Introduction
ההיפוקמפוס ממלא תפקיד חשוב בזיכרון ולמידה, כמו גם התנהגות רגשית. פונקציה העיקרית אחת מורכבת מהאיחוד של זיכרון לטווח קצר לזיכרון לטווח ארוך, אשר דורש גמישות גבוהה של מערכת העצבים. Gyrus המשונן של ההיפוקמפוס פועל כשער העיקרית למידע קלט, והוא גם אחד משני אזורים במוח עם neurogenesis המתמשכת לאורך בגרות 1,2. הפיתוח של המבנה בהיפוקמפוס מתרחש במהלך עובר מאוחר ובמיוחד בלידה 3 עד 4 שבועות הראשון 3. במהלך ההתפתחות המוקדמת של המשונן gyrus בריכת תאי גזע הוקמה דרושה ללידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים 4. נוירונים פיתוח עוברים דרך שלבים שונים, מתאי הגזע דרך מספר שלבים של תאי אב ללא בשלה ולבסוף נוירון הבוגר במהלך לידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים. בשלבים שונים של neurogenesis הביטוי שלגנים ספציפיים נדרש כדי לאפשר ההבשלה ואינטגרציה של נוירונים חדשים לתוך המעגלים בהיפוקמפוס 5,6.
שימוש בגנטיקת עכבר וניתוח הפנוטיפ על ידי אימונוהיסטוכימיה כמו גם שיטות מולקולריות אפשר הגדרת דפוס ביטוי ותפקודם של רבים מהגנים האלה. בניתוח microarray בנוסף, כמו גם immunoprecipitation הכרומטין (שבב) סיפק מידע על גני מטרה ישירים ועקיפים פוטנציאל 7,8. עם זאת, יש עדיין שאלות רבות פתוחות בנוגע למנגנוני הרגולציה של פיתוח בהיפוקמפוס, בפרט הפיתוח של הגירוס המשונן. כדי להשיג תובנה נוספת כיצד גנים מסוימים מוסדרים מערכת נדרש המאפשרים המניפולציה של מספר קטן של תאים על ידי למטה או למעלה-רגולציה של הגן של ריבית ו / או גני המטרה שלה ולעקוב אחרי גורלם בפיתוח. ברחם electroporation של shRNAs, cDNA של גנים של עניין או recombina Crese מספק כלי כזה. כדי להבטיח את הנוכחות של פלסמידים ביטוי ה- DNA הרצוי או RNA הקטן אמורים לשמש עבור electroporation. גישה זו מיושמת בהצלחה רבה בלימוד פיתוח קליפת המוח 9,10, אך היא גישה מאתגרת יותר בוחנת את התפתחות gyrus המשונן בשל המיקום של המבנים בהיפוקמפוס בשכבות עמוקות יותר במוח.
electroporation ברחם לשעבר ואחריו התרבות הפרוסה organotypic הוא גישה אחת לעקוף בעיה זו 11,12. בניגוד לelectroporation ברחם לא כל העובר אלא רק את הראש משמש מאפשר לכן להציב את האלקטרודות באופן חיובי יותר לכוון את shRNA / DNA להיפוקמפוס והגירוס המשונן. הקבוצה שלנו מועסקות בהצלחה electroporation לשעבר הרחם כדי ללמוד את התפקיד של גורם שעתוק Bcl11b במהלך פיתוח gyrus המשונן 8. יש Bcl11b תפקיד כפול בפיתוח gyrus המשונן על ידי regulating התפשטות תאי אב, כמו גם בידול כפי שהודגם על ידי אימונוהיסטוכימיה. כדי להגדיר מנגנון למעורבות Bcl11b בתהליכים אלה נוספים, פרוטוקולים של קבוצת Polleux 11,12 הותאמו ללמוד gyrus המשונן כמתואר להלן בסעיף הפרוטוקול. בגישה ראשונה השאלה הופנתה אם Bcl11b הוא מסדיר תא התמיינות תאים עצבי אוטונומית. גישה שנייה בדקה האם Desmoplakin, גן המטרה ישיר של Bcl11b, די בכך כדי להציל את הפנוטיפ Bcl11b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לחוק הגרמני ואושרו על ידי משרדי הממשלה בטובינגן.
1. הכנת Micropipettes, פתרונות וממברנות
- הכנת Micropipettes
- משוך micropipettes זכוכית באמצעות חולץ micropipette עם התכנית הבאה: חום: 540, משוך: 125, מהירות: 20 ועיכוב: 140. כמויות אורך המחט ל -5.5 סנטימטר.
- מחטי פוע באמצעות microgrinder להשיג גודל קצה מתאים של 4 מ"מ. אחסן את המחטים בקופסא או 15 סנטימטר צלחת פטרי כדי למנוע פגיעה של הטיפים.
- הכנה של פתרונות
- פלסמיד דנ"א פתרון
- הכן את ה- DNA פלסמיד המכיל את מבנה cDNA הרצוי באמצעות ערכת Maxi-הכנת רעלן פנימית ללא על פי הפרוטוקול של היצרן.
- התאם פתרון פלסמיד DNA לריכוז סופי של 3 מיקרוגרם / μl (ללא וקטור ספייק GFP) או 4 מיקרוגרם /μl (עם 1 מיקרוגרם של וקטור ספייק GFP) ברעלן פנימי לשחרר חיץ טריס-EDTA המכיל גרין המהיר (ריכוז סופי של 0.05%).
- פתרון במלאי Laminin
- לפזר 1 מ"ג של laminin במים סטריליים כדי נפח סופי של 1 מיליליטר. הכן 100 aliquots וחנות μl ב -80 ° C.
- פולי-L ליזין פתרון במלאי
- לפזר 50 מ"ג של פולי-L ליזין ב 50 מיליליטר של מים סטריליים לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. הכן 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב-20 ° C.
- השלם מאוזן תמיסת מלח של האנק (שלם HBSS)
- הכן HBSS השלם על ידי שילוב של 10x HBSS 100 מיליליטר, 2.5 מיליליטר של חיץ 1 M HEPES (pH 7.4), 30 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז, 10 מיליליטר של 100 מ"מ CaCl 2, 10 מיליליטר של 100 מ"מ MgSO 4, ו -4 מיליליטר של 1 M NaHCO 3. מוסיף מים עד לסטרילי 1 ליטר ולאחסן ב 4 ° C.
הערה: החיטוי כל הפתרונות מצפים 1 M HEPES חיץ ו1 M D-גלוקוז, אשר filter מעוקר.
- הכן HBSS השלם על ידי שילוב של 10x HBSS 100 מיליליטר, 2.5 מיליליטר של חיץ 1 M HEPES (pH 7.4), 30 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז, 10 מיליליטר של 100 מ"מ CaCl 2, 10 מיליליטר של 100 מ"מ MgSO 4, ו -4 מיליליטר של 1 M NaHCO 3. מוסיף מים עד לסטרילי 1 ליטר ולאחסן ב 4 ° C.
- Slice תרבות בינוני
- להכין מדיום התרבות פרוסה על ידי הוספת 35 מיליליטר של Basal נשר בינוני, 12.9 מיליליטר של HBSS המלא (1.2.4), 1.35 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז, 250 μl של L-גלוטמין 200 מ"מ, ו -500 μl של פניצילין, סטרפטומיצין ל להשיג נפח סופי של 50 מיליליטר. להוסיף סרום סוס לריכוז סופי של 5% וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
- נקודת התכה נמוכה (LMP) Agarose
- הכן 4% פתרון agarose LMP על ידי הוספת 2 גרם של LMP agarose 50 מיליליטר של HBSS המלא (1.2.4) ואחריו על ידי חימום במיקרוגל במשך 1-2 דקות בעצמה גבוהה. שמור פתרון זה באמבט מים ב 37 - C ° 39. אחסן את הפתרון ב 4 ° C. והשימוש חוזר.
- פתרון paraformaldehyde
- במנדף להכין פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) על ידי הוספת 4 גרם של paraformaldehyde לשל 1x PBS 100 מיליליטר. מחממים את הפתרון עד 60 ° C ולהוסיף כמה טיפות של 1 N NaOH עד הפתרון הופך גליר.
- Permeabilization פתרון
- לפזר 9 גרם של BSA ב300 מיליליטר של 1x PBS המכיל Trition 0.3% X-100 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף 10% אזיד הנתרן לאחסון ארוך טווח.
- פלסמיד דנ"א פתרון
- ציפוי של הוספת ממברנה
- לדלל aliquot אחד פתרון מניות laminin (1.2.2) וaliquot אחד פתרון poly-L ליזין מניות (1.2.3) במים סטריליים כדי נפח סופי של 12 מיליליטר.
- הנח מוסיף קרום ל6 צלחות גם עם כל 2 מיליליטר המכיל גם של מים סטריליים. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת ציפוי על גבי קרום דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2.
- לאחר הדגירה לשטוף את הקרום מוסיף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של מים סטריליים ויבשים. השתמש מוסיף קרום מצופה באותו היום או בחנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד ארבעה שבועות בצלחת גם יבשה 6.
2. הזרקת DNA וElectroporation של E15.5 וE18.5 עוברים
- להרדים את העכבר הלא-מודע על ידי נקע בצוואר הרחם ביום עוברי (E) 15.5 או 18.5. לנתח את הרחם המכיל את העוברים 13 ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי המכילה 15-20 מיליליטר של HBSS המלא הקר.
הערה: מנקודה זו ואילך, לשמור על העוברים ורקמות על קרח. - השתמש במספריים כדי להפריד בין עובר מקרן הרחם והמקום לתוך צלחת פטרי המכילה HBSS שני מלא קר.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, לנתק את קיר שריר רחם והשליה באמצעות זוג מלקחיים בסדר (# 55) ומספריים. זהירות לשחרר את העובר מן שק החלמון.
- השתמש במספרי בון לdecapitatדואר העוברים מעל forelimbs בזווית 60 מעלות. אם הניסוי דורש genotyping של העוברים, לאסוף דגימת רקמה לבידוד הדנ"א הגנומי (חתיכה קטנה של זנב).
- העבר את הראש בצלחת פטרי נקייה ויבשה. בגלל הראש נערף בזווית 60 מעלות, הראש צריך להטות לצד אחד כאשר הניחו בצד את גב.
- הנח מחט בזהירות לתוך אמצע הקרוב חצי הכדור לגבחת (איור 1 א ', ב'). להזריק כ 2-3 μl (ב 3 או 4 מיקרוגרם / μl) של פתרון ה- DNA על ידי דריכה על הדוושה של Picospritzer III באמצעות 30 ק"ג של לחץ למשך 10-15 אלפיות שני לכל דופק, החלת 5-8 קטניות. המשך ומספר הפעימות תלויים בקוטר של פתיחת המחט עם פתחים קטנים יותר הדורשים יותר זמן. המרווח בין דופק בכל מסתכם לסך של 1 שניות.
- לפני הנחת האלקטרודות, חלים כמה טיפות של HBSS המלא על ראשו של embrיו. הנח את האלקטרודות בצורה כזאת, כי המסוף 'השלילי' הוא באותו הצד כמו החדר המוזרק ואלקטרודה 'החיובית' בצד השני של החדר המוזרק מתחת לאוזן של ראשו של העובר (איור 1 ג, ד). החל 5 פולסים של 50 V.
- השתמש 3 אלקטרודות מ"מ לE 15.5 ו -5 מ"מ אלקטרודות לE 18.5.
3. Dissection של המוח
- לאחר electroporation, לקלף את העור מהראש בעזרת זוג מלקחיים בסדר. באמצעות מספריים האביב לעשות חתך קטן באמצע של המוח הקטן בקו האמצע של הגולגולת.
- הכנס את המספריים האביב לתוך החתך וחתך אורכית לאורך תפר sagittal. לקלף את הגולגולת ולנתק את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים בסדר. העבר את המוח כולו לתוך 15-20 פתרון HBSS מלא קר מיליליטר.
- , בינתיים לשפוך 4% agarose LMP,המשיך ב37-39 מעלות צלזיוס באמבט מים, לתוך תבנית קליפה משם.
- קח את המוח של HBSS השלם על ידי מרית סקופ קטנה וניקוז עודף של HBSS באמצעות נייר טישו קנס או Kimwipes.
- מניחים את המוח כולו בעדינות לתוך agarose ולשנות את המיקום שלה עם מחט דקה. שמור את התבנית על קרח עד agarose הוא מוצק והבלוק מחולק (לסעיפי העטרה נורות הריח מצביעות למעלה).
4. חתך vibratome וSlice תרבות
- חתוך את אבני agarose LMP ולהדביק אותם לבמה הדגימה באמצעות "דבק סופר". לאחר הדבק היא העברה יבשה שלב הדגימה למגש החיץ של vibratome ולמלא עם קרח קר להשלים HBSS עד הבלוק הוא שקוע בפתרון.
הערה: לעקר את כל משטחי המכשיר וציוד עם אתנול 70% לפני חתך. - הכן 250 מיקרומטר סעיפי vibratome עבים באמצעות סכין חדש ואחרי.
- חתוך את wi הבלוקה ההגדרות הבאות; תדירות - 60 הרץ, משרעת - 0.7 מיקרומטר, מ"מ 16-18 מהירות / sec. חותך את הקטעים המכילים רקמה הרצויה עם ההגדרות לעיל במהירות איטית (9 מ"מ / sec). החל חתך מהמוח האחורי, לאסוף 5-7 חלקים מהמוח.
- העבר את החלקים למנת תרבות נקייה 6 היטב המכילה 5 מיליליטר של קרח קר להשלים HBSS בעזרת מרית כפופה ולשמור על קרח עד שכל החלקים נאספים (איור 1E).
- להרטיב את הקרום באופן צולב עם של HBSS המלא 100 μl לפני הנחת הסעיפים על הקרום, כדי להקל על ההתמצאות של הסעיפים.
- העבר את החלקים בעזרת מרית כפופה על הממברנה (להרים פינה של הסעיף עם מלקחיים ולמשוך אל המרית ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי לדחוף את הסעיף על הממברנה). הנח עד חמישה חלקים בקרום אחד ולארגן באמצעות מלקחיים (איור 1F). אינו חופף חלקים אחד עם השני.
- קח את עודף HBSS את הקרום בעזרת פיפטה. הקרומים הספציפיים משמשים כאן מחוברים למסגרת ומוכנסים לתוך צלחת תרבית רקמה, המאפשרת לרקמה להיות בקשר אבל אינו מכוסות על ידי המדיום.
- מניחים את הקרום מוסיף לצלחת 6 היטב המכילה 1.8 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה (1.2.5) (איור 1G, H). דגירה צלחת התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 11 או 14 DIV DIV. לשנות מחצית בינונית (0.9 מיליליטר) בכל יום שני.
הערה: בשלב זה, להוסיף חומרים כימיים כמו Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 מיקרומטר ריכוז סופי) לתיוג תאים מתרבים בתקשורת במשך 20 שעות הראשונות של זמן התרבות.
5. קיבוע של הסעיפים ואחריו Immunofluorescence מכתים
- השתמש בלהב סכין מנתחים נקי וחד לחתוך ולקצץ את הקרומים בהתאם לאורינטציה שלהחלקים.
- העבר את החלקים יחד עם הקרום לצלחת 24 היטב המכילה 1 מיליליטר של 4% PFA (1.2.7). דגירה הסעיפים עבור שעה 1 ב RT ואחריו 3 שוטף עם 1x PBS במשך 15 דקות כל אחד. דגירה הסעיפים O / N עם פתרון permeabilization על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- למחרת, דגירה הקטעים עם נוגדנים ראשוניים מתאימים, בדילול מלא בפתרון permeabilization, O / N או במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- לשטוף את הסעיפים 3 פעמים למשך 15 דקות עם 1x PBS ודגירת O / N ב 4 ° C עם הנוגדנים משני המתאימים מדוללים בפתרון permeabilization.
- לאחר הדגירה עם נוגדנים משני, לשטוף את החלקים פעם עם 1x PBS במשך 15 דקות ואחריו מכתים DAPI במשך 10 דקות.
- לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם 1x PBS במשך 15 דקות כל אחד ולהעביר לשקופיות מיקרוסקופ. להוסיף ImmunoMount ומניח בעדינות coverslip על גבי החלקים. ייבש את השקופיות O / N ב 4 ° C וseאל עם לק.
הערה: שמור את השקופיות תמיד על 4 מעלות צלזיוס.- נתח את התרבויות הפרוסה על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 1 ט).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אבלציה של גורם שעתוק Bcl11b גורמת לירידת ערך של התפשטות תאי אב והבחנה עצבית וכתוצאה מכך בגודל המוקטן המשונן gyrus ומספר תא. יתר על כן תאי עצב מוטציה אינם מצליחים להשתלב במעגל בהיפוקמפוס גורם למידה וזיכרון ירידת ערך 8. כדי לענות על שאלות הנוגעות למנגנון הרגולציה (ים) של Bcl11b בתהליכים אלה electroporation ברחם לשעבר הועסק.
בהתייחסו לשאלה האם Bcl11b תא-אוטונומי מווסת את התמיינות תאים עצבית, מחיקות פסיפס של Bcl11b נוצרו על ידי electroporation לשעבר הרחם של מבנה recombinase GFP- Cre או GFP לבד 11 לBcl11b flox / flox hippocampi בE15.5 ואחריו התרבות הפרוסה organotypic עד עד 18 ימים לאחר electroporation (איור 2 א, B; איור זה שונה מ8). כדי לקבוע אם Bcl11ב מסדיר התמיינות של תאי גרגיר תא-אוטונומי מכתים immunofluorescence בוצע באמצעות נוגדנים ספציפיים הכרת NeuroD כמו גם GFP. NeuroD בא לידי ביטוי בשלבי mitotic 2b / 3 ותאי postmitotic המוקדמים 14. הראינו בעבר כי מספר התאים החיוביים NeuroD הוא גדל באופן משמעותי במוטציות מותנות Bcl11b מצביעות מעצרו של בידול עצבי 8. בעוד שמספר תאי GFP חיוביים לבד ותאים חיוביים / NeuroD GFP לא היה שונה בתאי בקרה ומוטצית גידול משמעותי בתאים חיוביים NeuroD נצפה ברכס המשונן שבו תאים שקיבלו recombinase Cre (איור 2 ג; נתון זה כבר שונה מ -8). מציאת תאים חיוביים NeuroD לא רק בתאים שקבלו recombinase Cre אלא גם בתאים פרא-סוג הציעה כי מנגנונים עקיפים מעורבים בויסות Bcl11b של התמיינות תאים עצבית. מתוך נתונים אלה, עם זאת, additפונקציות תאים אוטונומיים ional של Bcl11b לא ניתן לשלול.
בעבר, Desmoplakin נקבע כגן מטרה ישיר של Bcl11b 8. כמו כן הראה כי Desmoplakin הוא מעורב בוויסות של התפשטות תאי אב ובידול של קרטינוציטים 15. כדי להדגים אם Desmoplakin מעורב בוויסות של התפשטות תאי אב ו / או הבחנה עצבית של פלסמיד דנ"א gyrus המשונן להביע GFP לבד או GFP וDesmoplakin תחת שליטת יזם CMV היה electroporated לשליטה ומוח המוטציה Bcl11b (איור 3 א - C; נתון זה שונה מ8). פרוסות המוח היו בתרבית במשך 20 שעות הראשונות בנוכחות BrdU (ריכוז סופי 10 מיקרומטר). ביום 11 אחרי electroporation התרבויות הפרוסה היו קבועות ואחריו immunostaining BrdU ואת מספר התאים החיוביים BrdU נקבע. Bcl11b tissu מוטציהדואר electroporated עם GFP הכיל רק תאים חיוביים BrdU באופן משמעותי פחות בהשוואה לרקמות שליטה. עם זאת, שיתוף electroporation של ה- GFP וDesmoplakin הציל את מספר התאים החיוביים BrdU לשלוט ברמות (איור 3D; נתון זה שונה מ8). נתונים אלה יחדיו לאשר נוספים Desmoplakin כגן ישיר יעד של Bcl11b ותפקידה בוויסות של התפשטות תאי אב.
איור 1. סט-אפ של electroporation לשעבר הרחם והתרבות הפרוסה organotypic בE15.5. (א) הזרקה של ה- DNA לתוך חצי הכדור אחד. ציור סכמטי של הזרקת DNA (B). (ג) מיקום של האלקטרודות. (D) סכמטי ציור של מיקום האלקטרודה. (E) Vibratome חתך וhתמונת Confocal andling של חלקים במוח. (F) הצבת חלקים במוח על קרומים ספציפיים. בהיר שדה (G) וקרינה (GI) (H, GFP) ניתוח של תרבויות פרוסה ביום 1 לאחר electroporation. (I) של gyrus המשונן ביום 11 אחרי electroporation באמצעות מכתים DAPI וGFP. קו מקווקו מציין את gyrus המשונן. סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מחיקת פסיפס של Bcl11b ידי electroporation ברחם לשעבר ותרבות organotypic הפרוסה (שונה מ8). Electroporation של pCIG2 בקרת וקטור בלבד () ונגד pCIG2- Crestruct (B) לgyrus המשונן בE15.5 ואחריו התרבות הפרוסה organotypic במשך 18 ימים. סעיפים היו immunostained על ידי נוגדנים באמצעות הכרת GFP (ירוק) וNeuroD (אדום). ריבועים להציג GFP (ירוק) וBcl11b צביעה (אדום) בהגדלה גבוהה יותר להפגין אובדן ביטוי Bcl11b בתאים לבטא -recombinase Cre. ניתוח סטטיסטי של ה- GFP, NeuroD ותאים חיוביים / NeuroD GFP (C). קווים מקווקווים מציינים הגירוס המשונן. מבחן t, * p <0.005; ברים שגיאה, sd; n = 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. פנוטיפ Bcl11b הוא חולץ על ידי מחדש מבוא של Desmoplakin (שונה מ8). GFP בלבד (, B) וכן GFP וDesmoplakin (C) היו electroporated לתוך gyrus המשונן של שליטה (א) ומוטציה (B, C מוח) בE15.5 ואחריו התרבות הפרוסה organotypic במשך 11 ימים. סעיפים היו immunostained על ידי נוגדנים באמצעות הכרת GFP (ירוק) וBrdU (אדום). (ד) ניתוח סטטיסטי של תאים חיוביים BrdU. קווים מקווקווים מציינים הגירוס המשונן. ריבועים להציג צביעת Desmoplakin (ירוק) בהגדלה גבוהה יותר. מבחן t, * p <0.01; בר שגיאה, SEM; n = 4. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הרחם electroporation Ex בE 18.5 ואחריו התרבות הפרוסה organotypic.הזרקה של DNA להביע GFP לחצי כדור אחד ואחריו immunostaining ביום 16 לאחר electroporation () מכתים DAPI;. מכתים GFP (B); (ג) התמזגה תמונה. קו מקווקו מציין gyrus המשונן. סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש היפוקמפוס תפקיד חשוב בלמידה וזיכרון. Gyrus המשונן הוא גם אחד משני אזורים במוח שבו neurogenesis מתרחשת לא רק בפיתוח, אלא גם בבגרות. לאחר לידה ותמורת neurogenesis היפוקמפוס מבוגרת באופן דומה מעורב גורמים משותפים רבים. הגדרת מנגנוני הפיקוח של גורמים אלה יהיו מועילות מאוד בהבנת מחלות ניווניות אשר בתורו תוביל לטיפולים חדשים ואמצעי מניעה. כדי להשיג מידע זה דורש מערכת לתפעל תאים בודדים ולבחון אותם בסביבה הטבעית שלהם, כפי שהודגם על ידי electroporation ברחם לשעבר ואחריו התרבות הפרוסה organotypic.
electroporation ברחם לשעבר היה ראשון מיושם בהצלחה בלימוד פיתוח קליפה 11,16. למיטב ידיעתנו לבחון את התפקיד של Bcl11b בפיתוח בהיפוקמפוס הוא electroporation של D מתאר הראשון ברחם לשעברNA למשונן gyrus רקמה 8. אנחנו מבוססים הפרוטוקול שלנו בשיטות שפורסמו על ידי קבוצת Polleux לומדת פיתוח קליפת 11,12. כדי להחיל בהצלחה בשיטה זו כדי ללמוד gyrus המשונן בגודל ובמיקום של אלקטרודות צריכים להיות מותאמים. הצבת האלקטרודה השלילית בקליפת המוח בסמוך לאתר ההזרקה והאלקטרודה החיובית באתר ההפוך מתחת לאוזן שינתה את הקוטביות של electroporation והצליחה להחדיר DNA לתאים של הגירוס המשונן. הצבת אלקטרודות בצורה נכונה ויישום נוכחי של 0.06-0.08 mA התברר להיות צעדים חיוניים מאוד על מנת להשיג תוצאות משביעות רצון electroporation. כדי להשיג את הזרם המתאים ביותר תלוי בעיקר בהצבה הנכונה של אלקטרודות כפי שתואר לעיל. צעדים קריטיים נוספים של הפרוטוקול הם הזרקת החומר לתוך החדר, כמו גם טיפול בפרוסות לאחר חתך vibratome. רקמת המוח אינה קבועה לאורך כל ההליך ולכן הרקמה רכה מאוד ובקלות destroyable בעת העברה מvibratome על הממברנה לטיפוח. סעיפים גם צריכים לטפל בם בזהירות רבה כאשר מתחילים immunostaining. עם השינויים הללו ומניפולציות שיקולים של תאים בודדים של gyrus המשונן היו הצלחה מבוצעת לענות על שאלות הנוגעות לרגולצית Bcl11b של פיתוח ההיפוקמפוס המוקדם (איור 2 ו -3, זה דמויות שונו מ8).
כפי שצוין לעיל מניפולציה תאים בודדים ולבחון את גורלם הוא היתרון העיקרי של electroporation ברחם לשעבר. חסרון עיקרי של הגישה לשעבר הרחם בהשוואה לelectroporation ברחם הוא הזמן המוגבל כדי לשמור על פרוסות בתרבות. אפשר גם שתנאי גידול ברחם לשעבר עלולים לגרום לעיכוב בהתפתחות. בניסויים שלנו עד כה הצלחנו לשמור על פרוסות בתרבות up ל -18 ימים אשר תואם את הגיל של P14. טיפוח של פרוסות organotypic מעבר לכך זמן להוביל להתפרקותה של הרקמה. חסרון נוסף של גישת הרחם לשעבר הוא המספר המוגבל של עוברים שניתן electroporated לאם. בניגוד ברחם electroporation בי ניתן לטפל עד 8 עוברים מספר זה הוא מוגבל עד 4 עוברים בגישה לשעבר הרחם. Dissection של עוברים, electroporation, חתך vibratome והעברת פרוסות לתנאי תרבות יש לבצע בזמן קצר כדי להבטיח תרבויות פרוסה מוצלחות.
בגלל אירועים מרכזיים של פיתוח gyrus המשונן להתרחש בין P14 P30 וזה יהיה הכרחי כדי לשמור על פרוסות organotypic בתרבות לתקופות זמן ממושכות. בניסיון ראשון להאריך את תרבות electroporations הזמן בוצע בE 18.5 התאמת התנאים בהתאם (איור 4; ראה פרוטוקול). Electroporating בההוא נקודת הזמן מאפשרת שמירה על החלקים במוח בתרבות עד P17 או 18. בנוסף ההיווצרות בהיפוקמפוס היא פיתוח נוסף בE 18.5 בהשוואה ל 15.5 E, למשל, מבנים בהיפוקמפוס כבר נוצרו ויותר קל לזיהוי. בעתיד, אנו רוצים לבצע electroporation לשעבר הרחם באפילו מאוחר יותר נקודות זמן, למשל, P0 לP4 לבחון שינויים במהלך פיתוח gyrus המשונן עד P30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10x | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
