Abstract
वयस्क neurogenesis नए न्यूरॉन्स तेजी से प्रतिबद्ध मध्यवर्ती पूर्वज उपप्रकार के माध्यम से एक सक्रिय तंत्रिका स्टेम सेल से उत्पन्न कर रहे हैं, जिसमें एक उच्च विनियमित, बहु मंच प्रक्रिया है। इन उपप्रकारों में से प्रत्येक को एक साथ, विशिष्ट रूपात्मक मापदंड के साथ उनकी पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विशिष्ट आणविक मार्कर का एक सेट व्यक्त करता है। आमतौर पर, Immunofluorescent तकनीक exo- या अंतर्जात प्रसार मार्कर के साथ संयोजन में उप-विशिष्ट एंटीबॉडी से जुड़े लागू कर रहे हैं। हम इस के साथ साथ वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस के सभी चरणों का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों immunolabeling का वर्णन है। ये thymidine एनालॉग, transcardial छिड़काव, ऊतक प्रसंस्करण, गर्मी प्रेरित मिलान पुनः प्राप्ति, एबीसी immunohistochemistry, कई अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस, confocal माइक्रोस्कोपी और सेल मात्रा का ठहराव के आवेदन शामिल हैं। इसके अलावा हम समस्याओं यू के गतिरोध उत्पन्न जो एक अनुक्रमिक कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल पेशsually ही मेजबान प्रजातियों में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की जरूरत से उत्पन्न होने वाली। यह एक एकल खंड के भीतर एक प्रसार मार्कर के साथ एक साथ सभी हिप्पोकैम्पस पूर्वज उपप्रकार का एक सटीक पहचान देता है। इन तकनीकों में समानांतर में अलग पूर्वज उपप्रकार के नियमन, मस्तिष्क विकृतियों में उनकी भागीदारी और विशिष्ट मस्तिष्क कार्यों में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं।
Introduction
दो मस्तिष्क क्षेत्रों अनिवार्यता से जीवन भर नए न्यूरॉन्स उत्पन्न, पार्श्व निलय की subventricular जोन और हिप्पोकैम्पस दांतेदार गाइरस (डीजी) की subgranular क्षेत्र (SGZ)। नवजात न्यूरॉन्स तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और परिपक्वता 1,2 तक पहुँचने से पहले रूपात्मक और शारीरिक विकास के विभिन्न चरणों के माध्यम से जाना। एक धीरे विभाजित रेडियल glia की तरह स्टेम सेल (टाइप 1) से पारगमन की लगातार चरणों मध्यवर्ती पूर्वज कोशिकाओं उठता amplifying। अधिक समान उपप्रकार (प्रकार 2A और टाइप 2 बी) कम है, स्पर्शरेखा प्रक्रियाओं के साथ एक अनियमित आकार है। वे (डेन्ड्राइट आणविक परत की ओर बढ़ाया) के साथ धीरे-धीरे अपरिपक्व न्यूरॉन्स बनने के लिए सेल चक्र से बाहर निकलें और अंत में हिप्पोकैम्पस नेटवर्क के रूप में परिपक्व दाना कोशिकाओं में एकीकृत कि neuroblasts (प्रकार 3) उत्पन्न करते हैं। कारण उनके विशेष शारीरिक विशेषताओं के लिए इन कोशिकाओं को बढ़ाया plasticity के तीन sugges साथ circuitry के प्रदान करते हैंting के हिप्पोकैम्पस के कार्य में एक अनूठी भूमिका। दरअसल, पिछले एक दशक के अध्ययन वयस्क न्यूरोजेनेसिस स्थानिक स्मृति, पैटर्न जुदाई और भावनात्मक व्यवहार 4,5 के लिए योगदान देता है कि पर्याप्त सबूत उत्पन्न।
वयस्क न्यूरोजेनेसिस अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। Thymidine एनालॉग सेल चक्र के एस चरण के दौरान डीएनए में शामिल करने और नवजात शिशु की कोशिकाओं को 6-8 के जन्म डेटिंग, मात्रा का ठहराव और भाग्य विश्लेषण अनुमति देते हैं। अलग thymidine एनालॉग (जैसे, CldU, edu या आईडीयू) के अनुक्रमिक आवेदन सेल कारोबार या एक प्रयोग 9 के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर पैदा हुआ सेल आबादी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक वैकल्पिक, सेल प्रसार के लिए अंतर्जात मार्कर Ki67 है। यह सेल चक्र (G1, एस, G2, एम) के आराम चरण को छोड़कर (G0) और G1 10,11 की शुरुआत के सभी चरणों के दौरान कोशिकाओं को विभाजित में व्यक्त किया है। वयस्क dentat में नवजात सेल आबादी के phenotype का विश्लेषण करने के लिएई गाइरस कई चरण-विशिष्ट आणविक मार्कर ऐसे GFAP, nestin, DCX और NeuN 1,6 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। GFAP परिपक्व astrocytes की एक मार्कर है, लेकिन यह भी वयस्क अग्रमस्तिष्क में रेडियल glia-तरह की कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। Nestin रेडियल glia कोशिकाओं की तरह है और जल्दी मध्यवर्ती पूर्वज कोशिकाओं के लिए विशिष्ट एक मध्यवर्ती रेशा है। DCX मध्यवर्ती progenitors, neuroblasts और अपरिपक्व न्यूरॉन्स में व्यक्त एक microtubule जुड़े प्रोटीन होता है। + Nestin - प्रकार 2A (GFAP - टाइप 1 (GFAP +, nestin + DCX): इन तीन मार्करों और चार अलग पूर्वज सेल उपप्रकार पहचाना जा सकता है लेबल की कोशिकाओं के रूपात्मक सुविधाओं की (सह) अभिव्यक्ति पर आधारित , DCX -), टाइप 2 बी (GFAP - nestin + DCX +) और टाइप 3 (GFAP - nestin - DCX +) 1। एक साथ postmitotic न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, जो NeuN, साथ DCX के सह-लेबलिंग immatur के भेदभाव की अनुमति देता हैई (DCX + NeuN +) और परिपक्व (DCX - NeuN +) छोटा दाना न्यूरॉन्स।
जैसा कि ऊपर उल्लेख मार्करों अक्सर नवजात कोशिकाओं की संख्या और पहचान का विश्लेषण करने के लिए Immunofluorescent सह लेबलिंग और बाद में confocal माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग किया जाता है। यह आमतौर पर अवांछित एंटीबॉडी पार जेट को रोकने के लिए विभिन्न मेजबान प्रजातियों से एंटीबॉडी की आवश्यकता है। हालांकि, न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के बहुमत या तो खरगोश या चूहों में (जैसे, माउस α-BrdU, माउस α-NeuN, खरगोश α-Ki67, खरगोश α-GFAP) उठाए गए हैं। यह एक टुकड़ा में मूल्यांकन किया जा सकता है कि एंटीजन की संख्या और संयोजन में गंभीर सीमाओं की ओर जाता है। यह बदले में कई stainings प्रदर्शन किया जा रहा है के रूप में ही नहीं, धुंधला प्रयास बढ़ जाती है, लेकिन यह भी परिणामों की विश्वसनीयता समझौता हो सकता है। इसके अलावा, कुछ एंटीजन formalin निर्धारण प्रेरित मिलान मास्किंग (जैसे, Ki67 करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, Nestin)। हम इस के साथ साथ शास्त्रीय एकल और एकाधिक immunolabeling प्रोटोकॉल से संशोधनों का वर्णन (जैसे, मिलान पुनः प्राप्ति, कई अनुक्रमिक immunostaining, nestin-GFP ट्रांसजेनिक चूहों 12 का प्रयोग) इन मुद्दों के कई दूर है। विशेष रूप से, अनुक्रमिक कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल एंटीबॉडी का हिस्सा ही मेजबान से प्राप्त होता है, भले ही अप करने के लिए चार अलग अलग एंटीजन के खिलाफ धुंधला अनुमति देता है। यह एक साथ टाइप 1, टाइप 2 ए, टाइप 2 बी और टाइप 3 पूर्वज कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, साथ ही एक एकल खंड के भीतर अपने proliferative गतिविधि में सक्षम बनाता है।
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Protocol
नोट: रहने वाले जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं चुनाव आयोग के निर्देश 86/609 / ईईसी देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर दिशा निर्देशों और स्थानीय आचार समिति (थुरिंगर Landesamt फर Lebensmittelsicherheit अंड Verbraucherschutz) द्वारा अनुमोदित के अनुसार किए गए।
Thymidine analogs की 1. intraperitoneal इंजेक्शन
- इंजेक्शन से पहले जानवरों के दिन वजन। अगले दिन के रूप में अच्छी तरह से एक 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के अलग-अलग वजन से समायोजित इंजेक्शन वॉल्यूम पर योजना बनाई सभी इंजेक्शन के लिए आवश्यक thymidine अनुरूप की राशि की गणना।
- 10 मिलीग्राम / एमएल thymidine शेयर समाधान तैयार है। (सतर्कता! Thymidine एनालॉग विषाक्त कर रहे हैं। एक रासायनिक धूआं हुड का प्रयोग करें, यानी, आपूर्तिकर्ताओं द्वारा प्रदान की विशिष्ट सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) का पालन प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनते हैं)।
- फ्रीजर से thymidine अनुरूप लो और लगभग, आर टी करने के लिए इसे लाने के लिए। 21 डिग्री सेल्सियस। 10 मिलीग्राम वजन और जोड़या 0.04 एन NaOH (BrdU और CldU के लिए) बाँझ खारा (बाँझ खारा में; आईडीयू के लिए), भंवर। एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान और भंवर में 15 मिनट के लिए हर 2 - - पाउडर भंग करने के लिए 3 मिनट में कम से कम 10 के लिए रखें।
नोट: अप करने के लिए 24 घंटे के लिए समाधान का उपयोग आरटी पर और -20 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जाता है। प्रकाश (एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर) से समाधान को सुरक्षित रखें। हमेशा अवक्षेप लिए जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो भंग कर रहे हैं।
- फ्रीजर से thymidine अनुरूप लो और लगभग, आर टी करने के लिए इसे लाने के लिए। 21 डिग्री सेल्सियस। 10 मिलीग्राम वजन और जोड़या 0.04 एन NaOH (BrdU और CldU के लिए) बाँझ खारा (बाँझ खारा में; आईडीयू के लिए), भंवर। एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान और भंवर में 15 मिनट के लिए हर 2 - - पाउडर भंग करने के लिए 3 मिनट में कम से कम 10 के लिए रखें।
- कूड़ा द्वारा माउस को नियंत्रित और intraperitoneally एक 30 जी सुई के साथ एक बढ़िया खुराक सिरिंज का उपयोग (आरटी पर) शेयर समाधान का एक उपयुक्त, वजन समायोजित मात्रा इंजेक्षन।
नोट: यदि CldU और आईडीयू, वही जानवर के भीतर क्रमिक रूप से प्रशासित किया जाना है equimolar सांद्रता इंजेक्षन करने पर विचार (उदाहरण के लिए, 50 मिलीग्राम / किलो BrdU के अनुरूप करने के लिए जो 42.5 मिलीग्राम / किग्रा CldU और 57.5 मिलीग्राम / किग्रा आईडीयू)। इसलिए, तदनुसार 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान के इंजेक्शन संस्करणों को समायोजित।
2. ऊतक तैयारी
- Prepaछिड़काव से पहले दिन पर 0.1 एम फॉस्फेट बफर 7.4 पीएच में 4% formaldehyde के पुन। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- Transcardially 40 एमएल बर्फ ठंड formaldehyde के (प्रवाह की दर 5 मिलीग्राम / मिनट) के साथ तो, 10 एमएल बर्फ ठंड पीबीएस के साथ बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से गहरा anesthetized चूहों (3.5 isoflurane%) छिड़कना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक ही लगानेवाला में मस्तिष्क और बाद तय काटना।
- लगातार 10% (4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा) और 30% सुक्रोज (मस्तिष्क डूब तक, लगभग। 48 घंटा) में दिमाग स्थानांतरण। कोई बुलबुले के ऊतकों से उभरने तक ठंड के लिए, धीरे धीरे -25 डिग्री सेल्सियस isopentane में cryoprotected दिमाग डूब। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- एक ठंड सूक्ष्म पर 40 माइक्रोन मोटाई का राज्याभिषेक वर्गों में कटौती (-25 पर ब्लॉक के तापमान को -16 डिग्री सेल्सियस)। 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के कुओं युक्त एंटीफ्ऱीज़र समाधान में क्रमिक रूप से हस्तांतरण वर्गों (चित्रा 1 देखें)। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
24 अच्छी तरह से थाली में सूक्ष्म स्लाइस के हस्तांतरण की चित्रा 1. योजनाबद्ध चित्र। ए 1 में शुरू करो और A6 आगे तो अगली पंक्ति बी करने के लिए जाने के लिए और बाद, पंक्ति एक में बाद के स्लाइस जगह। डी 6 जब तक पहुँचने, A1 के लिए वापस जाने के लिए और जारी है। स्लाइस की यह व्यवस्था एक पूरे मस्तिष्क की धारा वें हर n की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। नवजात कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए immunofluorescence phenotyping के लिए (एक स्तंभ के दो बारी पंक्तियों की सामग्री के समकक्ष) हर 12 वें खंड ले, (एक कॉलम की सामग्री के समकक्ष) मस्तिष्क खंड वें हर 6 लेते हैं।
3. Immunostaining
नोट: धारा 6 अच्छी तरह प्लेटें एक वाहक थाली के साथ सुसज्जित है और आवेषण जाल में आम तौर पर, मुक्त अस्थायी कार्रवाई कर रहे हैं। एक अपवाद के रूप में, एंटीबॉडी incubations और एबीसी प्रतिक्रिया जाल आवेषण (डब्ल्यू प्रति 0.5 से 1 मिलीलीटर बिना 12- या 24 अच्छी तरह से प्लेट में किया जाता है अवरुद्धपक्ष) कलंकित किया जा करने के लिए है कि स्लाइस की संख्या पर निर्भर करता है, के लिए पर्याप्त है। इन चरणों के दौरान, एक ठीक ब्रश की मदद से (प्रत्येक नए समाधान के साथ कुल्ला) के साथ वर्गों हस्तांतरण। सभी incubations निरंतर आंदोलन (अधिकतम 150 आरपीएम) के साथ किया जाता है।
- Immunohistochemistry (एबीसी विधि)
- पूरी तरह से एंटीफ्ऱीज़र दूर करने के लिए (10 मिनट प्रत्येक के लिए आरटी पर, 5 बार 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बार हे / एन) टीबीएस में एंटीफ्ऱीज़र से वर्गों स्थानांतरण और अच्छी तरह कुल्ला।
- अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाने के लिए टीबीएस टी में 1.5% एच 2 ओ 2 में 30 मिनट के लिए सेते हैं। बुदबुदाती पर ध्यान दे और यदि आवश्यक हो तो वर्गों-डूब रहे हैं। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला।
- वैकल्पिक: इस बीच एक हीटिंग कैबिनेट और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 एन एचसीएल पहले से गरम। डीएनए denature के लिए 2 एन एचसीएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं। एक ब्रश की मदद से धीरे अलग वर्गों।
- वैकल्पिक: 0.1 एम borate बफर पीएच में 10 मिनट के लिए वर्गों बेअसर8.5, आरटी। जबकि स्थानांतरित, संक्षेप में एचसीएल कूड़ा हटाने के लिए एक कागज तौलिया पर वर्गों युक्त जाल आवेषण झाड़ू। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में दो बार कुल्ला।
- ऊतक permeabilize करने और unspecific एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों, आरटी पर एक घंटा ब्लॉक करने के लिए TBSplus में सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर TBSplus, ओ / एन में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी में सेते हैं। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला।
- TBSplus, आरटी पर तीन घंटा में पतला biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी में सेते हैं। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला। इस बीच ...
- निर्माता प्रोटोकॉल (टीबीएस टी में 1% ए + 1% बी) के अनुसार एबीसी जटिल तैयार करें। उपयोग करने से पहले आरटी पर 30 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति दें। आरटी पर 1 घंटे के लिए अटल बिहारी अभिकर्मक में वर्गों सेते हैं। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला।
- क्रमश: दो हिस्सों और पिपेट 4 मिलीलीटर या 2 मिलीलीटर प्रति कुएं में विभाजित है, 6- या 12 अच्छी तरह से थाली प्रति टीबीएस टी में 50 मिलीलीटर 0.5 मिलीग्राम / एमएल थपका तैयार करें। थपका समाधान (सतर्कता में स्थानांतरित वर्गों! थपका विषैला होता है। Specifi के पालनसी यानी, प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनते हैं, सप्लायर द्वारा प्रदान की एमएसडीएस,) एक रासायनिक धूआं हुड का उपयोग करें।
- अच्छी तरह से peroxidase रिएक्शन शुरू करने के लिए प्रत्येक के लिए ऊपर के रूप में, शेष 25 मिलीलीटर थपका समाधान के लिए 0.5 मिलीलीटर 1% एच 2 ओ 2 जोड़ें और मिश्रण पिपेट बराबर मात्रा। 12 मिनट के लिए सेते हैं। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला।
- जिलेटिन में स्लाइड के लिए माउंट वर्गों, शुष्क हवा हे / एन। स्थायी बढ़ते मध्यम के साथ coverslip।
- वैकल्पिक: coverslip के रखने से पहले Counterstain (धारा 3.5 देखें)।
नोट: संकेत करने वाली शोर अनुपात क्योंकि उच्च पृष्ठभूमि के कम है, तो अटल बिहारी अभिकर्मक (कदम 3.1.8) के साथ ऊष्मायन के बाद एच 2 ओ 2 उपचार दोहराएँ।
- एकाधिक-इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- एकल या एक साथ कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- टीबीएस में एंटीफ्ऱीज़र से वर्गों स्थानांतरण और अच्छी तरह कुल्ला (4 डिग्री सेल्सियस पर एक बार हे / एन, 10 मिनट के लिए आरटी पर 5 बार प्रत्येक) पूरी तरह से एक को हटाने के लिएtifreeze।
- वैकल्पिक: 3.1.3 कदम के रूप में - 3.1.4।
- Unspecific एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों, आरटी पर एक घंटा ऊतक permeabilize और ब्लॉक करने के लिए TBSplus में सेते हैं।
- प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल में सेते हैं (जैसे, चूहे α-BrdU, गिनी पिग-DCX α, बकरी α GFP) 4 डिग्री सेल्सियस पर TBSplus, ओ / एन में पतला। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला।
- Fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के कॉकटेल में सेते हैं (जैसे, Rhodamine लाल α-चूहे, एलेक्सा-647 α-गिनी पिग, एलेक्सा-488 α-बकरी, सभी गधा में व्युत्पन्न), TBSplus में पतला 3 घंटा आरटी या हे / एन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर। अब से प्रकाश से वर्गों की रक्षा करना। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला।
- जिलेटिन में स्लाइड के लिए माउंट वर्गों, शुष्क हवा हे / एन। जलीय बढ़ते मध्यम के साथ coverslip।
- एक ही मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अनुक्रमिक कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- 3.2.1.3 - 3.2.1.1 कदम के रूप में।
- फाई में सेतेRST प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, खरगोश α-प्रतिजन ए), ओ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- पहले fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, Rhodamine लाल conj। गधा α-खरगोश), 3 घंटा आरटी में सेते हैं। अब से प्रकाश से वर्गों की रक्षा करना। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- पहली माध्यमिक एंटीबॉडी पर खुला paratopes तर करने के लिए 3 घंटा आरटी के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में ही मेजबान (जैसे, खरगोश सीरम) से 10% सामान्य सीरम में सेते हैं। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- 50 माइक्रोग्राम प्रति (जैसे, α-खरगोश आईजीजी (एच + एल)) दूसरा माध्यमिक एंटीबॉडी, ओ / एन में द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है कि epitopes कवर करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के मेजबान के खिलाफ निर्देशित / एमएल विसंयुग्मित monovalent फैब टुकड़े के साथ TBSplus में सेते 4 डिग्री सेल्सियस।
- 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में कम से कम 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला। जबकि स्थानांतरित, संक्षेप में SWAबी एक कागज तौलिया पर वर्गों युक्त जाल आवेषण किसी भी फैब कूड़ा हटाने के लिए।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर दूसरा प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, खरगोश α-प्रतिजन बी), ओ / एन में सेते हैं। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- दूसरे fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, एलेक्सा-488-conj। गधा α-खरगोश), 3 घंटा आरटी में सेते हैं। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला माउंट और ऊपर के रूप में coverslip।
नोट: विभिन्न मेजबान प्रजातियों के लिए उन्हें जोड़ने से एंटीबॉडी के साथ एंटीजन लेबल करने के लिए 3.2.2.2 कदम करने के लिए और संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी 3.2.2.3 कदम करने के लिए।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति से माध्यमिक एंटीबॉडी में से एक
नोट: इस प्रोटोकॉल GFAP, nestin-GFP और DCX के साथ मिलकर BrdU या Ki67 के खिलाफ चौगुनी-धुंधला के लिए उपयुक्त है।- 3.2.1.5 - का पालन सख्ती से प्रोटोकॉल 3.2.1.1 कदम। इस बिंदु तक TBSplus में केवल गधा सीरम का उपयोग करें।
- टी में सेतेआरटी पर 1 घंटे के लिए 3% बकरी सीरम युक्त BSplus। इस α-बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी पर खुला paratopes को शामिल किया गया। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- AMCA-conj में सेते हैं। TBSplus, 3 घंटा आरटी या हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस में पतला बकरी α-खरगोश। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला माउंट और ऊपर के रूप में coverslip।
- CldU, आईडीयू सह-धुंधला
- कुल्ला denature और धारा 3.2.1 के रूप में वर्णित वर्गों बेअसर (- 3.2.1.2 3.2.1.1 कदम)।
- Α-माउस TBSplus में आईजीजी (एच + एल), आरटी पर 1 घंटा 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / विसंयुग्मित फैब टुकड़े के साथ सेते हैं। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 4 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर TBSplus, ओ / एन में पतला: और माउस α-BrdU (350 1), (IgG2 शुद्ध 400 1) चूहा α-BrdU युक्त प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल में सेते हैं। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- Biotinylated गधा युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल में सेते α-चूहे (1: 500) और FITC-conj। गधा α-माउस फैब टुकड़े (1: 100)। 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 3 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला।
- Rhodamine लाल conj में सेते हैं। Streptavidin, आरटी पर 2 घंटा। 15 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला माउंट और ऊपर के रूप में coverslip।
- Nestin-GFP के चूहों में प्रतिदीप्ति संकेत के प्रवर्धन
- प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल के लिए बकरी α-GFP जोड़ें।
- (। ऐसे एलेक्सा 488 conj के रूप में α-बकरी गधा) GFP के लिए इसी तरह के वर्णक्रमीय गुणों के साथ एक fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल के लिए।
- एकल या एक साथ कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- मिलान पुनः प्राप्ति
- एंटीफ्ऱीज़र बाहर rinsing के बाद मिलान पुनः प्राप्ति के लिए बाहर ले। 99 डिग्री सेल्सियस (लगभग 25 मिनट) - 0.1 एम साइट्रेट बफर पीएच 6.0-95 युक्त 6- या 12 अच्छी तरह से प्लेटों के साथ पहले से गरम स्टीमर।
- (30 मिनट के लिए गर्म साइट्रेट बफर और भाप में वर्गों स्थानांतरण प्लास्टिक एल के रूप में एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को कवरआईडी गर्मी प्रतिरोधी नहीं कर रहे हैं)।
- तुरंत नीचे शांत करने के लिए एक बर्फ स्नान में प्लेटें जगह है। यह प्रसव के बाद पशुओं के मस्तिष्क वर्गों के साथ काम कर रहा है जब विशेष महत्व का है जो ऊतक आकृति विज्ञान, की रक्षा के लिए मदद करता है।
- बाहर कुल्ला और साइट्रेट बेअसर और धुंधला जारी रखने के लिए 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार कुल्ला।
- माउस ऊतक पर एंटीबॉडी
- -Α माउस आईजीजी 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / monovalent फैब टुकड़े जोड़ें (एच + एल; माध्यमिक एंटीबॉडी से ही मेजबान-प्रजाति) पहले अवरुद्ध कदम के लिए (जैसे, कदम 3.1.5 या 3.2.1.3)।
- 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस टी में 4 बार टीबीएस में और एक बार कुल्ला, और संबंधित प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
- Cresyl बैंगनी counterstaining
- (ग्लास जार में) 60 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम cresyl बैंगनी समाधान। 3 मिनट के लिए गर्म समाधान में स्लाइड्स सेते हैं।
- AQ में कुल्ला। गंतव्य। और 70% में एक मिनट प्रत्येक, 96% और 100% isopropanol के लिए 2 बार निर्जलीकरण। 6 xylene में मिनट या एक संगत स्थायी बढ़ते मध्यम के साथ एक xylene स्थानापन्न और coverslip - 5 के लिए साफ़।
4. डेटा विश्लेषण
- दांतेदार गाइरस की पूरी rostrocaudal हद साथ हर 6 वें खंड में peroxidase दाग नवजात कोशिकाओं की गणना। 400X बढ़ाई पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
- नवजात कोशिकाओं की कुल संख्या का एक अनुमान प्राप्त करने के लिए चौराहे अंतराल के साथ जिसके परिणामस्वरूप सेल संख्याओं का गुणा।
- छवि प्रतिदीप्ति उपयुक्त लेज़रों और फिल्टर सिस्टम से लैस एक लेजर confocal खुर्दबीन के साथ वर्गों लेबल। 400X बढ़ाई दांतेदार गाइरस के पूरे हद साथ यादृच्छिक पदों पर छवि के ढेर ले लो और अन्य मार्कर के साथ सह-लेबलिंग के लिए गोलार्द्ध प्रति रुचि कम से कम 50 बेतरतीब ढंग से चुनी कोशिकाओं का विश्लेषण।
- पूर्ण गणना करने के लिए नवजात कोशिकाओं की कुल संख्या के साथ सह-लेबल की कोशिकाओं (/ 100%) के परिणामस्वरूप प्रतिशत गुणाविशिष्ट नवजात सेल आबादी की संख्या।
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Representative Results
हम यों और प्रसव के बाद और वयस्क हिप्पोकैम्पस में नवजात कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए ऊपर वर्णित विधि लागू होता है। इसलिए, हम wildtype और न्यूरोजेनेसिस की कमी cyclin डी 2 न्यूरोजेनेसिस की दर (यानी, समृद्ध वातावरण, ईई) 13,14 प्रभावित करने के लिए जाना जाता शर्तों के तहत रखे (Ccnd2 को) चूहों बाहर दस्तक इस्तेमाल किया। Ki67, BrdU, CldU या आईडीयू या तो के खिलाफ Immunohistochemical थपका धुंधला लगातार wildtype और Ccnd2 को चूहों (चित्रा 3) के बीच 15 नवजात सेल नंबर में अंतर का पता चला। इसके अलावा, CldU और आईडीयू की लगातार equimolar इंजेक्शन के साथ हम ईई (चित्रा -3 सी, डी) के विशिष्ट अवधि के दौरान पैदा हुए सेल आबादी भेदभाव करने में सक्षम थे। खंड 3.2.4 अपनाने हम सफलतापूर्वक बराबर संकेत तीव्रता और उनके एक साथ वितरण (चित्रा 4) के बाद CldU और आईडीयू के उत्कृष्ट ओवरलैप पता लगा सकता है। BrdU के लेबल वाले नवजात कोशिकाओं को एक स्टेन के साथ phenotyped किया जा सकता हैया तो एक साथ लागू करने BrdU और NeuN, (चित्रा 5) या BrdU, GFAP, nestin-GFP और DCX एंटीबॉडी (चित्रा 6B) द्वारा दर्द इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि। यह तकनीक सफल पहचान प्रकार 1, 2 ए, 2 बी और एक भी नमूना (चित्रा 6B, डी) के भीतर तीन पूर्वज कोशिकाओं की अनुमति दी। Ki67 और GFAP के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश में उठाया गया के रूप में पूर्वज मार्कर के साथ Ki67 के सह-लेबलिंग में उत्पादन किया गया था इसके अलावा, प्राथमिक एंटीबॉडी के एक (बकरी α GFP) (धारा 3.2.2 के लिए लागू होता है) एंटीबॉडी के अनुक्रमिक आवेदन की आवश्यकता माध्यमिक एंटीबॉडी के एक (AMCA conj। बकरी α-खरगोश) के रूप में एक ही मेजबान। वर्गों nestin-GFP एंटीबॉडी के साथ मिलकर Ki67 में पहली incubated, और दूसरी बात GFAP के एंटीबॉडी में नहीं है लेकिन ठीक इसके विपरीत (चित्रा 6C)। चित्रा 2B अनुमोदित आवेदन योजनाओं का सार रहे थे वर्गों 3.2.2 और 3.2.3 का एक संयोजन पूरी तरह से काम किया।
एक ही मेजबान प्रजातियों से व्युत्पन्न प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ चित्रा 2. अनुक्रमिक कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस। (ए) योजनाबद्ध चित्र। (बी) एंटीबॉडी और immunofluorescence में उनके कालानुक्रमिक क्रम के सफल संयोजन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
दांतेदार गाइरस में नवजात कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए एबीसी immunohistochemistry के चित्रा 3. प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों। चित्रित 100X और 400X बढ़ाई गुम्मट में विभिन्न प्रसार मार्करों और न्यूरोजेनेसिस की कमी Ccnd2 को चूहों की तुलना कर रहे हैं। (ए) G> Ki67-थपका धुंधला दांतेदार गाइरस (प्रसव के बाद दिन 35) के subgranular क्षेत्र में कोशिकाओं proliferating के समूहों से पता चलता है। proliferating कोशिकाओं की संख्या WT चूहों की तुलना में Ccnd2 को चूहों में कम है। (बी) BrdU-प्रशासन (चित्र के ऊपर इंजेक्शन स्कीम) Ccnd2 को चूहों में कम प्रसार दर की पुष्टि के बाद 28 दिनों में नवजात कोशिकाओं। (सी) CldU-प्रशासन ईई (छवि के ऊपर इंजेक्शन स्कीम) के 6 सप्ताह के दौरान गुम्मट के दांतेदार गाइरस में नवजात कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि से पता चला है, लेकिन ईई के 8 वें सप्ताह के दौरान नहीं Ccnd2 को चूहों। (डी) आईडीयू-प्रशासन इसी तरह के परिणाम से पता चला है। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Equimolar सांद्रता के एक साथ प्रसव के बाद CldU और आईडीयू चित्रा 4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस सह-धुंधला। CldU लेबल की कोशिकाओं के संकेत प्रवर्धन CldU और आईडीयू का एक उत्कृष्ट ओवरलैप में हुई। स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
NeuN और BrdU चित्रा 5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस सह लेबलिंग। (ए) BrdU के लगातार 2 दिनों 14. पशु 28 दिन बाद बलिदान किया गया प्रसव के बाद दिन में शुरू करने के लिए 6 बार हर 8 घंटा दिलाई। (बी) परिपक्व neuronal मार्कर के साथ कोशिकाओं proliferating के इम्यूनोफ्लोरेसेंस सह लेबलिंग NeuN proliferating का एक कम संख्या से पता चलता है Ccnd2 Ko में कोशिकाओं डब्ल्यू की तुलनाटी जानवरों। स्केल बार 50 माइक्रोन। (सी) (बी) के बढ़े हुए देखें दोनों जीनोटाइप में सह-लेबल की कोशिकाओं दिखा प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार प्रतिनिधित्व करता है 20 माइक्रोन। (डी) दांतेदार गाइरस में एक BrdU / NeuN सह लेबल सेल के उच्च बढ़ाई उदाहरण। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Nestin-GFP के चूहों की दांतेदार गाइरस में नवजात ग्रेन्युल कोशिकाओं phenotyping के लिए GFAP, nestin-GFP और DCX साथ विभिन्न प्रसार मार्करों के 6 चित्रा चौगुनी इम्यूनोफ्लोरेसेंस सह लेबलिंग। (ए) BrdU के प्रसव के बाद दिन में 70 पर 3 बार हर 2 घंटा दिलाई । पशु 2 घंटा बाद में बलिदान किया गया। BrdU, GFAP के लिए एक सह-धुंधला (बी) प्रतिनिधि छवि,nestin-GFP और Ki67, GFAP, nestin-GFP और DCX के लिए चौगुनी इम्यूनोफ्लोरेसेंस के DCX। (सी) प्रतिनिधि छवि। (डी) उनके immunofluorescence लेबलिंग के अनुसार पूर्वज सेल प्रकार का वर्गीकरण। विभिन्न मार्करों और चार अलग पूर्वज सेल उपप्रकार पहचाना जा सकता है लेबल की कोशिकाओं के रूपात्मक सुविधाओं के सह-अभिव्यक्ति के आधार पर: - प्रकार 2A (GFAP - nestin + DCX टाइप 1 (GFAP +, nestin + DCX) - ), टाइप 2 बी (GFAP - nestin + DCX +) और टाइप 3 (GFAP - nestin - DCX +)। स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (ई) वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस के विभिन्न चरणों के योजनाबद्ध सिंहावलोकन। यह 4 पूर्वज प्रकार की कोशिकाओं, अपरिपक्व न्यूरॉन्स और परिपक्व दाना कोशिकाओं, मार्कर की अपनी विशेषता अभिव्यक्ति और उनके proliferative क्षमता दिखाता है। एमएल - आणविक सेल परत, GCL -बारीक सेल परत, एसजीएल -। subgranular सेल परत इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
7 चित्रा, एक ही प्रजाति में उठाया एंटीबॉडी ऊष्मायन के अनुक्रम के आधार पर दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सफल और गैर सफल अनुक्रमिक stainings का उदाहरण। Confocal micrographs दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ Ki67 और GFAP के खिलाफ एक अनुक्रमिक सह-धुंधला के परिणाम दिखाने खरगोश से निकाली गई। (क) में immunohistochemistry के पहले दो संकेतों की एक स्पष्ट ओवरलैप करने के लिए नेतृत्व जो Ki67 के खिलाफ धुंधला द्वारा पीछा किया GFAP के लिए पूरा किया गया। विशेष रूप से Ki67 संकेत असामान्य था और GFAP धुंधला के संकेत मची। (बी) रिवर्स से परिणामों से पता चलता हैKi67 धुंधला के साथ धुंधला अनुक्रम GFAP के खिलाफ पहले और बाद में धुंधला पूरा किया। इधर, दोनों एंटीजन के लिए संकेतों की उम्मीद है और अभिव्यक्ति पैटर्न मची: GFAP के संकेत मुख्य रूप से subgranular क्षेत्र से उत्पन्न होने वाली सेलुलर प्रक्रियाओं में, cytoplasmatically पाया गया था, जबकि Ki67 संकेत subgranular क्षेत्र के भीतर नाभिक के लिए प्रतिबंधित किया गया था। स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। RhX - Rhodamine एक्स यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
CldU और आईडीयू। चूहे का पता लगाने के लिए किया जाता α-BrdU एंटीबॉडी के 8 चित्रा विशिष्टता CldU के साथ या आईडीयू (गैर एक साथ आवेदन) के साथ या तो इंजेक्शन थे। (ए) CldU (A1) या आईडीयू (ए 2) के मस्तिष्क वर्गों इंजेक्शन चूहों में immu थेnostained माउस α-BrdU के साथ चूहों इंजेक्शन के लिए विशेष रूप से CldU को पार प्रतिक्रिया करनी चाहिए, जो शुद्ध चूहे α-BrdU एंटीबॉडी का उपयोग, लेकिन नहीं आईडीयू करने के लिए। (बी) CldU (बी 1) या आईडीयू (बी 2) से दिमाग धुंधला से परिणामों से पता चलता है उम्मीद है कि एंटीबॉडी CldU आईडीयू के साथ पार प्रतिक्रिया है, लेकिन नहीं। स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मात्रा का ठहराव और नवजात शिशु की कोशिकाओं के उप-जनसंख्या की पहचान वयस्क न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के क्षेत्र में एक केंद्रीय मुद्दा है। वयस्क न्यूरोजेनेसिस के विशिष्ट चरणों के दौरान व्यक्त प्रोटीन के खिलाफ प्रसार मार्करों और एंटीबॉडी के संयोजन इन उप-जनसंख्या के immunohistochemical का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। एंटीबॉडी या एंटीबॉडी संयोजनों में से कुछ विशिष्ट धुंधला स्थितियों की आवश्यकता है।
सिंथेटिक thymidine एनालॉग के साथ कोशिकाओं को विभाजित करने की लेबलिंग अभी भी वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए स्वर्ण मानक है। यह प्रयोग के शुरू करने से पहले उचित इंजेक्शन प्रोटोकॉल पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम आम तौर पर 50 मिलीग्राम / किग्रा (शरीर के वजन, आईपी) BrdU के लिए प्रशासन, लेकिन सांद्रता प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर भिन्न हो सकती है 8,16 (300 मिलीग्राम तक / एक सांस में इंजेक्शन के लिए किग्रा)। आईडीयू और CldU सेल आबादी के अस्थायी भेदभाव के लिए क्रमिक रूप से इंजेक्शन जा चुके हैं यह (equimolar सांद्रता इंजेक्षन करने के लिए अनिवार्य है
Immunostaining के लिए, वर्गों को आम तौर पर एक वाहक थाली से लैस 6 अच्छी तरह प्लेटें में आम तौर पर मुक्त अस्थायी संसाधित और किसी अन्य के लिए एक समाधान से उनके स्थानांतरण जो सरल आवेषण जाल रहे हैं। एक अपवाद के रूप में, अवरुद्ध, एंटीबॉडी incubations और एबीसी प्रतिक्रिया कर रहे हैंजाल आवेषण के बिना 12- या 24 अच्छी तरह प्लेटें महंगा समाधान बचत करने में (0.5 से 1 मिलीलीटर अच्छी तरह से दाग किया जाना है कि स्लाइस की संख्या पर निर्भर करता है, के लिए पर्याप्त है के अनुसार)। इन चरणों के दौरान, समाधान बदलते जब rinsed करने की जरूरत है कि एक ठीक ब्रश की मदद से वर्गों हस्तांतरण। सुखाने-बाहर से वर्गों को रोकने के लिए और एक humified कक्ष में> एक घंटा ले कि incubations प्रदर्शन करते हैं। सभी incubations निरंतर आंदोलन (अधिकतम 150 आरपीएम) के साथ किया जाना है। हमेशा परीक्षण और प्रत्येक नई एंटीबॉडी बहुत टाइट्रेट। लंबे समय तक एंटीबॉडी ऊष्मायन बार (4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए) धुंधला सुधार हो सकता है। मामले में केवल माउस एंटीबॉडी यह अत्यधिक ध्यान केंद्रित monovalent फैब टुकड़े α-माउस (धारा 3.4) के साथ अंतर्जात इम्युनोग्लोबुलिन ब्लॉक करने के लिए सलाह दी जाती है कि आप माउस के ऊतकों में कल्पना करना चाहते एंटीजन के खिलाफ उपलब्ध हैं। इस तकनीक का उपयोग जब भी निम्न rinsing चरणों का विस्तार। अन्यथा, अनबाउंड फैब टुकड़े अपनी प्राथमिक माउस एंटीबॉडी के लिए बाध्य हो सकता है। एचसीएल pretreatment और borateनिराकरण केवल thymidine एनालॉग का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं। 12 मिनट peroxidase प्रतिक्रिया हमारे प्रोटोकॉल में लागू की स्थिति और एंटीबॉडी के साथ एक इष्टतम संकेत करने वाली शोर अनुपात में परिणाम। किसी भी enzymatic प्रतिक्रिया के रूप में, peroxidase प्रतिक्रिया की दर कई कारकों पर निर्भर करता है (उदाहरण के लिए, तापमान, पीएच, एंजाइम और सब्सट्रेट की एकाग्रता)। नतीजतन, प्रतिक्रिया समय किसी भी नए एंटीबॉडी सेट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। (जैसे, CldU) बहुत कमजोर पृष्ठभूमि के साथ थपका दाग में शारीरिक संरचनाओं कल्पना, स्लाइस counterstained जा सकता है। cresyl बैंगनी विधि विशिष्ट थपका संकेत समझौता नहीं करता है कि एक बहुत ही बेहोश counterstain में खंड में 3.5 परिणामों का वर्णन किया।
कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, विभिन्न प्रजातियों में या अलग आइसोटाइप के उठाए गए हैं कि प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें और खंड 3.2.1 का पालन करें। अन्यथा, कई प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है, जो एक अनुक्रमिक कई immunolabeling प्रदर्शनएक ही मेजबान प्रजातियों (; खंड 3.2.2 यानी, माउस या खरगोश) से। इस पद्धति के बुनियादी सिद्धांत को सफलतापूर्वक दो माउस प्राथमिक एंटीबॉडी 17 के साथ अलग अलग मांसपेशी मार्करों दाग जो फर्ग्यूसन और उनके सहयोगियों द्वारा आविष्कार किया गया है। कदम 3.2.2.5 में रोकने के लिए इस्तेमाल किया फैब टुकड़े माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में ही मेजबान प्रजातियों से प्राप्त किया जाना चाहिए। खंड 3.2.2 में वर्णित सांद्रता और ऊष्मायन बार यहाँ बताया विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित कर रहे हैं और किसी भी नए एंटीबॉडी संयोजन के लिए समायोजित किया जाना है। (चित्रा 7A में संकेत के रूप में) प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के अनुक्रम दृढ़ता से परिणाम को प्रभावित कर सकता है कि अवगत रहें। जहां लागू हो, एक ही प्रजाति से निकाली गई है कि प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया एंटीजन अपर्याप्त अवरुद्ध का पता लगाने के जो सरल एक अलग अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाना चाहिए। एंटीबॉडी पार प्रतिक्रिया या झूठी सकारात्मक की किसी भी संभावना को खत्म करने के लिए यह एस्सेन हैTiAl उचित नियंत्रण (यानी, केवल माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण, दूसरा प्राथमिक एंटीबॉडी या अकेले दूसरा माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक ऊष्मायन द्वारा पीछा पहले प्रतिजन के लिए पूर्ण immunohistochemistry) शामिल करने के लिए। 18 चित्रा 2B हमारे हाथ में अच्छी तरह से काम किया है कि एंटीबॉडी संयोजन से पता चलता है। कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए यह एक ही प्रजाति में उठाए गए हैं कि माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, गधा) का उपयोग करें और अपने ऊतकों को न्यूनतम पार जेट है और अन्य प्रजातियों (यानी, पूर्व adsorbed) से प्रोटीन सीरम को भी सलाह दी जाती है। अन्यथा खंड 3.2.3 किसी भी अप्रत्याशित interspecies पार जेट को रोकने में मदद कर सकते हैं। अपनी पहचान प्रणाली के लिए कम से कम वर्णक्रमीय ओवरलैप उपयुक्त साथ fluorochromes चुनें (जैसे, AMCA, एलेक्सा Fluor 488, Rhodamine लाल, एलेक्सा Fluor 647)। एक परमाणु counterstain की आवश्यकता है, तो माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल (करने के लिए DAPI या Hoechst 33342 (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) जोड़ने के लिए, कोई पास यूवी माध्यमिक एंटीबॉडी हमें हो सकता हैईडी)। ऊतक एचसीएल के साथ पूर्व इलाज किया गया है कि अगर इन परमाणु counterstains काम नहीं करते। इसी तरह, एचसीएल उपचार कुछ एंटीजन का पता लगाने के लिए समझौता हो सकता है और इसलिए व्यक्ति एंटीबॉडी प्रदर्शन पर इसके प्रभाव का परीक्षण किया जाना चाहिए। Fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी एक बार प्रकाश से बचाने वर्गों लागू किया गया है।
CldU और आईडीयू पार प्रतिक्रिया है कि दो अलग अलग BrdU एंटीबॉडी की मदद से देखे जा सकते हैं या तो CldU (चूहा α-BrdU) या आईडीयू (माउस α-BrdU) 9,19 के साथ। दोनों thymidine एनालॉग एक जानवर में इंजेक्ट किया गया है तो यह गैर शुद्ध एंटीबॉडी आईडीयू को पार प्रतिक्रिया करते हैं क्योंकि CldU पता लगाने के लिए शुद्ध चूहे α-BrdU एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए बिल्कुल जरूरी है। वेगा एट अल द्वारा वर्णित है। 9 CldU संकेत दोनों thymidine एनालॉग के बराबर का पता लगाने के लक्ष्य को हासिल करने के लिए Immunofluorescent सह लेबलिंग के लिए परिलक्षित होने की जरूरत है। इसलिए, बजाय एक fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (के α-चूहा) एक fluorochrome संयुग्मित streptavidin एक biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी (α-चूहे में ऊष्मायन के बाद जोड़ा जाता है; खंड 3.2.4)। पार प्रतिक्रियाओं आईडीयू या CldU या तो प्राप्त है कि चूहों से नियंत्रण वर्गों में शामिल किसी भी अवांछित एंटीबॉडी बाहर करने के लिए (अलग से, 8 चित्रा देखें)। एक साथ CldU और आईडीयू की equimolar मात्रा में इंजेक्शन के साथ किया गया है कि जानवरों से आईडीयू और CldU उपयोग वर्गों के बराबर का पता लगाने सत्यापित करने के लिए (चित्रा 4 देखें)।
दो पूर्वज कोशिकाओं टाइप 1 का अध्ययन करने और टाइप करने के लिए हम nestin एंटीबॉडी अक्सर संतोषजनक परिणाम नहीं प्रदान की थी के रूप में nestin-GFP ट्रांसजेनिक चूहों 12 उपयोग करने के लिए पसंद करते हैं। Nestin-GFP चूहों मज़बूती से एक विशेष रूप से विकास के चरण में nestin पॉजिटिव पूर्वज कोशिकाओं और उनके रूपात्मक सुविधाओं visualizing का फायदा है। GFP के संकेत एक α-GFP एंटीबॉडी के साथ अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से परिलक्षित होने की जरूरत है। माध्यमिक एंटीबॉडी एक fluorochr के लिए युग्मित किया जाना चाहिएGFP के लिए इसी तरह के वर्णक्रमीय गुणों के साथ ome। यदि आवश्यक हो, nestin-GFP चूहों न्यूरोजेनेसिस में विशेष जीनों की संलिप्तता की जांच के लिए अन्य उत्परिवर्ती माउस लाइनों के लिए संकर जा सकता है। अब तक, सुधार nestin एंटीबॉडी जो लेबल सेल शरीर के साथ ही प्रक्रियाओं आपूर्ति की जाती है और (सामग्री की सूची देखें) ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
यह overfixation को रोकने के लिए 24 घंटे के निर्धारण के साथ पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। ऊतक में formaldehyde के रासायनिक प्रतिक्रिया भागीदारों मुख्य रूप से प्रोटीन होते हैं और formaldehyde (methylene पुलों के गठन के द्वारा) आसन्न अमीनो एसिड के पार से जोड़ने के लिए अग्रणी उनके पक्ष श्रृंखला पर प्रतिक्रियाशील hydroxymethyl समूहों उत्पन्न करता है। यह (सामग्री सूची में विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए टिप्पणी देखें) प्रतिजन epitopes और immunoreactivity के नुकसान की मास्किंग का कारण बन सकता है। खो immunoreactivity को ठीक करने के लिए, कई मिलान पुनः प्राप्ति के तरीकों के माध्यम से ई कि ब्रेक के formaldehyde के प्रेरित प्रोटीन पार लिंकेज मौजूदxposure 20 गर्म करने के लिए। इस प्रोटोकॉल में, साइट्रेट बफर विधि प्रसव के बाद और वयस्क हिप्पोकैम्पस में न्यूरोजेनेसिस का पता लगाने (धारा 3.3) के लिए दूसरों से बेहतर काम करता है। बहुत युवा जानवरों के स्लाइस (<P21) बहुत ही कमजोर या विकृत हो जाते हैं और विशेष देखभाल के साथ संभाला जाना पड़ सकता है कि ध्यान दें। इसके अलावा, मिलान पुनः प्राप्ति के कुछ epitopes के लिए हानिकारक है और इसलिए व्यक्ति एंटीबॉडी वे इस पूर्व उपचार की आवश्यकता है कि कई धुंधला के लिए उपयुक्त हैं कि क्या परीक्षण किया जाना चाहिए हो सकता है।
सारांश में, इस प्रोटोकॉल वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस के विश्लेषण की सुविधा है कि बुनियादी और सविस्तार तकनीकों का एक संग्रह है। यह विशेष रूप से एक ही अनुभाग से एक प्रसार या जन्म-डेटिंग मार्कर के साथ एक साथ सभी हिप्पोकैम्पस पूर्वज उप-जनसंख्या का एक स्पष्ट पहचान देता है। इन तकनीकों में hippocam के विकास और विनियमन अध्ययन करने के लिए एंटीबॉडी के या अन्य प्रजातियों के लिए किसी भी संयोजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैविशिष्ट उत्तेजनाओं और विशेष रूप से मस्तिष्क कार्यों में उनकी भागीदारी के जवाब में पाल पूर्वज कोशिकाओं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
