Abstract
Neurogênese adulta é altamente regulado, processo multi-estágio em que novos neurônios são gerados a partir de uma célula-tronco neurais ativadas via cada vez mais comprometidos subtipos progenitoras intermediários. Cada um destes subtipos expressa um conjunto de marcadores moleculares específicos que, em conjunto com os critérios morfológicos específicos, podem ser usadas para a sua identificação. Tipicamente, técnicas de imunofluorescência, são aplicadas envolvendo anticorpos específicos de subtipo em combinação com marcadores de proliferação exo- ou endógenos. Descrevemos aqui immunolabeling métodos para a detecção e quantificação de todas as fases da neurogénese no hipocampo adulto. Estas incluem a aplicação de análogos da timidina, perfusão transcardial, processamento de tecidos, recuperação antigênica induzida por calor, ABC imunohistoquímica, múltiplos de imunofluorescência indireta, microscopia confocal e quantificação de células. Além disso, apresentamos um protocolo de imunofluorescência sequencial de múltiplas que contorna problemas usually decorrente da necessidade do uso de anticorpos primários levantados nas mesmas espécies hospedeiras. Ele permite a identificação precisa de todos os subtipos progenitoras do hipocampo, juntamente com um marcador de proliferação dentro de uma única seção. Estas técnicas são uma ferramenta poderosa para o estudo da regulação dos diferentes subtipos progenitoras em paralelo, o seu envolvimento em patologias cerebrais e o seu papel em funções específicas do cérebro.
Introduction
Duas regiões do cérebro constitutivamente gerar novos neurónios ao longo da vida, a zona subventricular dos ventrículos laterais e na zona subgranular (SGZ) do giro dentado do hipocampo (DG). Os neurônios recém-nascidos derivam de células progenitoras neurais e passam por diferentes estágios de desenvolvimento morfológico e fisiológico antes de atingirem a maturidade 1,2. A partir de uma glia-like radial células estaminais lentamente dividindo (tipo 1) estágios consecutivos de trânsito amplificando surgem células progenitoras intermediários. Os subtipos mais indiferenciadas (tipo 2A e tipo 2b) tem uma forma irregular, processos com tangenciais curtas. Geram neuroblastos (Tipo 3) que, gradualmente, sair do ciclo celular para se tornar neurónios imaturos (com dendrites estendido para a camada molecular) e, finalmente, integrar na rede de células granulares do hipocampo como maduros. Devido às suas características fisiológicas específicas dessas células fornecer o circuito com maior plasticidade 3 suggesting um papel único na função do hipocampo. Na verdade, os estudos sobre a última década gerou provas substanciais de que a neurogênese adulta contribui para a memória espacial, a separação padrão e comportamento emocional 4,5.
Neurogénese adulto pode ser estudada utilizando diferentes abordagens. Análogos da timidina incorporar em DNA durante a fase S do ciclo celular e permitir o nascimento de encontros, quantificação e análise de células de destino 6-8-nascidos. Aplicação sequencial de diferentes análogos da timidina (eg, CldU Edu ou UDI) pode ser usado para estudar a renovação celular ou populações de células nascidas em diferentes momentos durante o curso de um experimento 9. Uma alternativa, um marcador para a proliferação celular endógeno é Ki67. Ela é expressa em células em divisão, durante todas as fases do ciclo celular (G1, S, G2, H), excepto na fase de repouso (G0), e o início de G1 10,11. Para analisar o fenótipo de populações de células-nascidos no adulto dentate gyrus vários marcadores moleculares específicas de fase podem ser utilizados, tais como a GFAP, nestina, DCX e NeuN 1,6. GFAP é um marcador de astrócitos maduros, mas também é expresso em células da glia, como radiais na parte frontal do cérebro adulto. Nestin é um filamento intermediário específico para células da glia-like radiais e as células progenitoras intermediários iniciais. DCX é uma proteína associada a microtúbulos expressa em progenitores intermediários, neuroblastos imaturos e neurónios. Com base na (co-) expressão destes três marcadores e as características morfológicas das células marcadas quatro subtipos de células progenitoras distintos podem ser identificados: o tipo 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), tipo 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) e tipo 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-rotulagem de DCX em conjunto com NeuN, que é expressa nos neurónios pós-mitóticos, permite a diferenciação de immature (DCX +, NeuN +) e maduro (DCX -, NeuN +) neurônios granulares.
Os marcadores acima mencionados são freqüentemente usados para co-rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal subseqüente ao analisar o número ea identidade das células-nascidos. Isto requer tipicamente anticorpos de diferentes espécies hospedeiras para evitar anticorpo reactividade cruzada indesejada. No entanto, a maioria dos anticorpos primários adequados para investigação neurogénese são levantados, quer em coelhos ou ratinhos (por exemplo, rato α-BrdU, rato α-NeuN, α-Ki67 de coelho, α-GFAP de coelho). Isto leva a sérias limitações no número e combinação de antígenos que possam ser avaliados em uma única fatia. Este, por sua vez, não só aumenta o esforço de coloração, como múltiplas colorações devem ser realizados, mas pode também comprometer a fiabilidade dos resultados. Além disso, alguns antigénios são susceptíveis de formalina induzida por mascaramento epitopo de fixação (por exemplo, Ki67, Nestina). Descrevemos aqui modificações dos protocolos immunolabeling simples e múltipla clássicos (por exemplo, recuperação antigênica, múltiplos immunostaining seqüencial, uso de nestin-GFP camundongos transgênicos 12) que superar muitas destas questões. Em particular, o protocolo de imunofluorescência múltipla sequencial permite coloração contra até quatro antigénios diferentes mesmo se parte dos anticorpos é derivado a partir do mesmo hospedeiro. Isto permite a detecção simultânea de tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo de células progenitoras do tipo 3, bem como a sua actividade proliferativa dentro de uma única secção.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos que envolvem animais vivos foram realizadas em conformidade com a directiva EC 86/609 / CEE orientações sobre cuidados e uso de animais de laboratório e aprovado pelo comitê de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. injeção intraperitoneal de timidina Analogs
- Pesar animais o dia antes da injeção. Calcule a quantidade de timidina analógica necessária para todas as injecções planejadas no dia seguinte, bem como o volume de injecção individuais ajustados ao peso de uma solução estoque de 10 mg / ml.
- Prepare / ml solução estoque timidina 10 mg. (CUIDADO! Análogos da timidina são tóxicos. Siga as Fichas de Dados de Segurança específicas (MSDS) prestados pelos fornecedores, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um exaustor química).
- Tome timidina analógico a partir do congelador e trazê-lo até à temperatura ambiente, aproximadamente. 21 ° C. Pesar 10 mg e adicionarsolução salina estéril (para BrdU e CldU) ou NaOH 0,04 N (em solução salina estéril, por IdU), vortex. Colocar por pelo menos 10 - 15 minutos num banho a 50 ° C e água cada vórtice de 2 - 3 minutos para dissolver o pó.
NOTA: Utilizar soluções para até 24 horas quando armazenada à temperatura ambiente e durante várias semanas a -20 ° C. Proteger as soluções da luz (cubra com papel alumínio). Sempre verifique se há precipitados e re-dissolver, se necessário.
- Tome timidina analógico a partir do congelador e trazê-lo até à temperatura ambiente, aproximadamente. 21 ° C. Pesar 10 mg e adicionarsolução salina estéril (para BrdU e CldU) ou NaOH 0,04 N (em solução salina estéril, por IdU), vortex. Colocar por pelo menos 10 - 15 minutos num banho a 50 ° C e água cada vórtice de 2 - 3 minutos para dissolver o pó.
- Contenha o mouse pela nuca e intraperitoneal injetar um volume apropriado, ajustada ao peso da solução de (pelo RT) utilizando uma seringa de dosagem bem com uma agulha G 30.
NOTA: No caso de CldU e IdU têm de ser administrados sequencialmente dentro de um mesmo animal, considerar a injectar concentrações equimolares (por exemplo, de 42,5 mg / kg de CldU e 57,5 mg / kg IdU, que correspondem a 50 mg / kg de BrdU). Portanto, ajustar os volumes de injecção das soluções de 10 mg / ml em conformidade.
2. Preparação de tecidos
- Prepare formaldeído a 4% em 0,1 M de tampão de fosfato pH 7,4 no dia antes da perfusão. Armazenar a 4 ° C.
- Transcardialmente perfundir os ratinhos anestesiados profundamente (3,5% de isoflurano) através do ventrículo esquerdo com 10 ml de PBS gelado, em seguida, com 40 ml de gelo-frio formaldeído (taxa de fluxo de 5 ml / min). Dissecar o cérebro e pós-fix no mesmo fixador durante 24 horas a 4 ° C.
- Transferir os cérebros consecutivamente em 10% (24 h a 4 ° C) e 30% de sacarose (até as pias cerebrais, aprox. 48 h). Para o congelamento, lentamente submergir os cérebros crioprotegidos em -25 ° C isopentano até sem bolhas surgem a partir do tecido. Armazenar a -80 ° C.
- Corte cortes coronais de 40 m de espessura em um micrótomo de congelação (temperatura do bloco a -25 a -16 ° C). Secções de transferência sequencialmente em solução anticongelante contendo poços de uma placa de 24 poços de cultura de células (ver Figura 1). Armazenar a -20 ° C.
Figura 1. Ilustração esquemática de transferência de fatias do micrótomo em uma placa de 24 poços. Comece na A1 e coloque fatias subsequentes na fileira A, após A6 ir para a próxima linha B e assim por diante. Ao atingir D6, volte para A1 e continuar. Este arranjo de fatias permite a quantificação de cada enésima secção de um cérebro inteiro. Para a quantificação de células recém-nascidas tomar todos os 6 th secção cérebro (equivalente ao conteúdo de uma coluna), para imunofluorescência fenotipagem tomar cada 12 th secção (equivalente ao conteúdo de duas fileiras alternadas de uma coluna).
3. Immunostaining
NOTA: As seções são processadas livre flutuação, normalmente em placas de 6 poços equipados com uma placa de suporte e inserções de malha. Como exceção, o bloqueio, incubações de anticorpos e reação ABC são feitos em 12 ou 24 poços placas sem inserções de malha (0,5 a 1 ml por well é suficiente, dependendo do número de fatias que têm de ser marcadas). Durante estas etapas, transferir seções com a ajuda de um pincel fino (enxaguar com cada nova solução). Todas as incubações são realizadas com agitação contínua (máx 150 rpm).
- A imuno-histoquímica (método ABC)
- Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente anti-congelante.
- Incubar durante 30 min em 1,5% de H 2 O 2 em TBS-T, para extinguir a actividade da peroxidase endógena. Preste atenção ao borbulhar e re-submergir seções se necessário. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
- Opcional: Entretanto pré-aquecer uma câmara de aquecimento e HCl 2 N a 37 ° C. Incubar secções durante 30 min a 37 ° C em HCl 2 N para desnaturar o ADN. Delicadamente seções separadas com a ajuda de um pincel.
- Opcional: Neutralizar secções durante 10 minutos em 0,1 M de borato de pH8,5, RT. Durante a transferência, pincelar brevemente as inserções de malha contendo as seções sobre uma toalha de papel para remover restos de HCl. Lavar duas vezes em TBS durante 15 minutos cada.
- Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e para bloquear os locais de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA.
- Incubar em anticorpo primário diluído em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
- Incubar em anticorpo secundário biotinilado diluído em TBSplus, 3 horas à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. Enquanto isso ...
- Prepare complexo ABC de acordo com o protocolo do fabricante (1% A + B 1% em TBS-T). Deixa-se repousar durante 30 min à temperatura ambiente antes da sua utilização. Incubar em secções reagente AB durante 1 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
- Preparar 50 ml de 0,5 mg / ml de DAB em TBS-T, por 6 ou 12 poços, dividida em duas metades e pipetas 4 ml ou 2 ml por poço, respectivamente. Seções transferência para solução de DAB (CUIDADO! DAB é tóxico. Siga o específic MSDS fornecidas pelo fornecedor, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um fume hood química).
- Adicionar 0,5 ml de 1% de H 2 O 2 para a solução DAB 25 ml restantes, misturar e pipeta volumes equivalentes, tal como acima, para cada poço para iniciar a reacção de peroxidase. Incubar por 12 min. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
- Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem permanente.
- Opcional: contracorante antes de colocar a lamela (ver secção 3.5).
NOTA: Se a relação de sinal-para-ruído é baixo por causa da elevada interferência de fundo, repetir H 2 O 2 de tratamento após a incubação com o reagente de AB (passo 3.1.8).
- Múltiplo-imunofluorescência
- Imunofluorescência múltipla de solteiro ou simultânea
- Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente umtifreeze.
- Opcional: como as etapas 3.1.3 - 3.1.4.
- Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e bloquear os sítios de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA.
- Incubar em cocktail de anticorpo primário (por exemplo, α-BrdU de rato, cobaia α-DCX, α-GFP) de cabra diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
- Incubar em coquetel de anticorpos secundários fluorochrome conjugado (por exemplo, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cobaia, Alexa-488 α-cabra; todos derivados de burro) diluído em TBSplus, 3 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
- Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem aquoso.
- Imunofluorescência múltipla seqüencial com anticorpos primários de espécies hospedeiras mesmos
- Como as etapas 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- Incubar em fiprimeiro anticorpo primário (por exemplo, α-antigénio de coelho A), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em primeiro anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, vermelho de rodamina-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em 10% de soro normal a partir do mesmo host que os anticorpos primários (por exemplo, soro de coelho) por 3 hr RT para saturar paratopos abertas no primeiro anticorpo secundário. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em TBSplus com 50 ug / fragmentos Fab monovalentes unconjugated ml contra o exército dos anticorpos primários (por exemplo, IgG α-coelho (H + L)) para cobrir epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário, O / N no 4 ° C.
- Lavar pelo menos 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. Durante a transferência, swa brevementeb as inserções de malha contendo os cortes em uma toalha de papel para remover quaisquer restos Fab.
- Incubar em segundo anticorpo primário (por exemplo, de coelho α antigénio-B), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em segundo anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, Alexa-488-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima.
NOTA: Para identificar antígenos com anticorpos de diferentes espécies hospedeiras adicioná-los para a etapa 3.2.2.2 e os respectivos anticorpos secundários para a etapa 3.2.2.3.
- Um dos anticorpos secundários provenientes mesma espécie como um dos anticorpos primários
NOTA: Este protocolo é adequado para quadruple-coloração contra BrdU ou Ki67 juntamente com GFAP, nestin-GFP e DCX.- Siga rigorosamente o protocolo passos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Até este ponto utilizar apenas soro de burro em TBSplus.
- Incubar em TBSplus contendo 3% de soro de cabra durante 1 h à TA. Isto cobre paratopos abertas no anticorpo secundário de cabra-α. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em AMCA conj. α-cabra de coelho diluído em TBSplus, TA 3 horas ou O / N a 4 ° C. Lavar três vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima.
- Co-coloração CldU, IdU
- Lavar, desnaturar e neutralizar seções como descrito no ponto 3.2.1 (passos 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- Incubar com 20 ug / ml de fragmentos Fab não conjugados α-IgG de ratinho (H + L) em TBSplus, 1 h à TA. Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em cocktail de anticorpo primário contendo α-BrdU de rato (1: 400; purificado IgG2), e rato α-BrdU (1: 350) diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em cocktail de anticorpo secundário contendo de burro biotinilados α-rato (1: 500) e FITC-conj. burro α-Rato fragmentos Fab (1: 100). Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
- Incubar em vermelho-Rodamina conj. Estreptavidina, 2 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima.
- A amplificação do sinal de fluorescência em ratinhos nestina-GFP
- Adicionar cabra α-GFP para o cocktail de anticorpo primário.
- Adicionar um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo propriedades espectrais semelhantes a GFP (tais como Alexa 488 conj. Α-cabra de burro) para o cocktail de anticorpo secundário.
- Imunofluorescência múltipla de solteiro ou simultânea
- Recuperação Epitope
- Realizar recuperação antigênica após enxaguar anticongelante. Pré-aqueça o vapor com 6 ou 12 poços contendo placas de tampão citrato 0,1 M pH 6,0-95 - 99 ° C (aproximadamente 25 minutos).
- Transfira as seções para o tampão citrato quente e vapor durante 30 minutos (cobrir as placas com folha de alumínio como plástico lids não são resistentes ao calor).
- Colocar imediatamente as placas num banho de gelo para arrefecer. Isso ajuda a proteger a morfologia do tecido, o que é de particular importância quando se trabalha com secções de cérebro de animais após o nascimento.
- Lavar 3 vezes em TBS durante 10 minutos cada para lavar e neutralizar o citrato e continuar a coloração.
- Anticorpos de rato sobre o tecido do mouse
- Adicionar / ml de fragmentos de 20 ug monovalentes Fab α-IgG de ratinho (H + L; mesmas espécies hospedeiras-anticorpo secundário) do que para o primeiro passo de bloqueio (por exemplo, o passo 3.1.5 ou 3.2.1.3).
- Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada, e prosseguir com respectivo protocolo.
- Cresyl counterstaining violeta
- Pré-aqueça solução violeta de cresilo a 60 ° C (em frasco de vidro). Incubar as lâminas na solução quente por 3 min.
- Enxágüe em aq. dest. e desidratar 2 vezes durante 1 minuto cada em 70%, 96% e 100% de isopropanol. Limpar por 5-6 min em xileno ou um substituto xileno e lamela com um meio de montagem permanente compatível.
Análise 4. Dados
- Contagem de células coradas em recém-nascidos com peroxidase a cada po 6 corte ao longo de toda a extensão rostro-caudal do giro dentado. Use um microscópio de luz em aumento de 400X.
- Multiplicar o número de células resultantes com o intervalo de intersecção para obter uma estimativa do número total de células recém-nascidas.
- A imagem de fluorescência marcado secções com um microscópio confocal de laser equipado com lasers adequados e sistemas de filtragem. Leve pilhas de imagens em posições aleatórias ao longo de toda a extensão do giro denteado no aumento de 400X e analisar pelo menos 50 células selecionadas aleatoriamente de interesse por hemisfério para co-rotulagem com outros marcadores.
- Multiplicar as percentagens calculadas de células co-rotulado (% / 100) com os números totais de células recém-nascidos para calcular absolutonúmero de populações de células específicas de recém-nascidos.
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Representative Results
Foram aplicados os métodos descritos acima para quantificar e caracterizar células-nascidos nas pós-natais e adultos hipocampo. Portanto, nós utilizamos wildtype e neurogênese deficiente ciclina D2 vazar (Ccnd2 KO) alojados em condições conhecidos por afetar a taxa de neurogênese (ou seja, o ambiente enriquecido, EE) 13,14. A coloração imuno-histoquímica contra DAB ou Ki67, BrdU, CldU ou IdU revelou consistentemente diferenças no número de células entre os recém-nascidos de tipo selvagem e KO Ccnd2 ratinhos (Figura 3) 15. Além disso, com injeções equimolares consecutivos de CldU e IdU fomos capazes de discriminar populações de células nascidas durante períodos específicos da EE (Figura 3C, D). Adotando seção 3.2.4 que pode detectar com sucesso intensidades de sinais iguais e excelente sobreposição de CldU e IdU após a sua entrega simultânea (Figura 4). BrdU marcado células recém-nascidos poderiam ser fenotipados com um standard método de imunofluorescência ou por aplicação simultânea de BrdU e NeuN, (Figura 5) ou de BrdU, GFAP, nestina-GFP e anticorpos DCX (Figura 6B). Esta técnica permitiu uma identificação bem sucedida tipo 1, 2a, 2b e 3 células progenitoras dentro de um único espécime (Figura 6B, D). Co-marcação de Ki67 com marcadores progenitoras necessária a aplicação sequencial de anticorpos, tal como anticorpos primários contra Ki67 GFAP e foram produzidos em coelho (aplica-se a secção 3.2.2), por outro lado um dos anticorpos primários (cabra α-GFP) foi produzido no mesmo hospedeiro como um dos anticorpos secundários (AMCA conj. α-cabra de coelho). Uma combinação de seções 3.2.2 e 3.2.3 perfeitamente funcionado se cortes foram incubados pela primeira vez em Ki67 juntamente com anticorpo nestin-GFP, e em segundo lugar no anticorpo GFAP mas não vice-versa (Figura 6C). Figura 2B resume os esquemas de aplicativos aprovados.
Figura 2. imunofluorescência Sequential múltipla com anticorpos primários provenientes das mesmas espécies hospedeiras. (A) Ilustração esquemática. (B) combinações de sucesso de anticorpos e sua ordem cronológica de imunofluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens de Microscopia de Luz ABC-imunohistoquímica para quantificação de células recém-nascidas no giro dentado. Descritos são comparações de diferentes marcadores de proliferação em WT e camundongos Ccnd2 KO neurogênese deficiente de 100X e 400X ampliação. (A) g> Ki67-DAB coloração mostra agregados de células em proliferação na zona subgranular do giro dentado (35 dias após o nascimento). O número de células em proliferação é diminuída em ratinhos KO Ccnd2 em comparação com ratinhos WT. (B) células recém-nascidos nos 28 dias após a administração de BrdU (regime de injecção acima imagens) confirmando a taxa de proliferação reduzida em ratinhos Ccnd2 KO. (C) A administração CldU durante a 6ª semana de EE (esquema de injeção imagem acima) revelou um aumento no número de células recém-nascidas no giro dentado do WT, mas não ratos Ccnd2 KO. (D) IdU-administração durante a 8ª semana de EE mostrou resultados semelhantes. Barra de escala representa 50 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. Imunofluorescência co-coloração de CldU e IdU após a entrega simultânea de concentrações equimolares. Amplificação de sinal de células CldU rotulados resultou em uma excelente sobreposição de CldU e UDI. Barra de escala representa 20 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imunofluorescência co-rotulagem de NeuN e BrdU. (A) BrdU foi administrado 6 vezes a cada 8 h durante 2 dias consecutivos, começando no dia pós-natal 14. Os animais foram sacrificados 28 dias mais tarde. (B) Imunofluorescência co-marcação de células em proliferação com o marcador neuronal madura NeuN mostra um número reduzido de proliferação células em comparação com Ccnd2 KO WAnimais T. Barra de escala representa 50 mm. (C) Visão ampliada de (B) mostrando células co-marcado em ambos os genótipos. A barra de escala representa 20 um. (D) Ampliação elevada exemplo de um / NeuN célula co-marcado com BrdU no giro dentado. Barra de escala representa 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. imunofluorescência Quádrupla co-marcação de diferentes marcadores de proliferação com GFAP, nestina-GFP e DCX para fenotipagem de células de grânulos de recém-nascidos no giro dentado de ratinhos nestina-GFP. (A) BrdU foi administrado 3 vezes a cada 2 horas a 70 dias após o nascimento . Os animais foram sacrificados duas horas mais tarde. (B) Imagem representativa de um co-coloração para BrdU, GFAP,nestin-GFP e DCX. (C) Imagem representativa de imunofluorescência quadruple para Ki67, GFAP, nestin-GFP e DCX. (D) A classificação dos tipos de células progenitoras de acordo com a sua rotulagem de imunofluorescência. Com base na co-expressão de diferentes marcadores e as características morfológicas das células marcadas quatro subtipos distintos de células progenitoras podem ser identificadas: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestina +, DCX - ), tipo 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) e tipo 3 (GFAP -, nestin -, DCX +). Barra de escala representa 20 mm. (E) Visão esquemática das diferentes fases da neurogênese adulta. Ele ilustra os tipos 4 progenitoras de células, os neurônios imaturos e células granulares maduros, sua expressão característica de marcadores e sua capacidade proliferativa. ML - camada de células molecular, GCL -camada granular, SGL -. camada de células subgranular Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Exemplo de colorações seqüenciais de sucesso e não-sucedidas com dois anticorpos primários levantados na mesma espécie, dependendo da seqüência de anticorpo incubação. As micrografias confocal mostrar o resultado de uma co-coloração seqüencial contra Ki67 e GFAP com anticorpos primários tanto derivado de coelho. Em (A) imuno-histoquímica foi completada primeiro para a GFAP, seguido de coloração contra Ki67, que levou a uma pronunciada sobreposição dos dois sinais. Em particular, o sinal de Ki67 foi atípico e assemelhava-se ao sinal da coloração GFAP. (B) mostra os resultados do reversosequência de coloração com a coloração Ki67 completada primeiro e posterior coloração contra GFAP. Aqui, os sinais para ambos os antigénios de se assemelhava ao padrão de expressão esperada: O sinal de Ki67 foi restrita aos núcleos dentro da zona subgranular, enquanto o sinal de GFAP foi encontrada no citoplasma, principalmente nos processos celulares resultantes da zona subgranular. Barra de escala representa 20 um. RHX - Rhodamine X. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Especificidade dos anticorpos α-BrdU utilizados para detectar CldU e IdU. Os ratos foram injectados quer com CldU ou com IdU (aplicação não simultâneo). Em (A) secções de cérebro de CldU (A1) ou IdU (A2) foram injectados ratinhos imunonostained utilizando o anticorpo de rato purificado α-BrdU que deve reagir de forma cruzada especificamente para CldU, mas não para IdU. (B) mostra os resultados de coloração de cérebros de CldU (B1) ou IdU (B2) os camundongos injetados com o rato α-BrdU anticorpo que se espera que reagem de forma cruzada com IdU, mas não CldU. Barra de escala representa 20 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A quantificação e identificação de subpopulações de células-nascidos é uma questão central na pesquisa neurogênese adulta. Combinando marcadores de proliferação e de anticorpos contra as proteínas expressas durante fases específicas da neurogênese adulta permite a detecção imuno-histoquímica destas subpopulações. Alguns dos anticorpos ou combinações de anticorpos específicos requerem condições de coloração.
Rotulagem de divisão de células com análogos da timidina sintéticos ainda é o padrão ouro para o estudo da neurogênese adulta. É importante a considerar o protocolo de injecção apropriada antes do início da experiência. Nós normalmente administrar 50 mg / kg (peso corporal, ip) de BrdU, mas as concentrações podem variar de acordo com requisitos experimentais (até 300 mg / kg por injecção em bólus) 8,16. Se IdU e CldU têm de ser injectados sequencialmente para discriminação temporal de populações de células é obrigatório para injetar concentrações equimolares (
Para immunostaining, as seções são geralmente processadas livre flutuação, normalmente em placas de 6 poços equipados com uma placa de suporte e inserções de malha que simplifica a sua transferência a partir de uma solução para outra. Como exceção, o bloqueio, incubações de anticorpos e reação ABC são feitasem 12 ou de 24 poços, placas sem inserções de malha para economizar soluções caras (0,5 a 1 ml por poço é suficiente, dependendo do número de fatias que têm de ser marcadas). Durante estes passos, transferir secções com a ajuda de um pincel fino que precisa de ser lavado quando se muda soluções. Prevenir seções de secagem-out e executar as incubações que levam> 1 hora em uma câmara humificadas. Todas as incubações tem que ser feito com agitação contínua (máx 150 rpm). Sempre teste e titular cada novo lote de anticorpos. Tempos mais longos de incubação de anticorpo (até 2 dias a 4 ° C) pode melhorar a coloração. No caso de apenas anticorpos de rato estão disponíveis contra os antígenos que deseja visualizar em tecido rato é aconselhável bloquear imunoglobulinas endógenas com fragmentos Fab monovalentes altamente concentrada α-rato (seção 3.4). Sempre que usar esta técnica estender as seguintes etapas de lavagem. Caso contrário, os fragmentos Fab não ligados pode ligar para o seu anticorpo primário mouse. HCl pré-tratamento e boratoneutralização são necessárias apenas para a detecção de análogos da timidina. O resultado da reacção da peroxidase em 12 min uma relação óptima de sinal-para-ruído com as condições e os anticorpos utilizados no nosso protocolo. Tal como acontece com qualquer reacção enzimática, a taxa de reacção de peroxidase depende de vários factores (por exemplo, temperatura, pH, concentração de enzima e substrato). Consequentemente, os tempos de reação precisa ser otimizado para qualquer novo conjunto de anticorpos. Para visualizar estruturas anatômicas em manchas DAB com fundo muito fraca (por exemplo, CldU), fatias podem ser contrastadas. O método cresyl violeta descrito no ponto 3.5 resulta em um leve counterstain que não comprometa o sinal DAB específico.
Para imunofluorescência múltipla, usar anticorpos primários que são levantadas em diferentes espécies ou de diferentes isotipos e siga seção 3.2.1. Caso contrário, faça uma imunomarcação múltipla seqüencial que foi otimizado para detectar vários anticorpos primáriosa partir das mesmas espécies hospedeiras (isto é, do rato ou do coelho; seção 3.2.2). O princípio básico deste método foi inventado por Ferguson e colegas que manchadas com sucesso diferentes marcadores musculares com dois rato primários anticorpos 17. Os fragmentos Fab por forma a bloquear no passo 3.2.2.5 deve ser derivado da mesma espécie hospedeira como anticorpos secundários. As concentrações e os tempos de incubação descritos na secção 3.2.2 são optimizados para os anticorpos específicos aqui descritos e têm de ser ajustados para qualquer nova combinação de anticorpo. Esteja ciente de que a seqüência de incubação do anticorpo primário pode influenciar fortemente o resultado (como indicado na figura 7A). Sempre que aplicável, os antigénios detectados pelos anticorpos primários que são derivados a partir da mesma espécie devem mostrar um padrão de expressão diferente, o que simplifica a detecção de bloqueio insuficiente. Para eliminar qualquer possibilidade de reação cruzada de anticorpos ou falso-positivos é essencial para incluir controles apropriados (ou seja, controles somente secundárias de anticorpos; imunohistoquímica completo para o primeiro antígeno seguido por um período de incubação com o segundo anticorpo primário ou segundo anticorpo secundário sozinho). 18 Figura 2B mostra combinações de anticorpos que funcionaram bem em nossas mãos. Para imunofluorescência múltiplo também é aconselhável a utilização de anticorpos secundários que são gerados na mesma espécie (por exemplo, de burro) e ter o mínimo de reactividade cruzada para o tecido e ao soro proteínas de outras espécies (ou seja, pré-adsorvida). Caso contrário, a seção 3.2.3 pode ajudar a prevenir quaisquer interspecies inesperados reatividade cruzada. Selecione fluorocromos com o mínimo adequado sobreposição espectral para o seu sistema de detecção (por exemplo, AMCA, Alexa Fluor 488, Rhodamine Red, Alexa Fluor 647). Se um contraste nuclear é necessário, adicionar DAPI ou Hoechst 33342 (10 ug / ml) para a mistura de anticorpos secundários (em seguida, sem no UV próximo do anticorpo secundário pode ser nósed). Estes counterstains nucleares não funcionam se o tecido foi pré-tratada com HCl. Analogamente, o tratamento de HCl pode comprometer a detecção de alguns antigénios e, portanto, a sua influência sobre o desempenho do anticorpo indivíduo precisa de ser testado. Uma vez que os anticorpos secundários fluorochrome conjugado foram aplicadas seções proteger da luz.
CldU e IdU pode ser visualizado com a ajuda de dois anticorpos diferentes para BrdU que reagem de forma cruzada tanto com CldU (rato α-BrdU) ou IdU (rato α-BrdU) 9,19. Se ambos os análogos de timidina foram injectados em um animal, é absolutamente essencial para utilizar o anticorpo de rato purificado α-BrdU para detectar CldU porque o anticorpo não purificado reage de forma cruzada para IdU. Como descrito por Vega et al. 9, o sinal de CldU precisa ser amplificado para co-marcação imunofluorescente para conseguir a detecção equivalente de ambos os análogos de timidina. Portanto, em vez de um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo (α-rato) a estreptavidina conjugada fluorocromo é adicionado após incubação em um anticorpo secundário biotinilado (α-rato; seção 3.2.4). Para excluir qualquer anticorpo indesejada reacções cruzadas incluem secções de controlo de ratos que receberam ou IdU ou CldU (separadamente; ver Figura 8). Para verificar a detecção equivalente a UDI e CldU seções uso de animais que foram injetadas simultaneamente com quantidades equimolares de CldU e UDI (ver Figura 4).
Para estudar o tipo 1 e tipo 2 células progenitoras nós preferimos usar nestin-GFP camundongos transgênicos 12 como anticorpos nestin freqüentemente não forneceu resultados satisfatórios. Ratinhos nestina-GFP tem a vantagem de visualizar de forma fiável células progenitoras nestina-positivas e as suas características morfológicas, numa fase de desenvolvimento particular. O sinal de GFP-precisa de ser amplificado por meio de imunofluorescência indirecta com um anticorpo GFP-α. O anticorpo secundário deve ser acoplado a um fluorochrome com propriedades espectrais semelhantes a GFP. Se necessário, os ratinhos nestina-GFP podem ser cruzados com outras linhagens mutantes do rato para investigar o envolvimento dos genes particulares em neurogenesis. Até agora, os anticorpos nestina melhoradas que são fornecidos corpos celulares etiqueta assim como os processos e pode ser usado como uma alternativa à abordagem transgénica (ver lista de materiais).
É fundamental respeitar a fixação de 24 horas para evitar excessiva fixação. Os parceiros da reacção química de formaldeído no tecido são principalmente proteínas e formaldeído gera grupos hidroximetilo reactivos nas suas cadeias laterais que levam a reticulação de aminoácidos adjacentes (por formação de pontes de metileno). Isso pode fazer com mascaramento de antígeno-epítopos e perda de immunoreactivity (ver comentários ao anticorpos específicos na Lista de Materiais). Para recuperar immunoreactivity perdido, vários métodos de recuperação de epitopo a existência de proteína induzida por formaldeído quebra de ligações cruzadas através de eXposure para aquecer a 20. Neste protocolo, o método tampão citrato funciona superior aos outros para a detecção de neurogênese no pós-natais e adultos hipocampo (seção 3.3). Note-se que as fatias de animais muito jovens (<P21) pode tornar-se muito frágil ou distorcida e precisam ser manuseados com cuidado especial. Além disso, a recuperação de epítopo pode ser prejudicial para alguns epítopos de anticorpos individuais e, por conseguinte, deve ser testado se eles são adequados para a coloração múltipla exige que este pré-tratamento.
Em resumo, este protocolo é um conjunto de técnicas básicas e elaboradas que facilitem a análise da neurogênese adulta. É particularmente permite uma identificação inequívoca de todas as subpopulações progenitoras do hipocampo, juntamente com a proliferação ou marcador nascimento-dating a partir de uma única seção. Estas técnicas podem ser adaptadas a qualquer combinação de anticorpos ou de outras espécies para estudar o desenvolvimento e regulação de hippocamcélulas progenitoras pal em resposta a estímulos específicos e seu envolvimento em particular as funções cerebrais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
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