A Time Differential Farging teknikk Sammen med Full Bilateral Gill denervering å studere Ionocytes i Fish

Abstract

Branchial ionocytes (ICS) er de funksjonelle enheter for ionisk regulering i fisk. Hos voksne, de er funnet på filamental og lamellær epithelia av gjelle hvor de transport ioner som Na ^+, Cl ^- og Ca ²⁺ via en rekke ionekanaler, pumper og vekslere. Den teleost gill er extrinsically stimuleres av ansikts (VI), glossopharyngeal (IX) og vagus (X) nerver. De IX og X-nervene er også den ytre kilden til branchial IC innervasjon. Her er to teknikker som brukes for å studere innervasjon, spredning og fordeling av integrerte kretser som er beskrevet: en tidsforskjellen fargingsteknikk og en full bilateral gjelle denervering teknikk. Kort fortalt er gullfisk utsatt for en vital mitokondrie-spesifikke fargestoff (f.eks MitoTracker Red) som etiketter (rød fluorescens) pre-eksisterende ICs. Fisken ble enten lov til å komme for 3 - 5 dager eller umiddelbart gjennomgikk en full bilateral gill denervering. Etter 3-5 dager med oppgang, den gills høstes og fast for immunhistokjemi. Vevet blir deretter farget med en α-5 primært antistoff (mål Na ⁺ / K ⁺ ATPase-inneholdende celler) i kombinasjon med et sekundært antistoff som alle etiketter (både nye og eksisterende) ICs grønt. Ved hjelp av konfokal avbildning, ble det vist at pre-eksisterende kretser vises gult (merket med både en levedyktig mitokondrie-spesifikke fargestoff og α-5) og nye kretser vises grønn (merket med α-5 only). Begge teknikker som brukes i tandem kan anvendes for å studere innervasjon, spredning og fordeling av integrerte kretser på gjellefilament når fisken utsettes for miljøutfordringer.

Introduction

ICs er funksjonell enhet for ionisk regulering i fisk og er funnet på epitel overflater av gjellefilamenter og lameller ^4,6-8,10. Selv om en rekke undertyper har blitt beskrevet som besitter unike egenskaper, er mange av de ICs preget av en høy tetthet av mitokondrier (dermed er de også kjent som mitokondrie-rik celler) og / eller en overflod av enzymet Na ⁺ / K ⁺ ATPase (NKA). Vanligvis disse ICs huset en rekke andre pumper, ionekanaler og lere involvert i ion regulering (for eksempel Na ⁺ / H ⁺ leren, Na ⁺ / Cl ^- co-transporter, H ⁺ pumpe) ^2,10,11. Omfordeling og spredning av ICs som kompensasjonsmekanisme er sentralt for å opprettholde ion homeostase spesielt under ionisk stress (f.eks eksponering for ion-fattig vann) ^4,8,9.

Denne studien beskriver en tidsforskjellen flekker Technique ^en å identifisere nylig proliferated ionocytes (ICS) i fiskens gjeller. Denne teknikken er kombinert med en fullstendig bilateral denervering av gjellebuene. Gullfisk (Carassius auratus), de artene som brukes i disse studiene, er godt egnet til å studere spredning av gill epitelceller fordi de har en bemerkelsesverdig evne til å strukturelt remodel gjellene ^to. Gill ombygging refererer til vekst eller tilbaketrekning av en interlamellær cellemasse (ILCM) når fisken (normalt opprettholdt ved 15 - 30 ° C) er akklimatisert til kaldt vann (<15 ° C) eller hypoksi, henholdsvis ^tre. Tidligere studier ved hjelp av tidsforskjellen flekker teknikk på gullfisk har fokusert på omfordeling, innervasjon og spredning av ICs på gjelle i sammenheng med gjelle ombygging ^4,5. Katoh og Kaneko ^en utviklet denne nye teknikken i å studere transformasjon og utskifting av branchial ICs i tannkarpe (Fundulus heteroclitus) transfeRøed fra sjøvann (SV) til ferskvann (FW). I denne studien er det fokus på spredning og innervasjon av ICs i gullfisk acclimated til 25 ° C.

Ved hjelp av tidsdifferansen fargingsteknikk ble det vist at, i sammenheng med gjelle ombygging, gullfisk opprettholde et konstant antall integrerte kretser under hypoksiske eksponering og påfølgende normoksiske gjenvinning er imidlertid prosentandelen av innerverte cellene ble redusert i løpet av normoksiske restitusjonsperiode ^5. Det ble foreslått mer enn 70 år siden at ioniske opptaksmekanismer hos fisk er under nevrale kontroll ^12. Den teleost gill innervert av ansikts (VII), glossopharyngeal (IX) og vagus (X) nerver også referert til som "branchial nerver" ^13,14. Studier av Jonz og sykepleier (2003) på sebrafisk (Danio rerio) gill innervasjon viste at opprinnelsen til innervasjon er ytre (celle kroppen av nerve fiber er extrinsic til gjelle) samt indre (celle kroppen avnerve fiber er iboende i gjelle). De samme forfatterne viste også at branchial ICs er extrinsically innerverte ^7.

I denne studien ble tidsdifferansen farging teknikk kombinert med full bilateral gill denervering brukes til å undersøke spredning av ICs mangler ytre innervasjon i gullfisk. Full bilateral gill denervering refererer til severing hjernenerver IX og X. Disse to tilnærmingene er gjennomførbare i gullfisk fordi deres relativt stor størrelse (30-200 g) forenkler kompliserte operasjoner, og ionocytes er lett identifiseres ved hjelp av standard immuno-histokjemisk teknikker. I foreliggende studie ble ICs visualisert ved anvendelse av en viktig mitokondrie-spesifikke fargestoff (f.eks MitoTracker rød) eller et primært antistoff mot α-subenhet av Na ⁺ / K ⁺ -ATPase (α-5; utviklingsstudier Hybridom Bank University i Iowa, Iowa City IA). Denne protokollen gir en grei method å visualisere og analysere omfordeling og spredning av ICs på fisken gill.

Protocol

Begge protokollene dannet retningslinjene i den kanadiske Council of Animal Care (CCAC) og ble utført med godkjenning av University of Ottawa Animal Care Committee (Protocol BL-226).

1. Tid Differential Farging teknikk: Mitokondrie-rik Dye Bath

1. Forbered 1 mM MitoTracker Red stamoppløsning ved å oppløse 50 ug i 94,0 ul dimetylsulfoksid (100% DMSO). Hold stamløsning i mørket ved -20 ° C når de ikke er i bruk. Unngå fryse / tine sykluser.
2. Forberede mørke bokser (3-6 bokser) med et maksimalt volum på 600 ml. Fylle boksene med 400 ml av systemet vann (vann fisken avholdes normalt i) og legg en luft stein i hver boks for å gi en kilde til O _2. Skaff gullfisk (30 - 40 g) og plassere dem i bokser med 400 ml vann og en luft stein. Etter 30 minutter, tilsett levedyktig mitokondrie-rik fargestoff for å gi endelige konsentrasjoner på 0,1 uM og 0,01% DMSO. Bade fisken i 4 timerr.
   1. Hvis disse er kontrollfisken (dvs. ingen denervering), slå på vannstrømmen til boksene, la fargestoff å skylle ut og gjenopprette fisken for perioden avsatte tiden i protokollen. Fisk er vanligvis utvinnes for 3 - 5 dager.
3. Etter hvileperiode fortsette til punkt 3: Tid Differential Farging teknikk: Immunohistokjemi. Hvis disse fisken skal denervert videre til punkt 2: Full Bilateral denervering prosedyre.

2. Full Bilateral denervering Prosedyre

1. Få 1 par student Vannas våren saks (buet), 1 par av standard mønster tang-rett, 1 par av standard mønster tang-buede, 2 par No. 5 tang, 1 par vev Saker, små bomullsdotter (1 - 2 mm i diameter), og bomullspinner (Q tips eller tilsvarende).
2. Forberede narkosen vannbad. Først oppløses 10 g av benzokain i et sluttvolum på 100 mlav 99% etanol for å fremstille en stamoppløsning. For å fremstille den bedøvende vannbad, oppløser 15 ml av forråds benzokain løsningen i 30 l av oksygenert vann-system ved den nødvendige temperatur. Lufte vannet ved å plassere en luft-stein som er koblet til en luftpumpe eller en sentral air-linje inn i vanntanken.
   1. Plassere fisken i den anestetiske vannbad (figur 1A).
   2. Når pusten opphører, legger fisken på en operasjon bord og intubere det som er vist i figur 1B. Gjør dette ved å sette inn et rør i sin munnhulen for å vanne gjellene med luftet bedøvelse løsning. Vanning av gjellene sikrer at fisken leveres med en tilstrekkelig mengde av O ₂ og bedøvelse under denervering prosedyren. Plasser fisken slik at hodet er vippet litt nedover. Dette åpner for bedre tilgang til området bak den fjerde gjellebuen.
3. Løft forsiktig operculum med de rette standard mønster tangog plassere vev Saker mellom operculum og innsiden av hodet. Åpne vev Saker nøye for å holde operculum borte fra hodet og holde gjellene utsatt.
4. Pass på at narkosen løsningen vanning gjellene under denne prosedyren. Hvil retractor håndterer ved siden av hodet som gir tilgang til alle fire gjellebuene.
5. Plassere de buede standard mønster tang mellom fjerde gjellebuen og baksiden av hodet og forsiktig åpne dem for å skape spenning i ligament feste fjerde gjellebuen til hodet. Med et par nr 5 tang lage en liten åpning (2-3 mm) ved piercing Epitel forbinder rygg slutten av gjellebuene til opercular hulrom. Vær forsiktig med å gå inn for dypt, fordi det er fare for å skade en større blodåre.
6. Med en liten bomullsdott holdt med nr 5 tang sakte og forsiktig utvide snittet for å eksponere IX (glossopharyngeal) og X (vagus) nerver. Gratis dennerver fra alle bindevev ved hjelp av No. 5 tang, igjen tar seg ikke å skade blodårene.
   MERK: branchial IX og X nerver av gullfisk hvile dypt bak den fjerde gjellebuen og er i nærhet til store blodkar fôring i gjellebuene.
7. Når nervene har blitt identifisert bruk de buede våren saks til å nøye kutte nervene mens du holder snittet åpen med de buede standard form tang. Etter kutte nervene, forsiktig trekke de buede tang. Det er ikke nødvendig å lukke såret med sting fordi Epitel er veldig tynn og snittet stenger gjerne av seg selv i løpet av 24-48 timer. Fjerne vev retractor.
8. Gjenta fremgangsmåten på den andre siden av hodet.
9. Slå vanning av gjellene fra narkosen til frisk kullsyreholdig vann for å gjenopprette fisken fra anestesi. Når opercular bevegelser har gjenopptatt flytte fisken inn eksperimentelle tanker til krefter i minst 24 timer.

3. Tid Differential Farging teknikk: Immunohistokjemi

1. Først fremstille 4% paraformaldehyd (PFA) på 1 x fosfatbufret saltvann (PBS; 4 g PFA i 96 ml PBS). PFA ikke oppløses lett i PBS ved romtemperatur. Varme løsningen i et vannbad for å oppløse PFA. Utføre dette i en avtrekkshette. Når PFA er i løsning la avkjøles før bruk. Oppbevar ved 4 ° C i opptil 2 uker.
2. Før euthanizing fisken og ekstrahering av gjellevev, plasser 3-4 ml 4% PFA i en scintillasjonsflaske for totalt åtte scintillasjonsampuller (1 ampulle pr gjellebuen). I tillegg tar en liten veie båt og fylle det med 1x PBS. Dette vil bli brukt for å vaske vevet etter at den har blitt skåret. Hold alle løsninger på is.
3. Etter levedyktig mitokondrie-rik fargestoff eksponeringeksperimentet er ferdig, avlive gullfisk ved å plassere den i et vannbad med en overdose av benzocaine.
4. Bruk butte pinsett til å løfte operculum på den ene siden av hodet, og buede saks for å kutte hver ende av branchial gjelle kurven. Nøye plukke opp gjellene av de rakers med butte pinsett og løfte dem ut av opercular hulrom. Umiddelbart vaske gjellene i iskald 1x PBS for å fjerne overflødig benzokain og blod.
5. Plasser skåret gjellene i separate hetteglass (en ampulle for hver gill bue) fylt med 4% PFA og fikse O / N ved 4 ° C.
6. Etter fiksering, vaskes overskuddet av PFA i 1 x PBS og sette vevet i en 2 ml kule rør fylt med 1,5 ml av 1% Triton-X på en ristemaskin i 6 timer ved RT, eller O / N ved 4 ° C. Dette trinnet permeabilizes vevet. Hvis hele gjelle er for stor til å plassere inn i en 2 ml tube deretter kutte vev i seksjoner små nok til å passe i røret tar seg ikke å skade fibrene.
   1. Forberede de primære antistoff fortynninger av miXing 4 ul av stamløsningen av hvert primært antistoff (totalt 8 pl) i 992 ul av 1 x PBS. Kontroller at NKA (etiketter NKA-rike celler) og Zn-12 (etiketter nevroner) primære antistoffer har vært reist i samme vert. Dette er viktig hvis forskerne velger å identifisere spesifikke IC subtyper samtidig som de blir nødt til å bruke primære og sekundære antistoffer oppvokst i en annen vertsarter.
   2. Fjern Triton-X-løsning, og uten å vaske vevet legge en 1: 250 fortynning (fortynnet i 1 x PBS) av en NKA monoklonalt antistoff (α-5) for å detektere NKA-rike celler og en sebrafisk spesifikke nevronale antistoff (Zn-12) å detektere nervefibre (primære antistoff) og inkuberes på en ristemaskin i 6 timer ved RT, eller O / N ved 4 ° C.
7. Vask det primære antistoff 3 ganger i 3 minutter hver ved hjelp av 1 x PBS. For å gjøre dette, må du fjerne den primære antistoffet løsning fra røret ved utsuging det ut ved hjelp av en pipette.
8. Forberede sekundært antistoff ved en1: 200 fortynning ved å blande 5 mL av lager sekundært antistoff i 995 mL av 1x PBS. Anvende sekundært antistoff (Alexa Fluor 488) og inkuberes i 6 timer ved romtemperatur, eller O / N ved 4 ° C på en ristemaskin.
   MERK: MitoTracker Red er spent på en ~ 594 nm bølgelengde og vil fluorescere rødt. Et sekundært antistoff som blir eksitert ved et ~ 488 nm bølgelengde og fluorescerer grønt må brukes for å merke NKA og Zn-12 primære antistoffer.
9. Fjern overskudd av sekundært antistoff ved vasking av vevet tre ganger i 5 minutter hver (som beskrevet i trinn 3.7).

4. Imaging

1. Etter vask, montere vev på en konkav lysbilde for hele mount konfokal avbildning av celler og nervefibre. Å montere vev, først plassere den i en dråpe (200 mL) av 1x PBS på en flat objektglass. Dette sikrer at vevet ikke tørke ut.
2. Separer gjelle hemibranchs med de buede mikro saks. Plasser en dråpe 1x PBS og en dråpe monterings media til en konkav lysbilde.
3. Plasser de separerte hemibranchs inn den konkave lysbilde med forkanten av filamentet vendt oppover og dekk med et dekkglass. DAB kantene av dekkglass med neglelakk for å hindre at dekkglass fra å bevege seg rundt og fortrenge vev. Tillat vevet fikk sette seg på bunnen av den konkave glide for 10 - 15 min før avbildning.
4. For hver gill bue, velger seks gjellefilamenter på måfå for bildebehandling, produsere seks bilder per gill bue. Bruk vanlig konfokalmikroskopi til bilde vevet ved å ta 1 - 3 mikrometer optiske skiver.
   MERK: Eventuelle forhånds eksisterende celler vil bli merket med MitoTracker Red og positiv for NKA vil dukke gul bare. Celler som vises røde bare er pre-eksisterende ICs som ikke inneholder NKA. Noen nylig proliferated celle vil bare være positivt for NKA og vil vises grønt bare. Nervefibrene vil også vises grønt.

5. Bildeanalyse for Ionocyte Kvantifisering

1. For each gjellefilament som har blitt fotografert, kvantifisere ICs og tilhørende innervasjon ved å bla gjennom deler av Z-stakken og telle antall lamellære og filamental ICs stede og hvorvidt de er nylig differensiert, pre-eksisterende, og / eller innervert .
2. Kvantifisere ICs per filament eller per område (mm ²⁾ av filament. Gjør dette ved å bruke tegneverktøy i forbindelse med programvaren som brukes til å skaffe bildene for å skissere lameller av filamentet som omfatter området av filamentet der ICs ble kvantifisert. De fleste konfokalmikroskoper bildebehandlingsprogrammer har muligheten til å beregne arealet av en skissert region på bildet. Bruk alternativet i bildebehandlingsprogrammer som lar deg gjøre dette for å erverve området.
3. Fordel telles ICs med arealet beregnet ved programvaren for å oppnå et mål på kretser per flateenhet (f.eks per ^mm2).

Representative Results

Figur 1 illustrerer operasjonen tabell satt opp (figur 1A), plassering av fisken under operasjonen (figur 1B), og de ​​tre viktigste trinn for tidsdifferansen fargingsteknikk (figur 1C). I trinn 1, blir fisken holdt i 30 min i en godt utluftet vannbad ved 25 ° C i mørket. I løpet av 30 minutters periode, kan forskeren forberede mitokondrie-rik fargestoff alikvot i DMSO som tilsettes til vannet i trinn 2 (figur 1C). Inkubasjonstiden i trinn 2 gir mulighet for opptak av mitokondrie-rik fargestoff fra vannet inn i mitokondrie-rike celler (dvs. IC). Fisken kan da enten gjennomgå full bilateral denervering prosedyre eller en narre fremgangsmåte hvor fisken bedøves og opercula manipulert, men nervene forblir intakt. Den er satt opp i trinn 3 gir en resirkuleringskammer utstyrt med rennende vann for en fisk som har either gjennomgått total bilateral denervering eller en "falsk" prosedyre.

Etter hvileperiode, ble fisken avlives og gjellene ble skåret ut og fikset for immunhistokjemi. Den generelle fordeling og innervasjon av kretser på gjellefilament av en fisk som hadde gjennomgått en "sham" prosedyre er vist i figur 2. ICS er tilstede på filamental epitel, så vel som på basis av de interlamellær regioner. Figur 2a viser pre-eksisterende ICs merket med mitokondrie-rik fargestoff (dvs. disse ICs eksisterte før denervering / humbug prosedyrer ble utført). Figur 2B viser nervefibre innervating de pre-eksisterende og nydannede ICs (identifisert av NKA immunoreaktivitets) av filamental og lamellær epitel. Endelig sammenslåing av de to bildene (figur 2C) avslører tydelig pre-eksisterende ICs (se gul) og de ​​nye ICs (vises grønt).Figur 2D er et representativt diagram over IC kvantifisering for filamentet vist i figur 2A-C. På denne spesifikke filament, det synes å være et større antall nylig proliferated ICs per mm ² enn pre-eksisterende ICs (N = 1). Å fjerne kilden til ytre branchial innervering ble IX og X hjernenerver (extrinsic innerverte) kuttet. Figur 3A viser rygg regionen i opercular hulen etter gjellefilamenter og epitel dekker nervene ble fjernet for å avdekke IX og X hjernenerver (angitt med romertall) som spenner fra to store nervebadebukser innervate alle fire buer (figur 3A); gjellebuene er nummerert fra 1 til 4. Figur 3B-E illustrere selektiv denervering av den første gjellebuen. Den første gjellebuen er innervert av både IX og X-hjernenerver (figur 3B) som kan fjernes uten å påvirke innervasjon til resten of gjellebuene (Figur 3C-E). Full bilaterale denervering resulterer i gradvis tap av ytre innervering til gjellefilamenter (4A-C). Kontroll fisk oppviser en tydelig nervebunt som strekker seg over lengden av filamentet (figur 4A). Full bilateral denervering resultert i noe tap av ytre innervering etter to dagers restitusjon (Figur 4B). Ytterligere bortfall av ytre innervering ble notert etter fem dagers restitusjon fra denervering (Figur 4C). Eventuelle gjenværende innervasjon til ICs etter fem dagers restitusjon antagelig stammet fra nervene med celle organer innenfor gjellefilament (intrinsic innervasjon, figur 4C).

Figur 1. Eksperimentell satt opp for denervering måten og rekkefølgen av trinnene som brukes itid differensial farging teknikk. (A) Kirurgi bord satt opp for denervering prosedyre viser anestesi og oppsamlingstankene. (B) Eksempel på plassering av en bedøvet, intubert fisk. (C) Nøkkel trinnene som brukes i tidsdifferansen farging teknikk. I trinn 1, blir fisken plassert i et temperaturkontrollert, statisk oksygenert vannbad i 30 min. Mitokondrie-rik fargestoff tilsettes i trinn 2 til en sluttkonsentrasjon på 0,1 uM og fisken får lov til å bade i oppløsning i minst 4 timer. Vannføring startes på nytt i trinn 3 og da fisken gjennomgår enten en full bilateral denervering av gjelle eller humbug kirurgi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/>
Figur 2. Lys mikrografer som representerer tidsforskjellen farging teknikk i en gullfisk (akklimatisert til 25 ° C) to dager etter full bilateral denervering. (A) Fordelingen av pre-eksisterende ionocytes (ICs, piler). På ett gjellefilament er avslørt av mitokondrie-rik fargestoff flekker (B) Fordelingen av ICs (nye og pre-eksisterende) og branchial nerver (stiplede piler) avsløres ved farging med α-5 og Zn-12-antistoffer, henholdsvis. Pilene viser ICs (C) Overlappingen av (A) og (B) skiller mellom eksisterende ICs. (Se gul ut, indikert av pilspisser) fra nylig proliferated ICs (vises grønn, indikert med piler). Sett i (C) er en forstørrelse av en innervert eksisterende ionocyte. (D) Representative graf av IC kvantifisering for filamentet vist i panel (AC). N = 1. Scale bar i panelet (C) er 50 mikrometer og gjelder for alle paneler./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Representative bilder som viser ulike stadier av gjelle innervasjon. (A) Dorsal visning av munnhulen viser IX og X hjernenerver innervating alle 4 gjellebuene. Gjellebuene er nummerert 1-4. Gjellefilamenter og vevet som dekker nervene ble fjernet for å bedre visualisere innervasjon. (B) Den ^1. og 2 ^nd gjellebuene er atskilt for å avsløre den sanseorgan og grener av IX og X hjernenerver innervating 1 ^st gill bue. (CE) Sekvens av bilder som viser den selektive denervering av ^1. gjellebuen ved å skille grener av IX og X hjernenerver. For en skjematisk representasjon av gjelle innervering av beinfisk, se Figur 1 i Milsom et al ²⁶ De hvite linjer i bildene er vann refleksjon fra mikroskop lys.; de ikke definere noen morfologiske strukturen. Skala bar i panelet (E) er 4 mm og gjelder for alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Lys mikrografer viser fordelingen og innervasjon av ionocytes på en enkelt filament av ^1. gjelle bue av en gullfisk akklimatisert til 25 ° C. Ionocytes (merket med piler) ble farget med α-5 antistoff og nerver (indikert by piler) ble farget med Zn-12 antistoffet. (A) Gill filament av en kontrollfisken viser en sentral nerve bunt antagelig stammer fra IX og X nerver (extrinsic innerverte) med omfattende lamellar forgrening. Noen av ionocytes indikert er også innervert (innsats). (B) En gjellefilament to dager etter full bilateral denervering. Det var en reduksjon av det sentrale nervebunt mens lamellær innervasjon dukket opp i stor grad intakt. (C) En gjellefilament 5 dager etter full bilateral denervering viser at ytre innervasjon var i stor grad fraværende. Kvalitativ analyse antyder at full bilateral denervering forårsaker nedbrytning av ytre gjelle innervasjon og samtidig opprettholde nervene med celle instanser innenfor gjellefilament (intrinsic innerverte) skape et nettverk av nerver gjennom glødetråden og inn i lamellene. Vennligstklikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Tidsdifferansen flekker teknikken kan være et nyttig verktøy for å forstå den dynamiske regulering av ion opptak og for å undersøke den tidsmessige omfordeling av ICs i gjelle epitel. Selv en enkel prosedyre, er det en rekke viktige punkter som er avgjørende for å lykkes med tidsforskjellen farging teknikk. Gullfisk må bli utsatt for mitokondrie-rik fargestoff for den avsatte tiden i protokollen. Kortere eksponeringer vil resultere i dårlig opptak av fargestoffet av mitokondrie-rike celler (dvs. ionocytes). Under fiksering, må gjellevevet skal kuttes fra raskt og holdt i mørket for å unngå fotobleking. Vevet må behandles for avbildning innen 2 uker etter fiksering. Under den bilaterale nerve seksjonering prosedyre sikre at fisken er godt bedøvet; nerver og blodårer er klart identifisert; og fisken gjenopptar fulle opercular funksjon før det flyttes til et oppsamlingstanken.

"> The FW miljø presenterer fisk med den doble utfordringen med å balansere passive ion tap og osmosevann gain ^14. Balanseringen av passive ion tap skjer via den aktive opptak av salt over ICs som er lokalisert til filamental og lamellær epithelia hvor de kan ta direkte kontakt med det ytre miljø ^2,4,8,9,16. Men er ikke statisk plasseringen av ICs på gjelle. I løpet av de siste tre tiårene en rekke studier har vist at flere FW fiskearter, når møtt med en ionisk og / eller temperatur utfordring, redistribuere branchial ICs fra filamentet eller base av lamellen til de mer fjerntliggende områder av lamellen ^{1,2,4,5,17-21.} En slik fordeling kan øke tykkelsen på lamellene som kan kompromittere gassoverføring (O _2, CO ₂₎ over gjelle epithelia ^22. Forskere har brukt tid differensial farging teknikken beskrevet i dette manuskriptet å spore flytting og emergence av nye ICs på gjelle epithelia under disse ulike eksperimentelle forhold (figur 1C) ^1,4,5.

Gjellene, og formodentlig branchial ICs, innerveres av IX og X hjernenerver ^7,23-25. Disse nervene bære både efferente og afferente innganger til og fra gjelle, respektivt. De er plassert på ryggsiden av det bukkale hulrom bak ^4. gjellebuen. Tilgjengeligheten av nerver og hvor lett det bilaterale denervering prosedyre kan utføres er artsspesifikk. I ørret, for eksempel, den spisse og avflatet anatomi av hodet gjør det mulig for nervene til å ligge i et enkelt plan bak ^4. gjellebuen under et tynt lag av vev. Dette gjør nervene synlig og lett tilgjengelig for forskeren å utføre denervering prosedyre. I kontrast, gullfisk har en kortere snute og et rundere hode. De IX og X hjernenerver av gullfisk ligge dypere inn i rygg side av hulrommet etter den ^4. gill bue opptar forskjellige plan. Denne orienteringen begrenser den enkle tilgangen til nerver og krever en mer forsiktig tilnærming til å identifisere og skille de riktige nervene. Formålet med denervering prosedyren er å fjerne sensorisk afferente og efferente inngang til og fra gjelle, respektivt. Denervering av gjellebuene kan også være kombinert med ion flux eksperimenter ved hjelp av radioisotoper (f.eks ²² Na). Disse teknikkene kan benyttes i tandem for å undersøke bidraget av nervøs inngang på ione-bevegelse på tvers av gjelle epitel. En annen begrensning til denervering Prosedyren er den manglende evne til å skille mellom sensoriske og motoriske nerveceller, og dermed når avskjæringen av nerven bunt er det mulig at begge typer av innervasjon blir fjernet. Adskillelse eventuelle motoriske nevroner kan påvirke gjelle og opercular bevegelse av fisken. Dermed når du utfører gjelle denervering eksperimenter er det viktig å også overvåke ventilasjon etterfisk har kommet seg fra prosedyren for å sikre at det er tilstrekkelig gill bevegelse for både gass og ionebytting.

Protokollene er beskrevet i dette manuskriptet bruk voksne dyr holdes på en 12:12 lys: mørke syklus og fôres kommersielle mat pellets. Disse fremgangsmåter kan modifiseres på flere måter. For det første kan restitusjonsperiode etter mitokondrie-rik fargestoff eksponering tilpasses kravene til forskeren protokoll (f.eks, 1, 3, 5 eller 14 dager). Den lengste perioden med bedring etter mitokondrie-rik fargestoff eksponering i laboratoriet har vært 14 dager ^4,5. Det var ikke en signifikant reduksjon i intensiteten av fluorescensen av mitokondrie-rik fargestoff etter 14 dager med utvinning. For det andre er anvendelse av α-5 primære antistoff begrenset til kun å identifisere NKA-rike celler og skiller ikke mellom de forskjellige subtyper av branchial kretser. Heldigvis, i gullfisk ble det slått fast at flertallet av ICs er begge mitochondrion-rik (etikett med MitoTracker) og NKA-rik (etikett med α-5) celler som kanskje ikke er tilfelle i alle fiskearter ^4,27. Fremtidige eksperimenter kan fokusere på å følge tidsmessige omfordeling av spesifikke IC undergrupper ved hjelp antistoffer rettet spesifikt mot en rekke kanaler, pumper og vekslere (f.eks NHE, H ⁺ pumpe). Tidligere studier har funnet at flertallet av ionocytes farget med mitokondrie-rik fargestoff utstillings NKA immunoreaktivitets ^4. Innervasjon av de kretser kan detekteres ved hjelp av et primært antistoff mot sebrafisk-avledet neuron-spesifikk antigen (Zn-12). I denne studien α-5 og Zn-12 primære antistoffer ble detektert ved hjelp av den samme sekundært antistoff (Alexa Fluor 488) for begge. Denne begrensning skyldes både primære antistoffer ble økt i en mus vert og er overvunnet ved det faktum at de NKA-rike celler og nevroner kan skilles morfologisk selv om de fluorescerer samme farge. Sekvensiell fargingmed forskjellige sekundære antistoffer (f.eks, først α-5 med Alexa Fluor 488 da Zn-12 med Alexa Fluor 594) kan også brukes til å eliminere problemet med å ha begge merkene fluorescerende samme farge. Til slutt kan hele bilateral nerve seksjonering protokollen endres for å målrette nerver til bestemte gjellebuene. For eksempel, kan selektiv nervesnitte utføres på den første gjellebuen ved forsiktig å separere de første og andre gjellebuer for å eksponere nerver som fører til den første gjellebuen på den dorsale ende av gjelle kurven (figur 2B-E). Tidsforskjellen teknikken kan også bli anvendt for å studere fordeling av ionocytes i larvesebrafisk fisk som de utvikler og ionetransport overganger fra huden til gjelle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MitoTracker Red	Life Technologies	M-7512
Dimethyl sulfoxide	Sigma Alrdich	D2650
α-5 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	a5
zn12 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	zn12
Alexa Fluor 488 (anti mouse)	Life Technologies	A-11001
Benzocaine	Sigma Alrdich	E1501	4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	straight
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11001-12	curved
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
Tissue retractor	Fine Science Tools	17009-07
Paraformaldehyde	Sigma Alrdich	P6148
Triton X	Sigma Alrdich	X100
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200