Introduction
Hippocampus spelar en viktig roll i minne och inlärning samt känslomässigt beteende. En huvudfunktion består av en konsolidering av korttidsminnet till långtidsminnet, vilket kräver hög plasticitet i nervsystemet. Dentate gyrus av hippocampus fungerar som den primära gateway för inmatad information och är också en av två områden i hjärnan med pågående neurogenes genom hela vuxenlivet 1,2. Utvecklingen av hippocampus strukturen sker under sen embryogenes och i synnerhet under den första 3 till 4 veckor efter födseln 3. Under tidiga utvecklingen av gyrus dentatus en stamcellspoolen är etablerad krävs för postnatal samt vuxenneurogenes 4. Utvecklings nervceller passerar genom olika stadier, från stamcell genom flera stadier av progenitorceller till omogna och slutligen den mogna neuron under postnatal samt vuxenneurogenes. I olika skeden av neurogenes uttrycket avspecifika gener krävs för att göra det möjligt för mognaden och integration av nya nervceller i hippocampus kretsen 5,6.
Använda mus genetik och fenotypanalys genom immunhistokemi samt molekylära metoder tillåts definiera expressionsmönster och funktion av många av dessa gener. Dessutom microarray analys samt kromatin immunoprecipitation (chip) lämnade information om potentiella direkta och indirekta målgener 7,8. Men det finns fortfarande många obesvarade frågor beträffande regler hos hippocampus utveckling, i synnerhet utvecklingen av gyrus dentatus. För att få ökad insikt om hur specifika gener regleras ett system krävs tillåter manipulering av ett litet antal celler med ned- eller uppreglering av genen av intresse och / eller dess målgener och följer deras öde under utveckling. I livmodern elektroporering av shRNAs, cDNA av gener av intresse eller Cre recombinaSE erbjuder ett sådant verktyg. För att garantera närvaron av de önskade DNA eller små-RNA uttryckningsplasmider bör användas för elektroporering. Detta tillvägagångssätt är mycket framgångsrikt genomfört studera kortikal utveckling 9,10, men är en mer utmanande strategi att undersöka utvecklingen av gyrus dentatus grund av läget för de hippocampus strukturer i djupare hjärnlager.
Ex livmodern elektroporering, följt av organotypic bit kultur är en strategi för att kringgå detta problem 11,12. I motsats till i livmodern elektroporering inte hela embryot utan bara huvudet används tillåter därför att placera elektroderna i ett mer gynnsamt sätt att rikta shRNA / DNA mot hippocampus och gyrus dentatus. Vår grupp framgångsrikt använts ex livmodern elektroporering för att studera rollen av transkriptionsfaktorn Bcl11b under gyrus dentatus utveckling 8. Bcl11b har en dubbel roll i gyrus dentatus utveckling genom regulating stamcellstransplantation proliferation samt differentiering som visades av immunohistokemi. För att ytterligare definiera en mekanism för Bcl11b inblandning i dessa processer, har protokoll från Polleux gruppen 11,12 justeras för att studera gyrus dentatus som beskrivs nedan i protokoll avsnittet. I ett första tillvägagångssätt frågan riktades huruvida Bcl11b reglerar neuronal celldifferentiering cell autonomt. Ett andra tillvägagångssätt undersöktes om desmoplakin, en direkt målgen av Bcl11b, är tillräcklig för att rädda Bcl11b fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök har utförts i enlighet med den tyska lagstiftningen och godkändes av Regeringskansliet i Tübingen.
1. Beredning av mikropipetter, Lösningar och Membran
- Beredning av Mikro
- Dra glasmikropipetter med hjälp av en mikropipett avdragare med följande program: Värme: 540, Pull: 125, Velocity: 20 och Delay: 140. Längd uppgår nål till 5,5 cm.
- Bevel nålar med en microgrinder att erhålla en lämplig spetsstorlek av 4 mm. Förvara nålar i en låda eller 15 cm petriskål för att förhindra skador på spetsarna.
- Beredning av lösningar
- Plasmid-DNA-lösning
- Förbered plasmid-DNA innehållande den önskade cDNA-konstruktion med användning av ett endotoxinfritt Maxi-prep-kit enligt tillverkarens protokoll.
- Justera plasmid-DNA-lösning till en slutlig koncentration av 3 ug / ul (utan GFP spik vektor) eller 4 | ag /il (med en pg av GFP spik vektor) i endotoxinfritt Tris-EDTA-buffert innehållande Fast Green (slutkoncentration 0,05%).
- Laminin Stock lösning
- Lös 1 mg av laminin i sterilt vatten till en slutlig volym av 1 ml. Förbered 100 l alikvoter och förvara vid -80 ° C.
- Poly-L-lysin stamlösning
- Lös 50 mg poly-L-lysin i 50 ml sterilt vatten till en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Förbered 1 ml portioner och lagra i -20 ° C.
- Fullborda Hanks Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
- Förbered Komplett HBSS genom att kombinera 100 ml av 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES-buffert (pH 7,4), 30 ml av 1 M D-glukos, 10 ml av 100 mM CaCl2, 10 ml 100 mM MgSO 4, och fyra ml 1 M NaHCO 3. Lägg sterilt vatten upp till 1 L och förvara vid 4 ° C.
OBS: Autoklav alla lösningar förväntar en M HEPES-buffert och 1 M D-glukos, som är filTer steriliseras.
- Förbered Komplett HBSS genom att kombinera 100 ml av 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES-buffert (pH 7,4), 30 ml av 1 M D-glukos, 10 ml av 100 mM CaCl2, 10 ml 100 mM MgSO 4, och fyra ml 1 M NaHCO 3. Lägg sterilt vatten upp till 1 L och förvara vid 4 ° C.
- Slice Kultur Medium
- Förbered skiva odlingsmedium genom tillsats av 35 ml av Basal Medium Eagle, 12,9 ml av komplett HBSS (1.2.4), 1,35 ml av 1 M D-glukos, 250 | il av 200 mM L-glutamin och 500 | il av penicillin-streptomycin till erhålla en slutlig volym av 50 ml. Lägg hästserum till en slutlig koncentration av 5% och lagra vid 4 ° C.
- Låg smältpunkt (LMP) Agarose
- Förbered en 4% LMP agaroslösning genom att tillsätta 2 g LMP agaros till 50 ml komplett HBSS (1.2.4), följt av uppvärmning i en mikrovågsugn i 1-2 minuter på hög effekt. Förvara lösningen i ett vattenbad vid 37-39 ° C. Förvara lösning vid 4 ° C och återanvändning.
- Paraformaldehydlösning
- I ett dragskåp framställa en 4% paraformaldehyd (PFA) lösning genom att tillsätta 4 g paraformaldehyd till 100 ml 1 x PBS. Värm lösningen till 60 ° C och tillsätt några droppar 1N NaOH tills lösningen blir clear.
- Permeabilisering Lösning
- Lös 9 g BSA i 300 ml 1 x PBS innehållande 0,3% Trition X-100 och förvara vid 4 ° C. Lägg 10% natriumazid för långtidsförvaring.
- Plasmid-DNA-lösning
- Beläggning av Membrane Inlägg
- Späd en alikvot av laminin stamlösning (1.2.2) och en alikvot av poly-L-lysin-stamlösning (1.2.3) i sterilt vatten till en slutlig volym av 12 ml.
- Placera membran skär i 6-hålsplattor med vardera väl innehållande 2 ml sterilt vatten. Tillsätt 1 ml beläggningslösning ovanpå membranet och inkubera O / N vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Efter inkubation tvättas membranet infogar tre gånger med 1 ml sterilt vatten och torka. Använd belagda membran inlägg på samma dag eller förvara vid 4 ° C i upp till fyra veckor i ett torrt 6 brunnar.
2. DNA Injection och elektroporation av E15.5 och E18.5 embryon
- Euthanize det omedvetna musen genom halsdislokation på embryonala dag (E) 15,5 eller 18,5. Dissekera livmodern innehåller embryona 13 och placera den i en petriskål med 15-20 ml kallt kompletta HBSS.
OBS: Från och med nu och framåt, hålla embryon och vävnader på is. - Använd en sax för att separera varje embryo från livmoderhornet och plats till en andra petriskål med kallt komplett HBSS.
- Under ett dissektionsmikroskop, åtskiljer uterusmuskulaturen väggen och placenta användning av ett par av fin pincett (# 55) och saxar. Släpp försiktigt embryot från gulesäcken.
- Använd ett par Bonn sax för att decapitate embryona precis ovanför frambenen vid en 60 ° vinkel. Om försöket kräver genotypning av embryona, samla ett vävnadsprov för genomisk DNA-isolering (en liten bit av svansen).
- Överför huvudet till en ren och torr petriskål. Eftersom huvudet hade halshuggen i en 60 ° vinkel, skall huvudet luta åt sidan när den placeras ryggsidan uppåt.
- Placera nålen försiktigt i mitten av halvsfärens nära bregma (Figur 1A, B). Injicera cirka 2-3 pl (vid 3 eller 4 mikrogram / l) av DNA-lösning genom att trampa på pedalen för Picospritzer III användning av 30 pounds av trycket under hela 10-15 ms per puls, applicera 5-8 pulser. Varaktigheten och antalet pulserna beror på diametern hos nålen öppning med mindre öppningar som kräver mer tid. Intervallet mellan varje puls uppgår till 1 sek.
- Innan du placerar elektrod, applicera några droppar kompletta HBSS på huvudet av EMBRyo. Placera elektroderna i ett sådant sätt att den "negativa" terminalen är på samma sida som den injicerade ventrikeln och den "positiva" elektrod på den motsatta sidan av den injicerade ventrikeln under örat av embryot huvud (Figur 1C, D). Applicera 5 pulser av 50 V.
- Använd 3 mm elektroder för E 15,5 och 5 mm elektroder för E 18,5.
3. Dissekering av hjärnan
- Efter elektroporering, dra av huden från huvudet med hjälp av ett par av fin pincett. Med användning ett par fjäder sax göra ett litet snitt i mitten av lillhjärnan vid mittlinjen av skallen.
- Sätt fjäder sax in i snittet och skär på längden längs sagittal sutur. Dra av skallen och lösgöra hjärnan från skallen genom användning av fin pincett. Överför hela hjärnan i 15-20 ml kall kompletta HBSS lösning.
- Under tiden, häll 4% LMP agaros,hölls vid 37-39 ° C i ett vattenbad, till en avskalningsbar mögel.
- Ta hjärnan ur den kompletta HBSS av en liten skopa spatel och dränera överskott av HBSS genom fint silkespapper eller Kimwipes.
- Placera hela hjärnan försiktigt in agarosen och justera sin position med en fin nål. Håll formen på is tills agarosen är stelnad och blocket är sektionerad (för koronala sektioner lukt glödlampor pekar uppåt).
4. Vibratome Sektione och Slice Kultur
- Trimma LMP agarosblock och limma dem till preparat scenen med hjälp av "superlim". Efter limmet är torrt överföring preparatstadiet till buffertfacket på vibratome och fyll med iskall slutföra HBSS tills blocket är nedsänkt i lösningen.
OBS: Sterilisera alla instrument och utrustning ytor med 70% etanol innan snittning. - Förbered 250 nm tjocka vibratome sektioner med hjälp av en ny klinga som följde.
- Trimma blocket with följande inställningar; frekvens - 60 Hz, amplitud - 0,7 um, hastighet 16-18 mm / sek. Skär avsnitten innehåller den önskade vävnaden med ovanstående inställningar vid låg hastighet (9 mm / sek). Starta snitt från bakhjäman, samla 5-7 sektioner från storhjärnan.
- Överför sektionerna till en ren 6 väl odlingsskål innehållande 5 ml iskall slutföra HBSS med hjälp av en böjd spatel och hålla på is tills alla avsnitt samlas (Figur 1E).
- Fukta membranet i en tvär mode med 100 ul av komplett HBSS före utsläpp sektionerna på membranet, för att underlätta orienteringen av sektionerna.
- Överför sektioner med hjälp av en böjd spatel på membranet (plocka upp ett hörn av sektionen med pincett och dra ut på spatel och sedan använda pincett för att driva sektionen på membranet). Placera upp till fem avsnitt på en membran och ordna med hjälp pincett (Figur 1F). Inte överlappar sektionerna med varandra.
- Ta överskott av HBSS utanför membranet med användning av en pipett. De specifika membran som används här är fästa vid en ram och infördes i vävnadsodlingsplatta, som tillåter vävnaden att vara i kontakt, men som inte omfattas av mediet.
- Placera membran skär in i en 6 brunnar innehåller 1,8 ml slice odlingsmedium (1.2.5) (Figur 1G, H). Inkubera kulturen skålen vid 37 ° C med 5% CO 2 för 11 DIV eller 14 DIV. Ändra halv mediet (0,9 ml) varannan dag.
OBS: I detta skede lägga reagenser som Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 ^ M slutlig koncentration) för märkning prolifererande celler till medierna för de första 20 h av kulturen tiden.
5. Fixering av avsnitten Följt av immunofluorescensfärgning
- Använd en ren och skarp skalpell blad för att skära och trimma membranen beroende på orienteringen avsektionerna.
- Överför sektioner tillsammans med membranet till en 24 brunnar innehåller 1 ml 4% PFA (1.2.7). Inkubera sektionerna under 1 h vid RT följt av tre tvättar med 1 x PBS för 15 min vardera. Inkubera avdelningarna O / N med permeabilization lösning vid 4 ° C med försiktig omrörning.
- Följande dag, inkubera de sektioner med lämpliga primära antikroppar utspädda i permeabilization lösning, O / N, eller för 48 timmar vid 4 ° C med försiktig omrörning.
- Tvätta sektionerna 3 gånger i 15 min med 1x PBS och inkubera O / N vid 4 ° C med lämpliga sekundära antikroppar utspädda i permeabilization lösning.
- Efter inkubering med sekundära antikroppar, tvätta sektionerna gång med 1 x PBS under 15 min följt av DAPI-färgning under 10 minuter.
- Tvätta avsnitten 3 gånger med 1x PBS i 15 minuter vardera och överföra till objektglas. Lägg ImmunoMount och försiktigt placera en täck ovanpå sektionerna. Torka diabilder O / N vid 4 ° C och för sigal med nagellack.
OBS: Håll glasen alltid vid 4 ° C.- Analysera slice kulturer genom konfokalmikroskopi (figur 1I).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ablation av transkriptionsfaktorn Bcl11b orsakar försämring av stamfadercellproliferation och neuronal differentiering resulterar i en reducerad gyrus dentatus storlek och cellantal. Vidare muterade neuroner inte integreras i hippocampus kretsar orsakar inlärning och minnesförsämring 8. För att svara på frågor som rör den rättsliga mekanismen (er) i Bcl11b i dessa processer ex livmodern elektroporering var anställd.
Ta upp frågan om huruvida Bcl11b cell autonomt reglerar neuronal celldifferentiering, var mosaik deletioner av Bcl11b genereras av ex livmodern elektroporering av en GFP- Cre rekombinas konstruktion eller GFP enbart 11 till Bcl11b flox / flox hippocampi på E15.5 följt av organotypic bit kultur upp till 18 dagar efter elektroporering (Figur 2A, B, denna figur har modifierats 8). För att bestämma huruvida Bcl11b reglerar differentiering av granulat celler cell autonomt immunofluorescensfärgning utfördes med hjälp av specifika antikroppar som känner igen NeuroD samt GFP. NeuroD uttrycks i mitotiska stadier 2b / 3 och tidiga postmitotiska celler 14. Vi har visat tidigare att antalet NeuroD positiva celler ökar signifikant i Bcl11b villkor mutanter indikerar ett gripande av neuronal differentiering 8. Medan antalet ensamma GFP positiva celler och GFP / NeuroD positiva celler inte skiljer sig åt i kontroll- och muterade celler en betydande ökning av NeuroD positiva celler observerades i gyrus dentatus där celler hade fått Cre rekombinas (figur 2C, denna siffra har ändrats från 8). Att hitta NeuroD positiva celler inte endast i celler som hade fått Cre-rekombinas, utan även i celler av vild typ tyder på att indirekta mekanismer är involverade i Bcl11b regleringen av neuronal celldifferentiering. Från dessa uppgifter dock Additional cell autonoma funktioner Bcl11b kan inte uteslutas.
Tidigare var desmoplakin bestäms som ett direkt mål genen hos Bcl11b 8. Det visade sig också att desmoplakin är involverad i regleringen av progenitorceller proliferation och differentiering av keratinocyter 15. För att demonstrera huruvida desmoplakin är involverad i regleringen av stamfadercellproliferation och / eller neuronal differentiering av dentate gyrus plasmid-DNA enbart eller GFP och desmoplakin under kontroll av CMV-promotorn elektroporerades in i kontroll- och Bcl11b mutanta hjärnor (figur 3A uttrycker GFP - C; denna siffra har modifierats 8). De hjärnsnitt odlades för första 20 h i närvaro av BrdU (10 | iM slutlig koncentration). Vid dag 11 efter elektroporering de slice kulturer fixerades följt av BrdU immunofärgning och antalet BrdU-positiva celler bestämdes. Bcl11b mutant Tissue electroporated med GFP innehöll endast signifikant färre BrdU positiva celler jämfört med kontrollvävnaden. Dock räddade co-elektroporering av GFP och desmoplakin antalet BrdU positiva celler för att kontrollera nivåer (figur 3D, denna siffra har modifierats 8). Sammantaget dessa uppgifter ytterligare bekräfta desmoplakin som en direkt målgen av Bcl11b och dess roll i regleringen av stamcellstransplantation proliferation.
Figur 1. Ställ upp ex livmodern elektroporering och organotypisk bit kultur vid E15.5. (A) Injektion av DNA i ett halvklotet. (B) Schematisk bild av DNA-injektion. (C) Placering av elektroderna. (D) Schematisk ritning av elektrodplacering. (E) Vibratome sektione och handling av hjärnsektioner. (F) Placering hjärnan sektioner på specifika membran. (GI) Bright-fältet (G) och fluorescens (H, GFP) analys av slice kulturer på dag 1 efter elektroporering. (I) Confocal bild av gyrus dentatus på dag 11 efter elektroporering använder DAPI och GFP färgning. Streckad linje anger gyrus gyrus. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mosaik radering av Bcl11b av ex livmodern elektroporering och organotypisk bit kultur (modifierad från 8). Elektroporering av styrvektorn pCIG2 enbart (A) och pCIG2- Cre construct (B) i gyrus dentatus vid E15.5 följt av organotypic skiva kultur för 18 dagar. Sektioner immunofärgades genom användning av antikroppar som igenkänner GFP (grönt) och NeuroD (röd). Inläggningar visar GFP (grönt) och Bcl11b (röd) färgning vid högre förstoring för att visa förlust av Bcl11b expression i celler som uttrycker Cre -recombinase. (C) Statistisk analys av GFP, NeuroD och GFP / NeuroD positiva celler. Streckade linjer anger gyrus gyrus. t-test, * p <0,005; fel barer, sd; n = 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bcl11b fenotyp räddas av återintroduktion av desmoplakin (modifierad från 8). Endast GFP (A, B) samt GFP och desmoplakin (C) elektroporerades in i dentate gyrus av kontroll (A) och mutant (B, C) hjärnor på E15.5 följt av organotypic skiva kultur under 11 dagar. Sektioner immunofärgades genom användning av antikroppar som igenkänner GFP (grönt) och BrdU (röd). (D) Statistisk analys av BrdU-positiva celler. Streckade linjer anger gyrus gyrus. Inläggningar visa desmoplakin färgning (grön) vid högre förstoring. t-test, * p <0,01; error bar, sem; n = 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ex livmodern elektroporering vid E 18,5 följt av organotypic bit kultur.Injektion av DNA som uttrycker GFP i en hemisfär följt av immunfärgning på dag 16 efter elektroporering (A) DAPI-färgning;. (B) GFP färgning, (C) sammanslagna bilden. Streckad linje anger gyrus dentatus. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hippocampus har en viktig funktion i inlärning och minne. Gyrus dentatus är också en av två områden i hjärnan där neurogenes sker inte bara under utvecklingen, utan även under hela vuxenlivet. Födsel och vuxna hippocampus neurogenes skrider på ett liknande sätt som involverar många gemensamma faktorer. Definiera regler hos dessa faktorer kommer att vara till stor hjälp för att förstå neurodegenerativa sjukdomar som i sin tur kommer att leda till nya behandlingar och förebyggande åtgärder. För att få denna information en kräver ett system för att manipulera enstaka celler och observera dem i deras naturliga miljö, vilket framgår av ex livmodern elektroporering följt av organotypic bit kultur.
Ex livmodern elektroporering först framgångsrikt tillämpats i studier cortex utveckling 11,16. Såvitt vi vet att undersöka vilken roll Bcl11b i hippocampus utveckling är den första som beskriver ex livmodern elektroporering av DNA i gyrus dentatus vävnaden 8. Vi bygger våra protokoll om de metoder som publicerats av Polleux gruppen studerar cortex utveckling 11,12. För att framgångsrikt tillämpa denna metod för att studera gyrus dentatus storlek och position av elektrod måste justeras. Placering den negativa elektroden vid cortex nära injektionsstället och den positiva elektroden vid den motsatt platsen under örat ändrade polaritet elektroporation och lyckades att införa DNA i celler i gyrus dentatus. Placering av elektroder korrekt och applicera en ström av 0,06-0,08 mA visade sig vara väldigt avgörande steg för att uppnå tillfredsställande elektroporation resultat. För att erhålla den mest adekvata ström beror i huvudsak på den korrekta placeringen av elektroderna såsom beskrivits ovan. Ytterligare kritiska stegen i protokollet injicerar materialet i ventrikeln samt hantering skivorna efter vibratome sektione. Den hjärnvävnad är inte fast under hela förfarandet ochDärför vävnaden är mycket mjuk och lätt destroy vid överföring från vibratome på membranet för odling. Sektioner måste också hanteras med stor försiktighet när man startar immunfärgning. Med dessa ändringar och överväganden manipulationer av enstaka celler av gyrus gyrus fördes framgångsrikt svara på frågor som rör Bcl11b reglering av tidig hippocampus utveckling (Figur 2 och 3; detta siffror har ändrats från 8).
Såsom nämnts ovan manipulera enskilda celler och observera deras öde är den stora fördelen med ex livmodern elektroporering. En stor nackdel med ex utero synsätt i jämförelse med i livmodern elektroporering är den begränsade tid att hålla skivor i kultur. Det är också möjligt att ex utero odlingsförhållanden kan orsaka en försening i utvecklingen. I våra experiment så långt vi har kunnat hålla skivorna i kultur up till 18 dagar vilket motsvarar en ålder av P14. Odling av organotypic skivor bortom denna tid leda till sönderdelning av vävnaden. En ytterligare nackdel med fritt utero tillvägagångssätt är det begränsade antalet embryon som kan elektroporerade per mor. I motsats till i livmodern elektroporering där upp till åtta embryon kan behandlas detta antal är begränsat till fyra embryon i ex utero tillvägagångssätt. Dissektion av embryon, elektroporering, vibratome sektione och överföring av skivorna i odlingsbetingelserna måste utföras på kort tid för att säkerställa framgångsrika slice kulturer.
Eftersom större evenemang av gyrus dentatus utveckling sker mellan P14 och P30 skulle det vara nödvändigt att hålla organotypiska skivor i kultur under längre tidsperioder. I ett första försök att förlänga odlingstiden electroporations utfördes vid E 18,5 anpassning av de villkor som i enlighet därmed (fig 4; se protokoll). Electroporating vid thär tidspunkt kan hålla hjärnan sektioner i kultur upp till P17 eller 18. Dessutom hippocampusformationen vidareutvecklas på E 18,5 jämfört med E 15,5, t.ex. är hippocampus strukturer som redan bildats och lättare att känna igen. I framtiden vill vi att utföra ex livmodern elektroporering med jämna senare tidpunkter, t.ex. P0 till P4 att undersöka förändringar under gyrus dentatus utveckling fram till P30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10x | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
