Una tecnica Tempo colorazione differenziale Accoppiato con Full bilaterale Gill Denervation per studiare Ionocytes in Pesci

Abstract

Ionocytes branchiali (CI) sono le unità funzionali per la regolamentazione ionico nei pesci. Negli adulti, si trovano sul filamental e epiteli lamellare della branchia dove essi ioni di trasporto come Na ^+, Cl ^- e Ca ²⁺ attraverso una varietà di canali ionici, pompe e scambiatori. La branchia teleosteo è estrinsecamente innervato dal viso (VI), glossofaringeo (IX) e vago (X) nervi. I nervi IX e X sono anche la fonte estrinseca di branchiali IC innervazione. Qui, due tecniche usate per studiare l'innervazione, la proliferazione e la distribuzione di IC sono descritti: un tempo tecnica di colorazione differenziale e una completa tecnica bilaterale gill denervazione. Brevemente, pesci rossi sono esposti ad un colorante specifico mitocondrio vitale (es MitoTracker Red) che etichette (fluorescenza rossa) CI preesistenti. I pesci sono stati sia permesso di recuperare per 3 - 5 giorni immediatamente sottoposti ad un completo branchia denervazione bilaterale. Dopo 3 - 5 giorni di recupero, il gmali vengono raccolti e fissati per immunoistochimica. Il tessuto viene quindi colorato con un anticorpo primario α-5 (obiettivi Na ⁺ / K ⁺ ATPasi contenente cellule) in combinazione con un anticorpo secondario che etichetta tutti (sia nuove che preesistenti) CI verde. Utilizzando confocale, è stato dimostrato che CI preesistenti appaiono giallo (contrassegnato con sia un colorante specifico mitocondrio vitale e α-5) e nuove CI appaiono verde (marcato con solo α-5). Entrambe le tecniche utilizzate in tandem può essere applicato per studiare l'innervazione, la proliferazione e la distribuzione di IC sul filamento branchie quando i pesci sono esposti alle sfide ambientali.

Introduction

Circuiti integrati sono l'unità funzionale per la regolazione ionica nel pesce e si trovano sulle superfici epiteliali dei filamenti branchiali e lamelle ^4,6-8,10. Sebbene una varietà di sottotipi sono stati descritti che possiedono caratteristiche uniche, molti dei circuiti integrati sono caratterizzati da una elevata densità di mitocondri (così essi sono anche noti come cellule ricco mitocondrio) e / o l'abbondanza dell'enzima Na ⁺ / K ⁺ ATPasi (NKA). In genere, questi circuiti integrati casa una varietà di altre pompe, canali ionici e scambiatori coinvolti nella regolazione di ioni (ad esempio, Na ⁺ / H ⁺ scambiatore Na ⁺ / Cl ^- co-transporter, H ⁺ pompa) ^2,10,11. La ridistribuzione e la proliferazione di circuiti integrati, come un meccanismo di compensazione è fondamentale per il mantenimento della omeostasi di ioni in particolare durante lo stress ionico (ad esempio, l'esposizione ad acqua ion-poveri) ^4,8,9.

Questo studio descrive un momento colorazione differenziale techniQue ¹ per identificare ionocytes appena proliferato (CI) in branchie dei pesci. Questa tecnica è accoppiato con una denervazione bilaterale completa degli archi branchiali. Goldfish (Carassius auratus), le specie utilizzate in questi studi, è adatto per studiare la proliferazione delle cellule epiteliali branchie perché hanno una notevole capacità di rimodellare strutturalmente loro branchie ^2. Gill rimodellamento riferisce alla crescita o retrazione di una massa cellulare interlamellare (ILCM) quando il pesce (normalmente mantenuta a 15 - 30 ° C) sono acclimatati per acqua fredda (<15 ° C) o ipossia, rispettivamente ^3. Studi precedenti che utilizzano il tempo di tecnica di pittura differenziale sui pesci rossi si sono concentrati sulla redistribuzione, innervazione e la proliferazione di circuiti integrati sul branchia nel contesto della branchia rimodellamento ^4,5. Katoh e Kaneko ¹ hanno sviluppato questa nuova tecnica per studiare la trasformazione e la sostituzione dei circuiti integrati branchiali in killifish (Fundulus heteroclitus) transfeRred da acqua di mare (SO) per l'acqua dolce (FW). In questo studio, l'attenzione è rivolta alla proliferazione e innervazione di circuiti integrati in pesci rossi acclimatati a 25 ° C.

Utilizzando la tecnica di colorazione differenziale tempo è stato dimostrato che, nel contesto di gill rimodellamento, pesci rossi mantenere un numero costante di CI ipossico durante l'esposizione e il successivo recupero normossia, tuttavia, la percentuale di cellule innervati diminuito per tutto il periodo di recupero normossia ^5. È stato proposto più di 70 anni fa, che meccanismi di assorbimento ionici nei pesci sono sotto controllo neurale ^12. La branchia teleosteo è innervato dalle facciale (VII), glossofaringeo (IX) e vago (X) nervi di cui anche le "nervi branchiali" ^13,14. Gli studi di Jonz e Nurse (2003) su zebrafish (Danio rerio) branchia innervazione hanno mostrato che l'origine di innervazione è estrinseca (corpo cellulare di fibre nervose è estrinseco alla branchia) e intrinseca (corpo cellulare difibre nervose è intrinseca alla branchia). Gli stessi autori hanno anche dimostrato che IC branchiali sono estrinsecamente innervate ^7.

In questo studio, il tempo di tecnica di colorazione differenziale accoppiato con piena branchia denervazione bilaterale è stato utilizzato per studiare la proliferazione di circuiti integrati privi innervazione estrinseca in pesci rossi. Pieno branchia denervazione bilaterali si riferisce a recidere nervi cranici IX e X. Questi due approcci sono realizzabili in pesci rossi perché la loro dimensioni relativamente grandi (30-200 g) semplifica le procedure chirurgiche delicate, e ionocytes sono facilmente identificabili con tecniche immunoistochimiche standard. Nel presente studio, CI sono state visualizzate utilizzando un colorante vitale specifico mitocondrio (ad esempio, MitoTracker rosso) o un anticorpo primario contro la α-subunità della Na ⁺ / K ⁺ -ATPasi (α-5; Developmental Studies Ibridoma Bank, Università di Iowa, Iowa City IA). Questo protocollo fornisce un meto sempliced di visualizzare e analizzare la ridistribuzione e la proliferazione di CI a branchia di pesce.

Protocol

Entrambi i protocolli conformi agli orientamenti del Consiglio canadese di Animal Care (CCAC) e sono state effettuate con l'approvazione dell 'Università di Ottawa Comitato Animal Care (Protocollo BL-226).

1. Tempo di colorazione differenziale Tecnica: mitocondrio-ricchi Dye Bath

1. Preparare 1 soluzione madre mM MitoTracker Red sciogliendo 50 mg in 94,0 ml di dimetilsolfossido (100% DMSO). Conservare soluzione madre al buio a -20 ° C quando non in uso. Evitare cicli di congelamento / scongelamento.
2. Preparare scatole scure (3-6 scatole) con un volume massimo di 600 ml. Riempite le caselle con 400 ml di acqua sistema (acqua il pesce si svolgono normalmente a) e mettere una pietra d'aria in ogni casella per fornire una fonte di O _2. Ottenere pesci rossi (30 - 40 g) e metterli in scatole con 400 ml di acqua e una pietra d'aria. Dopo 30 minuti, aggiungere il colorante ricco mitocondrio praticabile per produrre concentrazioni finali di 0,1 micron e 0,01% DMSO. Bagnare il pesce per 4 orer.
   1. Se questi sono i pesci di controllo (cioè, senza denervazione), attivare il flusso di acqua per le scatole, permettono la tintura di scovare e recuperare il pesce per il periodo di tempo assegnato nel protocollo. I pesci sono generalmente recuperati per 3 - 5 giorni.
3. Dopo il periodo di recupero procede alla Sezione 3: Tecnica Tempo colorazione differenziale: immunoistochimica. Se questi pesci devono essere denervato procedere alla Sezione 2: Completa Procedura Denervation bilaterale.

2. Procedura completa Denervation bilaterale

1. Ottenere 1 paio di forbici studente primavera Vannas (curve), 1 paio di pinze-rette modello standard, 1 paio di pinze-curve del modello standard, 2 paia di No. 5 pinze, 1 paio di divaricatori tissutali, palle piccolo di cotone (1 - 2 mm di diametro) e tamponi di cotone (Q consigli o equivalenti).
2. Preparare bagnomaria anestetico. Innanzitutto, sciogliere 10 g di benzocaina ad un volume finale di 100 mldel 99% di etanolo per preparare una soluzione madre. Per preparare bagnomaria anestetico, sciogliere 15 ml della soluzione madre benzocaina in 30 L di acqua sistema areato alla temperatura richiesta. Aerare l'acqua mettendo una pietra aria collegata ad una pompa ad aria o aria linea centrale nel serbatoio dell'acqua.
   1. Mettere il pesce in bagno d'acqua anestetico (Figura 1A).
   2. Una volta che la respirazione è cessata, posizionare il pesce su un tavolo chirurgia e intubazione come mostrato nella Figura 1B. A tale scopo, l'inserimento di un tubo nella sua cavità buccale per irrigare le branchie con soluzione di anestetico aerato. Irrigazione delle branchie assicura che il pesce viene fornito con una sufficiente quantità di O ₂ e anestetico durante la procedura di denervazione. Posizionare il pesce in modo che la testa è inclinata leggermente verso il basso. Questo permette un migliore accesso alla zona dietro il quarto arco branchiale.
3. Sollevare delicatamente l'opercolo con le rette pinza modello standarde posizionare i divaricatori tissutali tra l'opercolo e l'interno della testa. Aprire con cautela i divaricatori dei tessuti per mantenere l'opercolo lontano dalla testa e mantenere le branchie esposti.
4. Assicurarsi che la soluzione di anestetico viene irrigando le branchie durante questa procedura. Riposo il divaricatore gestisce accanto alla testa, che fornisce l'accesso a tutti i quattro archi branchiali.
5. Posizionare le curve pinza modello standard tra il quarto arco branchiale e la parte posteriore della testa e delicatamente aprirli per creare tensione nella legamento allegando il quarto arco branchia alla testa. Con un paio di n ° 5 pinze creare una piccola apertura (2-3 mm), forando l'epitelio che collega l'estremità dorsale degli archi branchiali alla cavità opercolare. Fare attenzione a non andare troppo in profondità perché c'è il rischio di danneggiare un vaso sanguigno.
6. Con un piccolo batuffolo di cotone tenuto con No. 5 pinze lentamente e con attenzione ampliare l'incisione per esporre il IX (glossofaringeo) e X (vago) nervi. Libero ilnervi da qualsiasi tessuto connettivo utilizzando il n ° 5 pinze, ancora una volta facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni.
   NOTA: La IX e X branchiale nervi del pesce rosso profondo riposo dietro il quarto arco branchiale e sono in prossimità di importanti vasi sanguigni che alimentano nelle archi branchiali.
7. Una volta che i nervi sono stati identificati uso le forbici curva molla per tagliare con attenzione i nervi tenendo l'incisione aperta con le curve pinza forma standard. Dopo recidere i nervi, estrarre con cautela le pinze curve. Non vi è alcuna necessità di chiudere l'incisione con suture perché l'epitelio è molto sottile e l'incisione di solito chiude propria all'interno di 24 - 48 ore. Rimuovere divaricatore tissutale.
8. Ripetere la stessa procedura sull'altro lato della testa.
9. Accendere l'irrigazione delle branchie da anestetico per acqua dolce aerato per recuperare il pesce da anestesia. Una volta che i movimenti opercolari hanno ripreso spostare il pesce nelle vasche sperimentali per recuperare per almeno 24 ore.

3. Tempo colorazione differenziale Tecnica: Immunohistochemistry

1. Innanzitutto, preparare 4% paraformaldeide (PFA) in 1x tampone fosfato salino (PBS; 4 g PFA in 96 ml di PBS). PFA non si scioglie facilmente in PBS a temperatura ambiente. Soluzione di calore in un bagno d'acqua per sciogliere PFA. Eseguire questo in una cappa aspirante. Una volta PFA è in soluzione lasciate raffreddare prima dell'uso. Conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.
2. Prima eutanasia il pesce ed estraendo il tessuto gill, posizionare 3 - 4 ml di 4% PFA in una fiala di scintillazione per un totale di 8 fiale di scintillazione (1 flaconcino per gill arch). Inoltre, prendere una piccola barca a pesare e riempirlo con 1x PBS. Questo verrà utilizzato per lavare il tessuto dopo che è stato asportato. Tenere tutte le soluzioni su ghiaccio.
3. Dopo l'esposizione di colorante vitale ricco di mitocondrioesperimento è finito, eutanasia il pesce rosso mettendo in un bagno d'acqua con una overdose di benzocaina.
4. Utilizzare pinze smussato per sollevare l'opercolo su un lato della testa e forbici curve di recidere ciascuna estremità del cestello branchiale gill. Scegliere con cura le branchie per i rastrelli con pinze smussato e sollevarli dalla cavità opercolare. Lavare immediatamente le branchie in ghiaccio freddo 1x PBS per rimuovere l'eccesso benzocaina e sangue.
5. Posizionare le branchie asportati in fiale separate (una fiala per ogni arco branchiale) riempito con 4% PFA e fissare O / N a 4 ° C.
6. Dopo fissazione, lavare l'eccesso PFA in 1X PBS e posizionare il tessuto in una provetta 2 ml proiettile riempito con 1,5 ml di 1% Triton-X su un agitatore per 6 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Questo passaggio permeabilizes il tessuto. Se tutta la branchia è troppo grande per inserire in una provetta 2 ml poi tagliate il tessuto in sezioni abbastanza piccolo per adattarsi tubo facendo attenzione a non danneggiare i filamenti.
   1. Preparare le diluizioni di anticorpi primari di Mixing 4 ml di soluzione madre di ogni anticorpo primario (un totale di 8 ml) in 992 ml di 1x PBS. Assicurarsi che il NKA (etichette cellule NKA-ricchi) e Zn-12 (etichette neuroni) anticorpi primari sono stati sollevati nello stesso host. Ciò è importante se i ricercatori decidono identificare specifici sottotipi IC allo stesso tempo per il quale si dovranno utilizzare anticorpi primari e secondari sollevati in diverse specie ospiti.
   2. Rimuovere la soluzione di Triton-X e senza lavare il tessuto aggiungere un 1: 250 diluizione (diluito in PBS 1x) di un anticorpo monoclonale NKA (α-5) per rilevare le cellule NKA ricchi e un anticorpo specifico neuronale zebrafish (zn-12) per rilevare fibre nervose (anticorpi primari) e incubare su un agitatore per 6 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
7. Lavare l'anticorpo primario 3 volte per 3 minuti ciascuno con 1x PBS. Per fare questo, rimuovere la soluzione di anticorpo primario dal tubo aspirando fuori usando una pipetta.
8. Preparare l'anticorpo secondario a un1: 200 diluizione mescolando 5 ml di brodo anticorpo secondario in 995 ml di 1x PBS. Applicare anticorpo secondario (Alexa Fluor 488) e incubare per 6 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C su un agitatore.
   NOTA: MitoTracker rosso è eccitato a ~ 594 nm e verrà fluorescenza rossa. Un anticorpo secondario che viene eccitato a ~ 488 nm di lunghezza d'onda e reagisce in verde deve essere usato per etichettare NKA e Zn-12 anticorpi primari.
9. Rimuovere anticorpo secondario eccesso lavando il tessuto 3 volte per 5 minuti ciascuno (come descritto nel passaggio 3.7).

4. Imaging

1. Dopo i lavaggi, montare il tessuto su un vetrino concava per montare tutto confocale di cellule e fibre nervose. Per montare il tessuto, il primo posto in una goccia (200 ml) di 1x PBS su un vetrino da microscopio piatta. Questo assicura che il tessuto non essiccare.
2. Separare i hemibranchs branchia con curve micro-forbici. Mettere una goccia di PBS 1x e una goccia di mezzo di montaggio in una diapositiva concava.
3. Posizionare i hemibranchs separati nella diapositiva concava con il bordo anteriore del filamento rivolto verso l'alto e coprire con un vetrino coprioggetto. Tamponare i bordi del coprioggetto con smalto per evitare vetrino da spostano e spostando il tessuto. Lasciare il tessuto di depositarsi sul fondo della slitta concava per 10 - 15 minuti prima di imaging.
4. Per ogni arco branchiale, selezionate sei filamenti branchiali a caso per l'imaging, la produzione di sei immagini per arco branchiale. Utilizzare microscopia confocale convenzionale immagine del tessuto prendendo 1-3 micron fette ottici.
   NOTA: Tutte le cellule pre-esistenti sarà etichettato con MitoTracker rosso e positivo per NKA apparirà solo giallo. Le cellule che appaiono di colore rosso solo i circuiti integrati preesistenti che non contengono NKA. Ogni cella appena proliferato sarà solo positivo per NKA e apparirà solo verde. Le fibre nervose appaiono anche verde.

5. Analisi immagine per Ionocyte quantificazione

1. Per each branchia filamento che è stato ripreso, quantificare i circuiti integrati e innervazione associato scorrendo le sezioni della pila Z e contando il numero di lamellari e filamental circuiti integrati presenti e anche se non sono state recentemente differenziati, pre-esistenti, e / o innervata .
2. Quantificare i circuiti integrati per filamento o per area (mm ²⁾ del filamento. Per fare ciò, utilizzando gli strumenti di disegno associati al software utilizzato per acquisire le immagini per delineare le lamelle del filamento che comprende l'area del filamento in cui sono stati quantificati gli integrati. La maggior parte dei programmi software di imaging confocale hanno la possibilità di calcolare l'area di una regione delineato sull'immagine. Utilizzare l'opzione nel software di imaging che permette di fare questo per acquisire l'area.
3. Dividere le CI contati dal area calcolata dal software per ottenere una misura di circuiti integrati per unità di superficie (ad esempio, per mm ^2).

Representative Results

La figura 1 illustra il tavolo operatorio configurare (Figura 1A), il posizionamento del pesce durante l'intervento chirurgico (Figura 1B) e le tre fasi più importanti per il tempo tecnica di colorazione differenziale (Figura 1C). Nel passaggio 1, il pesce viene mantenuta per 30 minuti in un bagno d'acqua ben aerato a 25 ° C al buio. Durante il periodo di 30 min, il ricercatore può preparare il colorante aliquota ricco mitocondrio in DMSO che viene aggiunto all'acqua durante Fase 2 (Figura 1C). Il periodo di incubazione nella Fase 2 consente per l'assorbimento del colorante ricco mitocondrio dall'acqua nelle cellule ricche di mitocondrio (cioè, CI). Il pesce può quindi essere sottoposti alla procedura completa bilaterale denervazione o di una procedura simulata in cui il pesce viene anestetizzato e la opercoli manipolato, ma i nervi rimangono intatti. Il set up al punto 3 rappresenta una camera di recupero dotata di acqua corrente per un pesce che ha either subito le completa denervazione bilaterale o una procedura di "farsa".

Dopo il periodo di recupero, il pesce era eutanasia e le branchie sono stati asportato e fissato per immunoistochimica. La distribuzione complessiva e innervazione di IC sul filamento branchie di un pesce che aveva subito una procedura di "sham" è mostrata in Figura 2. I circuiti integrati sono presenti sul epiteli filamental nonché alla base delle regioni interlamellari. Spettacoli Figura 2A Circuiti integrati preesistenti marcati con ricchi mitocondrio dye (cioè, questi circuiti integrati esistevano prima sono state eseguite le procedure di denervazione / sham). La figura 2B mostra fibre nervose che innervano i circuiti integrati pre-esistenti e di nuova costituzione (identificato da NKA immunoreattività) del filamental e epiteli lamellare. Infine, la fusione delle due immagini (Figura 2C) rivela chiaramente i circuiti integrati preesistenti (colore giallo) e dei nuovi circuiti integrati (appaiono in verde).La figura 2D è un grafico rappresentante IC quantificazione per il filamento illustrato nella Figura 2A-C. Su questo filamento specifica, sembrano essere un numero maggiore di CI appena proliferato per mm ² rispetto CI preesistenti (N = 1). Per rimuovere la fonte di innervazione estrinseca branchiale, i nervi cranici IX e X (innervazione estrinseca) sono stati interrotti. La figura 3A mostra la regione dorsale della cavità opercolare dopo i filamenti branchiali e gli epiteli che coprono i nervi sono stati rimossi per esporre il IX e X nervi cranici (indicati con numeri romani), che spaziano da due grandi tronchi nervosi a innervano i quattro archi (Figura 3A); gli archi branchiali sono numerati da 1 a 4. Figura 3B-E illustrare denervazione selettiva del primo arco branchiale. Il primo arco gill è innervato da entrambi i IX e X nervi cranici (Figura 3B) che possono essere rimosse senza influenzare l'innervazione al resto of archi branchiali (Figura 3C-E). Risultati completi denervazione bilaterali in graduale perdita di innervazione estrinseca ai filamenti branchiali (Figure 4A-C). Pesci controllo presentano un fascio nervoso evidente che attraversa la lunghezza del filamento (Figura 4A). Denervazione bilaterale completa provocato una perdita di innervazione estrinseca dopo 2 giorni di recupero (Figura 4B). Ulteriore scomparsa di innervazione estrinseca è stato notato dopo 5 giorni di recupero da denervazione (Figura 4C). Qualsiasi residuo innervazione di circuiti integrati dopo 5 giorni di recupero presumibilmente è stato derivato dal nervi con corpi cellulari all'interno del filamento branchia (innervazione intrinseca; Figura 4C).

Figura 1. sperimentale impostato per la procedura di denervazione e la sequenza di passi utilizzati nellatempo tecnica di colorazione differenziale. (A) tabella di Chirurgia istituito per la procedura di denervazione mostrare i serbatoi anestetici e di recupero. (B) Esempio di posizionamento di un anestetizzato, pesce intubato. (C) passaggi chiave dell'atto tempo tecnica di colorazione differenziale. Nel passaggio 1, il pesce è posto in modo controllato, statica bagnomaria aerata temperatura per 30 min. Il colorante ricco-mitocondrio viene aggiunto al punto 2 per una concentrazione finale di 0,1 micron e il pesce è permesso fare il bagno nella soluzione per un minimo di 4 ore. Il flusso dell'acqua è riavviato al punto 3 il punto in cui il pesce subisce sia una completa denervazione bilaterale branchia o un intervento chirurgico farsa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. micrografie luce rappresentano il tempo tecnica di colorazione differenziale in un dorato (acclimatati a 25 ° C) 2 giorni dopo denervazione completa bilaterale. (A) La distribuzione dei ionocytes preesistenti (CI, frecce). Su un singolo filamento branchia è rivelato da ricchi-mitocondrio dye colorazione (B) La distribuzione dei circuiti integrati (nuovi e preesistenti) e branchiali nervi (frecce tratteggiate) viene rivelata da colorazione con anticorpi α-5-zn e 12, rispettivamente. Le frecce indicano circuiti integrati (C) La sovrapposizione di (A) e (B) distingue IC preesistenti. (Di colore giallo; indicati da frecce) da circuiti integrati di nuova proliferato (appare verde, indicati dalle frecce). Inserire in (C) è un ingrandimento di un preesistente ionocyte innervati. (D) grafico rappresentante IC quantificazione per il filamento mostrato in pannelli (AC). N bar = 1. Scala a pannello (C) è di 50 micron e si applica a tutti i pannelli./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Immagini rappresentative descrivono le varie fasi della innervazione branchia. Vista (A) dorsale della cavità buccale che mostra i nervi cranici IX e X innervano tutti i 4 archi branchiali. Archi branchiali sono numerati 1-4. I filamenti branchiali e il tessuto che copre i nervi sono stati rimossi per visualizzare meglio l'innervazione. (B) Il 1 ^° e 2 ^° archi branchiali sono separati per rivelare l'organo sensoriale ei rami dei nervi cranici IX e X innervano il 1 ^° branchia arch. (CE) Sequenza di immagini che mostrano la denervazione selettiva del 1 ^° arco branchiale tagliando i rami dei nervi cranici IX e X. Per un re schematicopresentazione di branchia innervazione di pesci teleostei, fare riferimento alla Figura 1 a Milsom et al ²⁶ Le linee bianche nelle immagini sono acqua di riflessione dalle luci microscopio.; non definiscono alcuna struttura morfologica. Bar Scala a pannello (E) è di 4 mm e si applica a tutti i pannelli. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Micrografie luce raffiguranti la distribuzione e innervazione di ionocytes su un singolo filamento del 1 ^° branchia arco di un pesce rosso acclimatati a 25 ° C. Ionocytes (indicato da punte di freccia) sono state colorate con la α-5 anticorpi e nervi (indicata bfrecce y) sono state colorate con l'anticorpo zn-12. (A) Gill filamento di un pesce di controllo che mostra un fascio nervoso centrale presumibilmente provenienti dai nervi IX e X (innervazione estrinseca) con una vasta ramificazione lamellare. Alcuni dei ionocytes indicati sono anche innervati (insert). (B) A branchia filamento 2 giorni dopo il pieno denervazione bilaterale. C'è stata una riduzione del fascio nervoso centrale, mentre l'innervazione lamellare è apparso in gran parte intatta. (C) A branchia filamento 5 giorni dopo completa denervazione bilaterale dimostrando che innervazione estrinseca era in gran parte assente. Analisi qualitativa suggerisce che completa denervazione bilaterale provoca la degradazione della innervazione estrinseca branchia mantenendo i nervi con corpi cellulari all'interno del filamento branchia (innervazione intrinseca) la creazione di una rete di nervi attraverso il filamento e nella lamelle. Si pregaclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

La tecnica di colorazione differenziale di tempo può essere un utile strumento per comprendere la regolazione dinamica di ioni assorbimento e di esaminare la redistribuzione temporale di circuiti integrati in epiteli branchia. Sebbene una procedura semplice, ci sono una serie di punti chiave che sono cruciali per il successo del tempo tecnica di colorazione differenziale. Il pesce rosso deve essere esposto al colorante ricco mitocondrio per il tempo assegnato nel protocollo. Esposizioni più brevi si tradurrà in scarsa captazione del colorante da parte delle cellule ricche di mitocondrio (cioè, ionocytes). Durante la fissazione, il tessuto branchia deve essere asportato rapidamente e tenuti all'oscuro per evitare foto sbiancamento. Il tessuto deve essere processato per l'imaging entro 2 settimane di fissazione. Durante la procedura bilaterale sezionamento nervo garantire che il pesce è ben anestetizzato; i nervi ei vasi sanguigni sono chiaramente identificati; e il pesce riprende pieno funzione opercolare prima di essere spostato in un serbatoio di recupero.

"> L'ambiente FW presenta pesce con la duplice sfida di bilanciare le perdite di ioni passivi e aumento di acqua osmotizzata ^14. Il bilanciamento delle perdite di ioni passivi avviene tramite la diffusione attiva di sale attraverso i circuiti integrati che sono localizzate al filamental e epiteli lamellare dove possono entrare in contatto diretto con l'ambiente esterno ^2,4,8,9,16. Tuttavia, la posizione dei circuiti integrati sul Gill non è statica. Negli ultimi tre decenni, un certo numero di studi hanno dimostrato che diverse specie di pesci FW, di fronte con una sfida ionico e / o la temperatura, ridistribuire CI branchiali dal filamento o di base della lamella alle regioni più distali del lamelle ^{1,2,4,5,17-21.} Tale ridistribuzione può aumentare lo spessore delle lamelle che possono compromettere il trasferimento di gas (O _2, CO ₂₎ attraverso gli epiteli branchia ^22. I ricercatori hanno utilizzato la tecnica di colorazione differenziale volta descritto in questo manoscritto per monitorare il trasferimento e emergence dei nuovi circuiti integrati sul epiteli branchia in queste diverse condizioni sperimentali (Figura 1C) ^1,4,5.

Le branchie, e presumibilmente i circuiti integrati branchiali, sono innervati dal IX e X nervi cranici ^7,23-25. Questi nervi portano sia efferente input afferenti e da e verso il gill, rispettivamente. Si trovano sul lato dorsale della cavità buccale dietro al 4 ^° branchia arch. L'accessibilità dei nervi e la facilità con cui la procedura di denervazione bilaterale può essere eseguita sia specie-specifico. In trota, per esempio, l'anatomia appuntito ed appiattito della testa consente ai nervi giacciono in un unico piano dietro 4 ^° gill arco sotto un sottile strato di tessuto. Questo rende i nervi visibili e facilmente accessibili al ricercatore di eseguire la procedura di denervazione. Al contrario, pesci rossi hanno un muso più corto e una testa più rotondo. IX e X nervi cranici di pesci rossi si trovano più in profondità la si dorsalede della cavità dopo il 4 ^° arco gill occupando piani diversi. Questo orientamento limita la facilità di accesso ai nervi e richiede un approccio più accurata per identificare e recidere i nervi appropriati. Lo scopo della procedura di denervazione è rimuovere input afferenti ed efferenti sensoriali da e verso il gill, rispettivamente. Denervazione degli archi branchiali può essere accoppiato con esperimenti di flusso di ioni con radioisotopi (ad esempio, ²² Na). Queste tecniche possono essere utilizzate in tandem per studiare il contributo dell'ingresso nervoso sul movimento di ioni attraverso gli epiteli gill. Un'altra limitazione al procedimento denervazione è l'incapacità di distinguere tra i neuroni sensoriali e motori, pertanto quando recidere il nervo fascio è possibile che entrambi i tipi di innervazione vengono rimossi. Severing eventuali motoneuroni può influenzare la branchia e movimento opercolare del pesce. Così, quando l'esecuzione di esperimenti denervazione branchiali è importante monitorare anche la ventilazione dopo lapesce è recuperato dalla procedura per garantire che vi sia sufficiente circolazione gill sia per il gas e scambio ionico.

I protocolli descritta nel presente manoscritto animali adulti tenuti al 00:12 luce: ciclo buio e nutriti pellet alimentari commerciali. Questi metodi possono essere modificati in vari modi. Innanzitutto, il periodo di recupero dopo l'esposizione colorante ricco mitocondrio può essere regolato alle esigenze del protocollo del ricercatore (ad esempio, 1, 3, 5, o 14 giorni). Il più lungo periodo di recupero dopo ricchi-mitocondrio esposizione dye in laboratorio è stato 14 giorni ^{di 4,5.} Non c'era una significativa diminuzione dell'intensità della fluorescenza del colorante ricco mitocondrio dopo 14 giorni di recupero. In secondo luogo, l'uso dell'anticorpo primario α-5 è limitato solo identificare cellule ricche Nka e non distingue tra i differenti sottotipi di CI branchiali. Fortunatamente, in pesci rossi è stato stabilito che la maggior parte dei circuiti integrati sono entrambi mitochondrion-ricchi (etichetta con MitoTracker) e NKA-ricchi (etichetta con α-5), le cellule che non può essere il caso in tutte le specie ittiche ^4,27. Esperimenti futuri possono concentrarsi sul seguito della redistribuzione temporale dei sottotipi specifici IC utilizzando anticorpi diretti specificamente contro una varietà di canali, pompe e scambiatori (ad esempio, NHE, H ⁺ pompa). Precedenti studi hanno trovato che la maggior parte dei ionocytes colorati con ricche di mitocondri dye mostra NKA immunoreactivity ^4. Innervazione del IC può essere rilevato utilizzando un anticorpo primario contro-specific antigen neurone zebrafish-derivato (Zn-12). In questo studio, α-5 e Zn-12 anticorpi primari sono stati rilevati utilizzando lo stesso anticorpo secondario (Alexa Fluor 488) per entrambi. Questa limitazione è dovuta sia anticorpi primari a salire in un ospite mouse e viene superata dal fatto che le NKA ricchi cellule e neuroni possono distinguere morfologicamente pur fluorescenza dello stesso colore. Colorazione sequenzialecon differenti anticorpi secondari (ad esempio, prima α-5 con Alexa Fluor 488 poi Zn-12 con Alexa Fluor 594) può anche essere utilizzato per eliminare il problema di avere due marcatori fluorescenti stesso colore. Infine, il protocollo completo nervo sezionamento bilaterale può essere modificato per i nervi a specifici archi branchiali bersaglio. Ad esempio, il sezionamento nervo selettiva può essere eseguita sul primo arco gill separando delicatamente primo e secondo archi branchiali per esporre i nervi che conducono al primo arco gill alla fine dorsale del cestello gill (Figura 2B-E). La tecnica differenza di tempo può essere applicato anche per studiare la distribuzione di ionocytes in larvale pesce zebrafish come si sviluppano e transizioni trasporto ionico dalla pelle al gill.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MitoTracker Red	Life Technologies	M-7512
Dimethyl sulfoxide	Sigma Alrdich	D2650
α-5 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	a5
zn12 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	zn12
Alexa Fluor 488 (anti mouse)	Life Technologies	A-11001
Benzocaine	Sigma Alrdich	E1501	4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	straight
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11001-12	curved
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
Tissue retractor	Fine Science Tools	17009-07
Paraformaldehyde	Sigma Alrdich	P6148
Triton X	Sigma Alrdich	X100
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200