Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

Introduction

Гиппокамп играет важную роль в памяти и обучения, а также эмоциональное поведение. Один основная функция состоит в консолидации кратковременной памяти в долговременную память, которая требует высокой пластичности нервной системы. Зубчатая извилина гиппокампа выступает в качестве основного шлюза для ввода информации, а также один из двух областей мозга с постоянной нейрогенеза в течение взрослой жизни ^1,2. Развитие гиппокампа структуры происходит во время позднего эмбриогенеза и особенно в течение первого 3 до 4 недель послеродового ^3. Во время раннего развития зубчатой ​​извилине пул стволовых клеток, учрежденного требуется для послеродового а также нейрогенез ^4. Развивающиеся нейроны пройти через различные этапы, из стволовой клетки через несколько этапов клеток-предшественников в незрелые и, наконец, зрелого нейрона во время послеродового а также нейрогенез. На разных этапах нейрогенеза экспрессияспецифические гены требуется, чтобы созревание и интеграции новых нейронов в гиппокампе схемы ^5,6.

Использование генетику мыши и анализ фенотипа с помощью иммуногистохимии, а также молекулярные методы позволили определить характер экспрессии и функции многих из этих генов. В дополнение анализа микрочипов, а также иммунопреципитации хроматина (чип) представил информацию о потенциальных прямых и косвенных генов-мишеней ^7,8. Тем не менее, есть еще много открытых вопросов, касающихся механизмов регуляции гиппокампа развития, в частности развития зубчатой ​​извилины. Чтобы получить более глубокое представление, как специфические гены регулируются систему требуется позволяя манипулировать небольшим количеством клеток ВНИЗ или повышающей регуляции гена интереса и / или его генов-мишеней и следить за их судьбу во время разработки. Внутриутробное электропорации из shRNAs, кДНК генов интересов или Cre рекомбинацииSE обеспечивает такой инструмент. В целях обеспечения присутствия плазмиды экспрессии нужной ДНК или малых РНК должны использоваться для электропорации. Этот подход очень успешно применяется в изучении развития коры ^9,10, но более сложные подходы, изучения развития зубчатой ​​извилине из-за позиции гиппокампа структур в более глубоких слоях мозга.

Экс маточно электропорации с последующим органотипической культуры среза, является одним из подходов, чтобы обойти эту проблему ^11,12. В отличие от внутриутробного электропорации не весь эмбриона, но только головка используется позволяя таким образом, чтобы поместить электроды в более выгодном образом, чтобы направить shRNA / ДНК в сторону гиппокампа и зубчатой ​​извилины. Наша группа успешно применяются экс внутриутробно электропорации для изучения роли фактора транскрипции Bcl11b во зубчатой ​​развития извилины ^8. Bcl11b имеет двойную роль в зубчатой ​​извилине развития на гegulating пролиферацию клеток-предшественников, а также дифференцировку как было показано с помощью иммуногистохимии. Для дальнейшего определения механизма участия Bcl11b в этих процессах, протоколы группы Polleux ^11,12 доводили до изучения зубчатой ​​извилине, как описано ниже в разделе протокола. В первом приближении вопрос был рассмотрен Bcl11b регулирует ли нейронов дифференциации клеток клеточно автономно. Второй подход рассматривается ли Desmoplakin, непосредственным объектом ген Bcl11b, достаточно, чтобы спасти фенотип Bcl11b.

Protocol

Примечание: Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецким законом и были одобрены правительственных учреждений в Тюбингене.

1. Подготовка Дозаторы, растворов и мембран

1. Подготовка микропипеток
   1. Потяните стеклянной микропипетки с помощью микропипетки съемник со следующей программой: Жара: 540, Pull: 125, Скорость: 20 и задержку: 140. Длина иглы суммы на 5,5 см.
   2. Конические иглы с использованием microgrinder, чтобы получить соответствующий размер наконечника 4 мм. Храните иголки в коробку или 15 см чашку Петри, чтобы предотвратить повреждение кончиков.
2. Приготовление растворов
   1. ДНК плазмиды решение
      1. Подготовка плазмидной ДНК, содержащей нужную кДНК конструкцию, используя бесплатный Maxi-Prep Kit эндотоксина в соответствии с протоколом производителя.
      2. Регулировка раствора плазмиды ДНК в конечной концентрации 3 мкг / мкл (без GFP шип вектор) или 4 мкг /мкл (1 мкг GFP шип вектор) в эндотоксинов Трис-буфер, содержащий ЭДТА Fast Green (конечная концентрация 0,05%).
   2. Ламинин Stock решение
      1. Растворите 1 мг ламинина в стерильной воде до конечного объема 1 мл. Подготовьте 100 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° С.
   3. Поли-L-лизин Исходный раствор
      1. Растворите 50 мг поли-L-лизина в 50 мл стерильной воды до конечной концентрации 1 мг / мл. Подготовка 1 мл аликвоты и хранить в -20 ° C.
   4. Заполните сбалансированный солевой раствор Хэнка (полный HBSS)
      1. Подготовьте полный HBSS путем объединения 100 мл 10x HBSS, 2,5 мл 1 М HEPES-буфера (рН 7,4), 30 мл 1 М D-глюкозы, 10 мл 100 мМ CaCl _2, 10 мл 100 мМ MgSO _4, и четыре мл 1 M NaHCO _3. Добавить стерильной водой до 1 л и хранят при температуре 4 ° С.
         Примечание: все решения Автоклав ожидать 1 М HEPES-буфера и 1 М D-глюкоза, которые являются филтер стерилизации.
   5. Кусочек культуральной среде
      1. Подготовка ломтик культуральную среду путем добавления 35 мл базальной среды Eagle, 12,9 мл полной HBSS (1.2.4), 1,35 мл 1 М D-глюкозы, 250 мкл 200 мМ L-глутамина и 500 мкл пенициллина-стрептомицина, чтобы получения конечного объема 50 мл. Добавить лошадиной сыворотки до конечной концентрации 5% и хранят при температуре 4 ° С.
   6. Low-Точка плавления (LMP) Агароза
      1. Подготовка 4% раствора агарозы LMP добавлением 2 г LMP агарозы с 50 мл полного HBSS (1.2.4) с последующим нагреванием в микроволновой печи в течение 1-2 мин при высокой мощности. Хранить этот раствор в водяной бане при 37 - 39 ° С. Хранить раствор при температуре 4 ° С и повторного использования.
   7. Параформальдегид Решение
      1. В вытяжном шкафу подготовить 4% параформальдегида (PFA) раствор добавлением 4 г параформальдегида в 100 мл 1х PBS. Раствор нагревают до 60 ° С и добавить несколько капель 1 н NaOH, пока раствор станет CЛир.
   8. Пермеабилизирующего Решение
      1. Растворите 9 г BSA в 300 мл 1х PBS, содержащим 0,3% Trition Х-100 и хранят при температуре 4 ° С. Добавить 10% азида натрия для длительного хранения.
3. Покрытие мембранных вставками
   1. Развести одну аликвоту исходного раствора ламинин (1.2.2) и одну аликвоту поли-L-лизин раствора (1.2.3) в стерильной воде до конечного объема 12 мл.
   2. Поместите мембранные вставки в 6-луночные планшеты с каждой лунке, содержащей 2 мл стерильной воды. Добавить 1 мл раствора для нанесения покрытия на верхней части мембраны и инкубируют O / N при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубаторе.
   3. После инкубации промыть мембраны вставляет три раза 1 мл стерильной воды и высушить. Используйте покрытием мембранные вставки на тот же день или магазин при 4 ° С на срок до четырех недель в сухом 6-луночного планшета.

2. Инъекции ДНК и Электропорация E15.5 и E18.5 эмбрионов

1. Эвтаназии бессознательное мышь, шейки дислокации на день эмбрионального развития (E) 15,5 или 18,5. Проанализируйте матку, содержащий эмбрионов ¹³ и поместить его в чашку Петри, содержащую 15-20 мл холодной полного HBSS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента, держите эмбрионов и тканей на льду.
2. Используйте ножницы, чтобы отделить каждый эмбрион от рога матки и место во второй чашке Петри с холодными полный HBSS.
3. Под микроскопом рассекает, разорвать стенку матки мышечной и плаценты с помощью пинцета (# 55) и ножницы. Осторожно освободите эмбриона, из желточного мешка.
4. Используйте пару Бонн ножницами, чтобы decapitatе эмбрионы чуть выше передних под углом 60 °. Если эксперимент требует генотипирование эмбрионов, собрать образец ткани для изоляции геномной ДНК (небольшой кусочек хвоста).
5. Передача голову чистой и сухой чашке Петри. Потому что голова была обезглавлена ​​в угол 60 °, голова должна наклоняться в одну сторону при размещении спинной стороной вверх.
6. Поместите иглу тщательно в середине полушарии, близкой к темени (рис 1а, б). Вводят приблизительно 2-3 мкл (на 3 или 4 мкг / мкл) раствора ДНК, наступив на педали в picospritzer III с использованием 30 фунтов давления на протяжении 10-15 мс на импульс, применяя 5-8 импульсов. Продолжительность и количество импульсов зависит от диаметра отверстия иглы с небольших отверстий, требующих больше времени. Интервал между каждым импульсом составляет 1 сек.
7. Перед размещением электродов, применять несколько капель полного HBSS на голове EMBRлет. Поместите электроды таким образом, что "отрицательное" терминал находится на той же стороне, что и введенного желудочка и "положительного" электрода на противоположной стороне впрыскиваемого желудочка ниже уха головы эмбриона (фиг 1С, D). Применить 5 импульсов 50 В.
   1. Используйте 3 мм электроды для E 15,5 и 5 мм Электроды Е 18.5.

3. Вскрытие мозга

1. После электропорации, снимите кожу от головы с помощью пинцета. Используя пару пружинных ножниц сделать небольшой разрез в середине мозжечка на средней линии черепа.
2. Вставьте пружинные ножницы в разрез и вырезать в продольном направлении вдоль стреловидного шва. Лупиться череп и отсоедините мозг от черепа с помощью тонких щипцов. Перевести весь мозг в 15-20 мл холодной полного решения HBSS.
3. Между тем, влить 4% LMP агарозы,выдерживали при 37-39 ° С на водяной бане, в отслаиванию вдали формы.
4. Возьмите мозг из полного HBSS небольшой совок шпателем и слейте избыток ССРХ с помощью тонкой папиросной бумаги или Kimwipes.
5. Поместите весь мозг мягко в агарозы и отрегулируйте ее положение с помощью тонкой иглы. Держать форму на льду до тех пор, пока агарозном затвердевает и блок срезы (для корональных секций обонятельные луковицы указывают вверх).

4. Vibratome секционирования и нарезать Культура

1. Обрезать агарозном блоки LMP и приклейте их к сцене образца с использованием «супер клей". После клей высохнет передачи стадии образца в буферном лоток vibratome и залить охлажденным льдом HBSS до завершения блок не погружен в раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать все инструменты и оборудование поверхностей с 70% этанола до секционирования.
2. Подготовка 250 мкм разделы vibratome использованием нового диска, как следует.
   1. Обрезать блок Wiго следующих условиях; Частота - 60 Гц, амплитуда - 0,7 мкм, скорость 16-18 мм / сек. Вырезать разделы, содержащие нужную ткань с вышеуказанными настройками на замедленной скорости (9 мм / сек). Запуск срезов от заднего мозга, собирать 5-7 части из головного мозга.
   2. Передача участков с чистой культуральной чашке 6 а, содержащего 5 мл охлажденного льдом HBSS завершить с помощью изогнутого шпателя и держать на льду, пока все секции собраны (фиг 1E).
3. Смочите мембраны в поперечном моды с 100 мкл полной ССРХ до размещения секций на мембране, чтобы облегчить ориентацию разделах.
4. Передача участков с помощью изогнутого шпателя на мембране (подобрать угол разделе пинцетом и вытащить на шпателем, а затем использовать пинцет, чтобы нажать на раздел на мембране). Поместите до пяти разделов на одной мембраны и организовать с помощью щипцов (рис 1F). Не перекрывать секции друг с другом.
   1. Возьмите избыток ССРХ от мембраны использованием пипетки. Конкретные Мембраны, используемые здесь, прикреплены к раме и вставляется в планшет для тканевых культур, что позволяет ткани, чтобы быть в контакте, но не покрыт продуктом.
5. Поместите мембранные вставки в 6-луночный планшет, содержащий 1,8 мл культуральной среды срез (1.2.5) (рис 1G, H). Инкубируют культуры блюдо при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 11 DIV или 14 DIV. Изменить половину среды (0,9 мл) каждый второй день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, добавляйте реагенты, как бромдезоксиуридин (ВДУ; 10 мкМ конечная концентрация) для маркировки пролиферирующих клеток в средствах массовой информации в течение первых 20 ч от времени культивирования.

5. Фиксация секций Вслед за иммунофлюоресцентного окрашивания

1. Используйте чистую и резкое лезвие скальпеля вырезать и обрезать мембраны в зависимости от ориентацииразделы.
2. Передача участков вместе с мембраной в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл 4% PFA (1.2.7). Инкубируйте разделы в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим промыванием 3 1x PBS в течение 15 мин каждый. Инкубируйте секций O / N с пермеабилизации растворе при 4 ° С при осторожном перемешивании.
3. На следующий день, инкубировать секций с соответствующими первичными антителами, разводили в пермеабилизации раствора, O / N или в течение 48 ч при 4 ° С при осторожном перемешивании.
4. Вымойте разделах 3 раза в течение 15 мин с 1x PBS и инкубировать O / N при 4 ° С с соответствующими вторичными антителами разводят в пермеабилизации решения.
5. После инкубации с вторичными антителами, мыть секций один раз 1x PBS в течение 15 мин с последующим окрашиванием DAPI в течение 10 мин.
6. Вымойте разделах 3 раза 1x PBS в течение 15 минут каждый и трансфер в микроскоп слайды. Добавить ImmunoMount и осторожно поместить покровное в верхней части секций. Высушите слайды O / N при 4 ° С и селенааль лаком для ногтей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите слайды всегда при 4 ° С.
   1. Проанализируйте срез культуры от конфокальной микроскопии (рис 1I).

Representative Results

Удаление фактора транскрипции Bcl11b вызывает ухудшение пролиферации клеток-предшественников и нейрональной дифференцировки приводит к снижению зубчатой ​​извилины размера и количества клеток. Кроме того мутантные нейроны не интегрироваться в гиппокампе схемы, вызывая обучения и ухудшение памяти ^8. Чтобы ответить на вопросы, касающиеся механизма регулирования (ов) Bcl11b в этих процессах экс внутриутробно электропорации был использован.

Обращаясь вопрос о том, Bcl11b клеток автономно регулирует дифференцировку нейронов клеток, мозаичные делеции Bcl11b возникли в результате экс внутриутробно электропорации в рекомбиназы конструкции или только GFP ¹¹ GFP- Cre в Bcl11b ^{Flox / Flox} гиппокамп на E15.5 с последующим органотипической культуры нарезать 18 дней после электропорации (рис 2а, б; эта цифра была изменена с ^8). Чтобы определить, является ли Bcl11б регулирует дифференцировку зернистых клеток клеток автономно иммунофлюоресценции окрашивание осуществляли с помощью специфических антител, узнающих NeuroD а также GFP. NeuroD выражается в стадиях митоза 2b / 3 и в начале постмитотических клеток ^14. Ранее нами было показано, что число NeuroD положительных клеток значительно возрастает в Bcl11b условных мутантов, указывающих на задержание нейрональной дифференцировки ^8. В то время как число только GFP-положительных клеток и GFP / NeuroD положительных клеток не отличались у контрольных и мутантных клеток значительное увеличение NeuroD позитивных клеток наблюдали в зубчатой ​​извилине, где клетки, получавших Cre рекомбиназу (фиг.2С; эта цифра была изменена от ^8). Поиск NeuroD положительные клетки не только в клетках, которые получали Cre рекомбиназу, но и в клетках дикого типа предположение, что косвенные механизмы вовлечены в Bcl11b регулирования нейрональной дифференцировки клеток. Из этих данных, однако, допРациональная клеточно-автономным функции Bcl11b не может быть исключена.

Ранее Desmoplakin было определено как прямой целевой ген Bcl11b ^8. Было также показано, что Desmoplakin участвует в регуляции клеточной пролиферации предшественников и дифференцировки кератиноцитов ^15. Чтобы продемонстрировать, является ли Desmoplakin участвует в регуляции клеточной пролиферации предшественников и / или дифференцировке нейронов в зубчатой ​​извилине плазмидной ДНК экспрессии GFP в одиночку или GFP и Desmoplakin под контролем CMV-промотора подвергали электропорации в контроле и мутантных мозга Bcl11b (фиг.3А - С; эта цифра была изменена с ^8). Срезы мозга культивировали в течение первого 20 ч в присутствии BrdU (10 мкМ конечная концентрация). В день 11 после электропорации срез культуры фиксировали с последующим иммунным BrdU и количество BrdU-положительных клеток было определено. Bcl11b мутанта Tissuэлектронной электропорации с GFP только содержал значительно меньше BrdU-положительных клеток по сравнению с контрольной ткани. Тем не менее, со-электропорации GFP и Desmoplakin спас количество BrdU-позитивных клеток для контроля уровня (рисунок и 3D; эта цифра была изменена с ^8). Взятые вместе эти данные еще раз подтверждают Desmoplakin как прямой целевой ген Bcl11b и его роль в регуляции пролиферации клеток-предшественников.

Рисунок 1. Набор планом экс внутриутробно электропорации и органотипического культуры среза на E15.5. (А) Введение ДНК в одной полусфере. (Б) Схематическое изображение инъекции ДНК. (С) Позиционирование электродов. (D) Схема рисунок размещения электродов. (E) Vibratome секционирования и чandling из срезов головного мозга. (F) Размещение срезы головного мозга на определенных мембран. (ГИ) светлого поля (G) и флуоресценции (Н, GFP), анализ срезов культур на 1 день после электропорации. (I), конфокальной изображение зубчатой ​​извилине на 11-й день после электропорации с использованием DAPI и GFP окрашивания. Пунктирная линия указывает зубчатой ​​извилине. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. Мозаика удаление Bcl11b экс внутриутробно электропорации и органотипической культуры среза (с изменениями от ^8). Электропорация векторное управление pCIG2 в одиночку (А) и pCIG2- Cre Conструктура (В) в зубчатой ​​извилине в E15.5 последующим органотипического культуры среза в течение 18 дней. Срезы иммуноокрашиванию с помощью антител, распознающих GFP (зеленый) и NeuroD (красный). Вставки отображения GFP (зеленый) и Bcl11b (красный) окрашивание при большем увеличении, чтобы продемонстрировать потерю экспрессии Bcl11b в клетках, экспрессирующих Cre -recombinase. (С) Статистический анализ GFP, NeuroD и GFP / NeuroD положительных клеток. Пунктирные линии зубчатой ​​извилине. Т-тест, * р <0,005; ошибки бары, УР; N = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3. Bcl11b фенотип спасает повторное введение Desmoplakin (с изменениями от ^8). Только GFP (, В), а также GFP и Desmoplakin (С) подвергают электропорации в зубчатой ​​извилине управления (А) и мутантной (B, C) ​​мозг в E15.5 последующим органотипического культуры среза в течение 11 дней. Срезы иммуноокрашиванию с помощью антител, распознающих GFP (зеленый) и BrdU (красный). (D) Статистический анализ BrdU-позитивных клеток. Пунктирные линии зубчатой ​​извилине. Вставки отображения Desmoplakin окрашивание (зеленый) при большем увеличении. Т-тест, * р <0,01; Ошибка бар, SEM; N = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4. Пример маточно электропорации при Е 18,5 затем органотипической культуры среза.Введение ДНК, экспрессирующих GFP в одной полусфере с последующим иммунным окрашиванием на 16 день после электропорации (А) окрашивание DAPI;. Окрашивание (В) GFP; (С) объединены изображение. Пунктирная линия указывает зубчатой ​​извилине. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Гиппокамп играет важную роль в процессах обучения и памяти. Зубчатая извилина также является одним из двух областей мозга, где нейрогенез происходит не только во время разработки, но и во всей взрослой жизни. Послеродовая и взрослых гиппокампа нейрогенеза происходит в аналогичным образом с участием многих общих факторов. Определение механизмов регуляции этих факторов будет очень полезна для понимания нейродегенеративных заболеваний, которые в свою очередь приведет к новым методам лечения и профилактических мер. Для получения этой информации Нужна система, чтобы управлять отдельные клетки и наблюдать за ними в их родной среде, как показано экс электропорации внутриутробно последующим органотипической культуры среза.

Экс маточно электропорации впервые был успешно применен в изучении развития коры ^11,16. Насколько нам известно, изучение роли Bcl11b в гиппокампе развития описано сначала экс внутриутробно электропорации DNA в зубчатой ​​извилине ткани ^8. Мы основали наш протокол о методах, опубликованных группы Polleux изучения развития коры ^11,12. Для успешного применения этого метода для изучения зубчатой ​​извилине размер и положение электродов должен был быть скорректированы. Размещение отрицательного электрода в коре вблизи места инъекции и положительным электродом на противоположной ниже уха изменяется полярность электропорации и удалось ввести ДНК в клетки из зубчатой ​​извилины. Размещение электродов правильно и применении ток 0,06 до 0,08 мА оказалась очень важные шаги, чтобы достичь удовлетворительных результатов электропорации. Для получения наиболее адекватной ток зависит в основном от правильного размещения электродов, как описано выше. Дополнительные важные шаги протокола являются потребителями инъекционных материал в желудочек, а также обработки срезов после vibratome срезов. Ткани мозга не фиксируется в течение всей процедуры ипоэтому ткань очень мягкая и легко разрушаемых при передаче от vibratome на мембране для выращивания. Секции также должны быть обработаны с большой осторожностью при запуске иммунной окраски. С учетом этих изменений и соображений манипуляций отдельных клеток зубчатой ​​извилины были успешно проведены, отвечая на вопросы, касающиеся Bcl11b регулирование раннего развития гиппокампа (рис 2 и 3; эти цифры были изменены с ^8).

Как уже упоминалось выше манипуляций с отдельными клетками и наблюдать их судьба Основным преимуществом экс внутриутробно электропорации. Основным недостатком экс внутриутробно подхода по сравнению с электропорации в матке является ограниченное время, чтобы ломтики в культуре. Также возможно, что экс внутриутробно условия культивирования может вызвать задержку в развитии. В наших экспериментах до сих пор мы были в состоянии держать ломтики в культуре ур до 18 дней, что соответствует возрасту P14. Выращивание органотипических ломтиками сверх этого времени привести к распаду ткани. Дополнительным недостатком этого подхода является экс внутриутробно ограниченное количество эмбрионов, которые могут быть электропорации в матери. В отличие от внутриутробного электропорации, где до 8 эмбрионов можно лечить это число ограничено 4 эмбрионов в экс внутриутробно подхода. Препарирование эмбрионы, электропорации, vibratome срезов и передачи срезов в условиях культивирования должны быть выполнены в течение короткого времени, чтобы обеспечить успешную культур срез.

Потому что основные события развития зубчатой ​​извилине происходят между P14 и P30 необходимо будет сохранить органотипической ломтики в культуре в течение длительных периодов времени. В первой попытке расширить культуру время electroporations проводились на E 18,5 регулирования условий соответственно (рис 4, см протокол). Электропорации в гов момент времени позволяет сохранить срезы головного мозга в области культуры До P17 или 18. Кроме того гиппокампа является дальнейшее развитие при Е 18,5 по сравнению с E 15,5, например, гиппокампа структуры уже формируются и более легко узнаваемы. В будущем мы хотели бы выполнять экс внутриутробно электропорации в четных более поздние моменты времени, например, P0 до P4 для изучения изменений в процессе разработки зубчатой ​​извилины до P30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Fine Glass Pipettes	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japan	EG-44
Anesthetic Bracket unit	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizer	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
Electroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P3	3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P5	5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V	Thermo Scientific	920120
Dissection Microscope	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Inverted Microscope	Leica	Leica DM IL LED
Confocal Microscope	Leica	Sp5II
6 well dish	BD Falcon	#353502
6 well dish	CELLSTAR	#657160
Tissue culture inserts	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma	#L2020
Poly-L-lysine	Sigma	#P5899
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Forceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26