ved en høj tæthed af mitokondrier (således de er også kendt som mitochondriet-rige celler) og / eller en overflod af enzymet Na ⁺ / K ⁺ ATPase (NKA). Typisk er disse ICs hus en række andre pumper, ionkanaler og vekslere involveret i ion regulering (fx Na ⁺ / H ⁺ varmeveksler, Na ⁺ / Cl ^- co-transporter, H ⁺ pumpe) ^2,10,11. Omfordelingen og spredning af IC'er som kompenserende mekanisme er centralt for at opretholde ion homeostase især under ionisk stress (fx udsættelse for ion-fattige vand) ^4,8,9.

Denne undersøgelse beskriver en tidsforskel farvning technique ¹ for at identificere nye prolifererede ionocytes (ICS) i fisk gæller. Denne teknik er kombineret med en komplet bilateral denervering af garn buer. Goldfish (Carassius auratus), de arter, der anvendes i disse undersøgelser, er velegnet til at studere proliferation Gill epitelceller, fordi de har en bemærkelsesværdig evne til strukturelt remodel deres gæller ^2. Gill remodeling refererer til vækst eller tilbagetrækning af en interlamellære cellemasse (ILCM), når fisk (normalt holdes ved 15 - 30 ° C) er akklimatiseret til koldt vand (<15 ° C) eller hypoxi, henholdsvis ^3. Tidligere undersøgelser under anvendelse af den tid forskellen farvningsteknik på guldfisk har fokuseret på omfordeling innervation og proliferation af IC'er på gill i forbindelse med gill remodeling ^4,5. Katoh og Kaneko ¹ udviklet denne ny teknik til at studere omdannelsen og udskiftning Branchialfodder IC'er i killifish (Fundulus heteroclitus) overfrred fra havvand (SW) til ferskvand (FW). I denne undersøgelse er der fokus på spredning og innervation af IC'er i guldfisk akklimatiseret til 25 ° C.

Brug den tid, forskellen farvningsteknik blev det vist, at i forbindelse med gill remodeling, guldfisk opretholde et konstant antal IC'er under hypoxisk eksponering og efterfølgende normoxisk opsving dog procentdelen af innerverede celler faldt hele normoxisk restitutionsperiode ^5. Det blev foreslået mere end 70 år siden, at ioniske optagelsesmekanismer i fisk er under neural kontrol ^12. Den teleost gill er innerveret af ansigtets (VII), glossopharyngeal (IX) og vagus (X) nerver også kaldet de "Branchialfodder nerver" ^13,14. Undersøgelser foretaget af Jonz og sygeplejerske (2003) på zebrafisk (Danio rerio) gælle innervation viste, at oprindelsen af innervation er ydre (celle krop nerve fiber ydre til gælle) samt iboende (celle kropnerve fiber er uløseligt forbundet med den gælle). De samme forfattere viste også, at Branchialfodder ICs extrinsically er innerverede ^7.

I denne undersøgelse blev den tid forskellen farvning teknik kombineret med fuld bilateral gælle denervering anvendt til at undersøge udbredelsen af ​​IC'er mangler ydre innervation i guldfisk. Fuld bilateral gælle denervering refererer til adskillelse kranienerver IX og X. Disse to tilgange er mulige i guldfisk, fordi deres relativt store størrelse (30-200 g) forenkler den fine kirurgiske procedurer, og ionocytes let identificeres ved hjælp af standard immuno-histokemiske teknikker. I den foreliggende undersøgelse blev ICs visualiseret ved anvendelse af en vital mitokondrie-farvestof (f.eks MitoTracker Red) eller et primært antistof mod α-underenheden af Na ⁺ / K ⁺ -ATPase (α-5; Developmental Studies Hybridoma Bank, University Iowa, Iowa City IA). Denne protokol giver en ligefrem method visualisere og analysere omfordeling og spredning af IC'er på fisk gælle.

Protocol

Begge protokoller var i overensstemmelse med retningslinjerne fra den canadiske Rådet for Animal Care (CCAC) og blev udført med godkendelse af University of Ottawa Animal Care Komité (Protokol BL-226).

1. tidsforskel farvningsteknik: Mitochondrion-rige farvebad

1. Forbered 1 mM MitoTracker Red stamopløsning ved at opløse 50 ug i 94,0 pi dimethylsulfoxid (100% DMSO). Hold stamopløsning i mørke ved -20 ° C, når den ikke er i brug. Undgå fryse / optøningscykler.
2. Forbered mørke kasser (3 - 6 kasser) med en maksimal volumen på 600 ml. Fyld kasserne med 400 ml systemets vand (vand fiskene afholdes normalt i) og placere en luft sten i hver boks for at give en kilde til O _2. Opnå guldfisk (30-40 g) og placere dem i kasser med 400 ml vand og en luft sten. Efter 30 min, tilsæt levedygtig mitochondriet-rige farvestof til opnåelse af slutkoncentrationer på 0,1 pM og 0,01% DMSO. Bade fiskene i 4 timerr.
   1. Hvis disse er kontrol fisk (dvs. ingen denervering), tænde for vandstrømmen til kasserne, tillade farvestoffet til at skylle ud og inddrive fisk til det tidsrum tildelt i protokollen. Fisk er typisk genvindes til 3-5 dage.
3. Efter tilbagebetalingsperioden videre til Afsnit 3: Time Differential farvningsteknik: Immunohistokemi. Hvis disse fisk, skal denerverede videre til Afsnit 2: Fuld Bilateral Denervation Procedure.

2. Fuld Bilateral Denervation Procedure

1. Få 1 par studerende Vannas foråret saks (buet), 1 par standardmønster tang-straight, 1 par standardmønster tang-buede, 2 par No. 5 pincet, 1 par væv retraktorer, små vatkugler (1 - 2 mm i diameter), og vatpinde (Q tips eller tilsvarende).
2. Forbered bedøvelsesmiddel vandbad. Først opløses 10 g benzocain til et endeligt volumen på 100 ml99% ethanol for at fremstille en stamopløsning. For at forberede den bedøvende vandbad opløses 15 ml af bestanden benzocain opløsningen i 30 L af luftet systemet vand ved den ønskede temperatur. Luftes vand ved at placere en luft-sten forbundet til en luftpumpe eller en central air-line i vandbeholderen.
   1. Placer fisk i bedøvelsesmidlet vandbad (figur 1A).
   2. Når vejrtrækningen er ophørt, skal du placere fisk på en operation tabel og intubere det som vist i figur 1B. Gør dette ved at indsætte et rør i mundhulen at overrisle gæller med beluftet bedøvelsesmiddel løsning. Vanding af gællerne sikrer, at fiskene leveres med en tilstrækkelig mængde af O ₂ og bedøvelsesmiddel under denervering procedure. Placer fisk, så at hovedet er vippet lidt nedad. Dette giver mulighed for bedre adgang til området bag den fjerde gælle arch.
3. Løft forsigtigt Laag med de lige standardmønster pincetog placere væv retraktorer mellem operculum og indersiden af ​​hovedet. Åbn forsigtigt væv retraktorer at holde Laag væk fra hovedet og holde gællerne udsatte.
4. Sørg for, at bedøvende løsning vanding gællerne under denne procedure. Hvil retraktoren håndterer siden af ​​hovedet, som giver adgang til alle fire gælle buer.
5. Placer de buede standardmønster pincet mellem fjerde gælle bue og bagsiden af ​​hovedet og forsigtigt åbne dem for at skabe spænding i ledbånd fastgørelse af fjerde gælle bue til hovedet. Med et par No. 5 pincet skabe en lille åbning (2 - 3 mm) ved at gennembore epitelet forbinder dorsale ende af garn buer til opercular hulrum. Pas på ikke at gå for dybt, fordi der er risiko for at beskadige et større blodkar.
6. Med en lille vat afholdt med Nr 5 pincet langsomt og forsigtigt udvide snit for at blotlægge IX (glossopharyngeal) og X (vagus) nerver. Gratis dennerver fra enhver bindevæv ved hjælp No. 5 pincet, igen pas på ikke at beskadige blodkar.
   BEMÆRK: branchial IX og X nerver i guldfisk hvile dybt bag den fjerde gælle bue og er i nærhed til de store blodkar indføring i gælle buer.
7. Når nerverne er blevet identificeret brug de buede foråret saks til forsigtigt skære nerverne, mens du holder snittet åbent med de buede standardform pincet. Efter overskæring nerverne, forsigtigt trække de buede pincet. Der er ingen grund til at lukke snittet med suturer fordi epitelet er meget tynd og snittet normalt lukker på eget inden 24-48 timer. Fjern vævssprededilatator.
8. Gentag samme procedure på den anden side af hovedet.
9. Skift vanding af gællerne fra bedøvelsesmiddel til frisk vand tilsat kulsyre at inddrive fisk fra anæstesi. Når opercular bevægelser har genoptaget flytte fisken i eksperimentelle tanke at komme sig i mindst 24 timer.

3. Time Differential farvningsteknik: Immunhistokemi

1. Først forberede 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x phosphatpufret saltvand (PBS; 4 g PFA i 96 ml PBS). PFA ikke opløses let i PBS ved stuetemperatur. Heat opløsning i et vandbad for at opløse PFA. Udfør denne i et stinkskab. Når PFA er i opløsning lad afkøle før brug. Opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.
2. Før euthanizing fisk og ekstrahere gill væv placere 3 - 4 ml 4% PFA i et scintillationshætteglas i alt 8 scintillationshætteglas (1 hætteglas pr gill arch). Desuden tager en lille vejer båd og fyld den med 1x PBS. Dette vil blive anvendt til at vaske vævet, efter at den er blevet udskåret. Hold alle løsninger på is.
3. Efter levedygtig mitochondriet-rige farvestof eksponeringeksperiment er færdig, aflive guldfisk ved at placere den i et vandbad med en overdosis af benzocain.
4. Brug stump pincet til at løfte operculum på den ene side af hovedet og krum saks for at afskære hver ende af branchial gill kurven. Pick forsigtigt gællerne ved de rode ved stump pincet og løfte dem ud af opercular hulrum. Vask straks gællerne i iskoldt 1x PBS for at fjerne overskydende benzocain og blod.
5. Placer udskårne gæller i separate hætteglas (et hætteglas til hver gælle bue) fyldt med 4% PFA og løse O / N ved 4 ° C.
6. Efter fiksering vaskes overskydende PFA i 1X PBS og placere vævet i en 2 ml bullet rør fyldt med 1,5 ml af 1% Triton-X på et rysteapparat i 6 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Dette trin permeabiliserer vævet. Hvis hele gill er for stor til at placere i en 2 ml rør skæres vævet i sektioner små nok til at passe røret pas på ikke at beskadige filamenterne.
   1. Forbered det primære antistof fortyndinger af Mifastsættelse 4 pi af stamopløsningen af ​​hvert primært antistof (i alt 8 pi) i 992 pi 1x PBS. Sørg for, at NKA (etiketter NKA-rige celler) og Zn-12 (etiketter neuroner) primære antistoffer er blevet rejst i den samme vært. Dette er vigtigt, hvis forskerne beslutter at identificere specifikke IC undertyper på samme tid, som de bliver nødt til at bruge primære og sekundære antistoffer i en anden værtsart.
   2. Fjern Triton-X-opløsning og uden vask vævet tilsættes en 1: 250 fortynding (fortyndet i 1 x PBS) af en NKA monoklonalt antistof (α-5) til påvisning af NKA-rige celler og et zebrafisk specifik neuronal antistof (Zn-12) at detektere nervefibre (primære antistoffer) og inkuber på et rysteapparat i 6 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C.
7. Vask det primære antistof 3 gange i 3 minutter med hver 1x PBS. For at gøre dette, skal du fjerne det primære antistof løsning fra røret ved sugning det ud ved hjælp af en pipette.
8. Forbered det sekundære antistof ved en1: 200 fortynding ved at blande 5 pi lager sekundært antistof i 995 pi 1x PBS. Anvend sekundært antistof (Alexa Fluor 488) og inkuberes i 6 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C på et rysteapparat.
   BEMÆRK: MitoTracker Rød er ophidset på en ~ 594 nm bølgelængde og vil fluorescerer rødt. Et sekundært antistof, der exciteres ved en ~ 488 nm og fluorescerer grønt skal anvendes til at mærke NKA og Zn-12 primære antistoffer.
9. Fjern overskydende sekundært antistof ved vask af vævet 3 gange i 5 minutter hver (som beskrevet i trin 3.7).

4. Imaging

1. Efter vask, montere væv på en konkav dias for hele mount konfokal billeddannelse af celler og nervefibre. For at montere væv, først placere den i en dråbe (200 pi) i 1x PBS på en flad objektglas. Dette sikrer, at væv ikke udtørre.
2. Adskil gælle hemibranchs med de buede mikro-saks. Placer en dråbe 1x PBS og en dråbe montering medier i en konkav dias.
3. Placer de adskilte hemibranchs i den konkave objektglas med forkanten af ​​filamentet opad og dække med et dækglas. Dup kanterne af dækglasset med neglelak for at forhindre dækglasset bevæge sig rundt og forskyde vævet. Lad væv at afregne til bunden af ​​den konkave slide for 10 - 15 minutter før billeddannelse.
4. For hver gælle bue, skal du vælge seks gælle filamenter tilfældigt til billeddannelse, der producerer seks billeder pr gælle arch. Brug konventionel konfokal mikroskopi til billede vævet ved at tage 1 - 3 um optiske skiver.
   BEMÆRK: allerede eksisterende celler vil blive mærket med MitoTracker Rød og positive for NKA vises kun gul. Celler, der kun vises røde er allerede eksisterende IC'er, der ikke indeholder NKA. Enhver nyligt spredt celle vil kun være positivt for NKA og vil kun blive vist grønt. Nervefibre vises også grønt.

5. billedanalyse for Ionocyte Kvantificering

1. For EACh gill glødetråd, som er blevet afbildet, kvantificere ICS og tilhørende innervation ved at rulle gennem dele af Z stakken og tælle antallet af lamelagtige og filamental IC'er til stede og om de nyligt er differentierede, præ-eksisterende, og / eller innerveret .
2. Kvantificere ICS pr fibres pr areal ^(mm2) af filamenter. Gør dette ved at bruge tegneværktøjerne forbundet med den software, der anvendes til at erhverve billederne for at skitsere lamellerne af glødetråden omfatter området af glødetråden, hvor ICS blev kvantificeret. De fleste konfokal imaging software-programmer har mulighed for at beregne arealet af en skitseret region på billedet. Brug indstilling i imaging software, som giver dig mulighed for at gøre dette til at erhverve området.
3. Opdel optalte IC'er af arealet beregnes af softwaren for at opnå et mål for ICs per arealenhed (fx pr mm ^2).

Representative Results

Figur 1 illustrerer operationen tabel oprettet (figur 1A), anbringelse af fisk under kirurgi (figur 1B), og de ​​tre vigtigste skridt for tidsforskel farvningsteknik (figur 1C). I trin 1, er fisken holdes i 30 minutter i et godt beluftet vandbad ved 25 ° C i mørke. I 30 min periode, kan forskeren forberede mitochondriet-rige farvestof alikvot i DMSO, der tilsættes til vandet under trin 2 (figur 1C). Inkubationstiden i trin 2 giver mulighed for optagelse af mitochondriet-rige farvestof fra vandet i mitochondriet-rige celler (dvs. ICS). Fisken kan så enten gennemgå den fulde bilateral denervering procedure eller en farce procedure, hvor fisken er bedøvet og gællelåg manipuleret, men nerverne forbliver intakte. Den blev oprettet i Trin 3 repræsenterer et opsving kammer forsynet med rindende vand for en fisk, der har eiTher gennemgået en fuldstændig bilateral denervering eller en "fingeret" procedure.

Efter tilbagebetalingsperioden blev fiskene aflivet, og gællerne blev udskåret og fikseret til immunhistokemi. Den samlede fordeling og innervation af IC'er på gill filamenter af en fisk, der havde gennemgået en "fingeret" procedure er afbildet i figur 2. ICS er til stede på filamental epitel samt på bunden af interlamellære regioner. Figur 2A viser allerede eksisterende IC'er mærket med mitokondrier-rige farvestof (dvs. fandtes disse ICs før denervering / sham procedurer blev udført). Figur 2B viser nervefibre innerverer de allerede eksisterende og nydannede IC'er (identificeret ved NKA immunoreaktivitet) i filamental og lamellar epitel. Endelig, sammenlægning af de to billeder (figur 2C) tydeligt afslører de allerede eksisterende IC'er (bliver gult) og de ​​nye ICS (fremtræder grønt).Figur 2D er en repræsentativ graf af IC kvantificering for den i figur 2A-C filament. På dette specifikke glødetråd, synes der at være et større antal nye prolifererede IC'er pr ^mm2 end allerede eksisterende IC'er (N = 1). For at fjerne kilden til ydre branchial innervation blev IX og X kranienerverne (extrinsic innervation) adskilles. Figur 3A viser den dorsale region af opercular hulrum efter gill filamenter og epitel dækker nerverne blev fjernet for at blotlægge IX og X kranienerverne (angivet med romertal), der spænder fra to store nerve kufferter til innerverer alle fire buer (figur 3A); de gælle buer er nummereret 1 til 4. Figur 3B-E illustrerer selektiv denervering af den første gælle arch. Den første gill arch innerveres af både IX og X kranienerverne (figur 3B), som kan fjernes uden at påvirke innervation til resten of de gælle buer (figur 3C-E). Fuld bilaterale denervering resulterer i gradvist tab af ydre innervation til gill filamenter (figur 4A-C). Kontrol fisk udviser en indlysende nerve bundt som spænder over længden af filamentet (figur 4A). Fuld bilateral denervering resulterede i et vist tab af ydre innervation efter 2 dages restitution (figur 4B). Yderligere forsvinden af ydre innervation blev bemærket efter 5 dages restitution fra denervering (figur 4C). Eventuelle resterende innervation til IC'er efter 5 dages restitution formentlig stammer fra nerverne med celle organer i gælle glødetråd (iboende innervation; figur 4C).

Figur 1. Eksperimentel oprettet for denervering procedure og sekvens af trin, der anvendes itidsforskel farvningsteknik. (A) Kirurgi tabel oprettet for denervering procedure viser bedøvelsesmiddel og inddrivelse tanke. (B) Eksempel på placering af en bedøvet, intuberet fisk. (C) trin, der anvendes i den tid, forskellen farvning teknik. I trin 1 er fisk anbragt i et temperaturstyret, statisk beluftet vandbad i 30 min. Mitochondriet-rige farvestof tilsættes i Trin 2 til en endelig koncentration på 0,1 uM og fisk får lov til at bade i opløsningen i mindst 4 timer. Vandgennemstrømningen genstartes i trin 3, på hvilket tidspunkt fisken gennemgår enten en fuld bilateral denervering af gill eller en farce kirurgi. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

/>
Figur 2. lysmikrografier repræsenterer tidsforskel farvningsteknik i en guldfisk (akklimatiseret til 25 ° C) 2 dage efter fuld bilateral denervering. (A) Fordelingen af allerede eksisterende ionocytes (ICS, pile). På en enkelt gælle glødetråd afsløres af mitokondrier-rige farvestof farvning (B) Fordelingen af ICS (nye og allerede eksisterende) og Branchialfodder nerver (stiplede pile) afsløres ved farvning med α-5 og Zn-12 antistoffer, henholdsvis. Pilene angiver IC'er (C) overlapning (A) og (B) skelner allerede eksisterende ICS. (Se gul, angivet med pilespidser) fra nyligt prolifererede ICS (fremtræder grønt, angivet med pile). Indsæt i (C) er en forstørrelse af en innerverede eksisterende ionocyte. (D) repræsentant graf over IC kvantificering for filamentet vist i paneler (AC). N = 1. Scale bar i panel (C) er 50 um og gælder for alle paneler./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. Repræsentative billeder skildrer forskellige stadier af gælle innervation. (A) Dorsal visning af mundhulen viser IX og X kranienerverne innerverer alle 4 Gill buer. Gill buer er nummereret 1-4. De gill filamenter og vævet dækker nerverne blev fjernet for bedre at visualisere innervation. (B) 1 ^{og 2.} gælle buer er adskilt for at afsløre den sanseorgan og grenene af IX og X kranienerver innerverer den ^1. gælle arch. (CE) Sekvens af billeder, der viser den selektive denervering af ^1. gill arch ved overskæring af grene af IX og X kranienerver. For en skematisk repræsentation af gill innervation af benfisk Se Figur 1 i Milsom et al ²⁶ De hvide linjer i billederne er vand refleksion fra mikroskop lys.; de ikke fastsætter nogen morfologiske struktur. Scale bar i panel (E) er 4 mm og gælder for alle paneler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4. lysmikrografier afbilder fordelingen og innervation af ionocytes på en enkelt glødetråd ^1. gill bue af en guldfisk akklimatiseret til 25 ° C. Ionocytes (angivet med pilespidser) blev farvet med α-5-antistof og nerver (angivet by pile) blev farvet med Zn-12-antistof. (A) Gill filamenter af en kontrol fisk, der udviser en central nerve bundt formentlig stammer fra IX og X nerver (ydre innervation) med omfattende lamellar forgrening. Nogle af ionocytes angivne også innerverede (insert). (B) A gill filament 2 dage efter fuld bilateral denervering. Der var en reduktion af den centrale nerve bundt mens lamellare innervation syntes stort set intakt. (C) A gælle glødetråd 5 dage efter fuld bilateral denervering der viser, at ydre innervation var stort set fraværende. Kvalitativ analyse tyder på, at fuld bilateral denervering forårsager nedbrydning af den ydre gill innervation samtidig opretholde nerver med celle organer i gælle glødetråd (iboende innervation) at skabe et netværk af nerver gennem tråden og ind i lamellerne. Venligstklik her for en større version af dette tal.

Discussion

Tiden forskellen farvning teknik kan være et nyttigt redskab til at forstå den dynamiske regulering af ion optagelse og undersøge den tidsmæssige omfordeling af IC'er i gælle epitel. Selv om en enkel procedure, er der en række centrale punkter, der er afgørende for succes i den tid, forskellen farvning teknik. Den guldfisk skal udsættes for mitochondriet-rige farvestof for tildelte tid i protokollen. Kortere eksponeringer vil resultere i dårlig optagelse af farvestoffet ved mitochondriet-rige celler (dvs. ionocytes). Under fiksering skal gælle væv udskæres hurtigt og holdt i mørke for at undgå foto blegning. Vævet skal behandles til billeddannelse inden for 2 uger fiksering. Under den bilaterale nerve sektionering procedure, at fiskene er godt bedøvede; nerver og blodkar er klart identificeret; og fiskene genoptager fuld opercular funktion, før den flyttes til en opsamlingstank.

"> Den FW miljø præsenterer fisk med den dobbelte udfordring at afbalancere passive ion tab og osmotisk vand gevinst ^14. Afvejningen af passive ion tab sker via den aktive optagelse af salt på tværs af ICS, som er lokaliseret til filamental og lamellær epitel, hvor de kan tage direkte kontakt med det eksterne miljø ^2,4,8,9,16. Men placeringen af IC'er på gælle er ikke statisk. I løbet af de sidste tre årtier en række undersøgelser har vist, at flere FW fiskearter, når de står med en ionisk og / eller temperatur udfordring omfordele Branchialfodder ICs fra fibres bunden af lamellen til de mere distale områder af lamellen ^{1,2,4,5,17-21.} En sådan omfordeling kan øge tykkelsen af lamellerne, som kan kompromittere gas overførsel (O _2, CO ₂₎ på tværs af gælle epitel ^22. Forskere har brugt tiden forskellen farvning teknikken beskrevet i dette manuskript at spore flytning og nødbelysnie af nye IC'er på gælle epitel under disse forskellige eksperimentelle betingelser (figur 1C) ^1,4,5.

Gællerne og formentlig Branchialfodder IC'er er innerveret af IX og X kranienerver ^7,23-25. Disse nerver bære både efferente og afferente input til og fra Gill, hhv. De er placeret på den dorsale side af mundhulen bag ^4. gill Arch. Tilgængeligheden af ​​nerver og den lethed, hvormed den bilaterale denervering procedure kan udføres, er artsspecifik. I ørred, for eksempel, den spidse og fladtrykte anatomi af hovedet tillader nerverne til at ligge i et enkelt plan bag ^4. gill arch under et tyndt lag af væv. Dette gør nerverne synlige og let tilgængelige for forskeren at udføre denervering procedure. I modsætning hertil guldfisk have en kortere snude og en rundere hoved. De IX og X kranienerver af guldfisk ligger dybere ind i dorsale side af hulrummet efter ^4. gill arch besætter forskellige planer. Denne orientering begrænser den lette adgang til nerverne og kræver en mere forsigtig tilgang til at identificere og adskille de relevante nerver. Formålet med denervering procedure er at fjerne sensorisk afferent og efferent input til og fra Gill, hhv. Denervering af garn buer kan også kobles med ionstrøm eksperimenter under anvendelse af radioisotoper (fx ²² Na). Disse teknikker kan anvendes i tandem til at studere bidraget af nervøs indgang på ion bevægelse på tværs af gill epitel. En anden begrænsning af denervering procedure er den manglende evne til at skelne mellem sensoriske og motoriske neuroner, således når overskæring af nerven bundt er det muligt, at begge typer innervation bliver fjernet. Overskæring eventuelle motoriske neuroner kan påvirke Gill og opercular bevægelse af fisken. Således ved udførelse garn denervering forsøg er det også vigtigt at overvåge ventilation efterfisk har genvundet fra proceduren for at sikre, at der er tilstrækkelig gælle bevægelse for både gas og ionbytning.

De i dette håndskrift brug voksne dyr protokoller blev ved en 00:12 lys: mørke-cyklus og fodret kommercielle foderpiller. Disse fremgangsmåder kan modificeres på flere måder. For det første kan tilbagebetalingsperioden efter mitokondrier-rige farvestof eksponering indstilles til kravene i forskerens protokol (f.eks, 1, 3, 5, eller 14 dage). Den længste periode med restitution efter mitokondrier-rige farvestof eksponering i laboratoriet har været 14 dage ^4,5. Der var ikke en signifikant fald i intensiteten af ​​fluorescensen af ​​mitochondriet-rige farvestof efter 14 dages restitution. For det andet er anvendelsen af ​​α-5 primære antistof begrænset til kun at identificere NKA-rige celler og skelner ikke mellem de forskellige undertyper af Branchialfodder ICS. Heldigvis i guldfisk blev det fastslået, at hovedparten af ​​ICS er begge mitochondrion-rige (etiket med MitoTracker) og NKA-rige (label med α-5) celler, som måske ikke er tilfældet i alle fiskearter ^4,27. Fremtidige forsøg kan fokusere på at følge tidsmæssige omfordeling af specifikke IC undertyper ved anvendelse af antistoffer rettet specifikt mod en række forskellige kanaler, pumper og vekslere (f.eks NHE, H ⁺ pumpe). Tidligere undersøgelser fandt, at størstedelen af ionocytes farvet med mitokondrier-rige farvestof udviser NKA immunoreaktivitet ^4. Innervation af IC'er kan detekteres ved anvendelse af et primært antistof mod zebrafisk-afledt neuron-specifikt antigen (Zn-12). I denne undersøgelse, α-5 og Zn-12 primære antistoffer blev påvist ved anvendelse af den samme sekundære antistof (Alexa Fluor 488) for begge. Denne begrænsning skyldes begge primære antistoffer blev rejst i en mus vært og overvindes ved, at der kan skelnes mellem NKA-rige celler og neuroner morfologisk selvom de fluorescerer samme farve. Sekventiel farvningmed forskellige sekundære antistoffer (f.eks første α-5 med Alexa Fluor 488 derefter zn-12 med Alexa Fluor 594) kan også anvendes til at eliminere problemet med begge markører fluorescerende samme farve. Endelig kan den fulde bilaterale nerve sektionering protokol modificeres til at målrette nerver til bestemte gælle buer. For eksempel kan selektiv nerve sektionering udføres på den første gill arch ved forsigtigt at adskille den første og anden gill buer at blotlægge nerver, der fører til den første gill arch på den dorsale ende af gill kurven (figur 2B-E). Den tid forskellen teknik kan også anvendes til at studere fordelingen af ​​ionocytes i larvestadiet zebrafisk fisk som de udvikler sig og ion transport overgange fra huden for gill.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MitoTracker Red	Life Technologies	M-7512
Dimethyl sulfoxide	Sigma Alrdich	D2650
α-5 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	a5
zn12 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	zn12
Alexa Fluor 488 (anti mouse)	Life Technologies	A-11001
Benzocaine	Sigma Alrdich	E1501	4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	straight
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11001-12	curved
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
Tissue retractor	Fine Science Tools	17009-07
Paraformaldehyde	Sigma Alrdich	P6148
Triton X	Sigma Alrdich	X100
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200