Abstract
Voksen nevrogenesen er et meget regulert, flertrinns prosess hvor nye neuroner er generert fra et aktivert neural stamcelle via stadig engasjerte mellom progenitor subtyper. Hver av disse undertypene uttrykker et sett av spesifikke molekylære markører som, sammen med bestemte morfologiske kriterier, kan brukes for deres identifisering. Vanligvis blir immunofluorescerende teknikker anvendt involverer subtype-spesifikke antistoffer i kombinasjon med ekso- eller endogene sprednings markører. Vi her beskrive immunolabeling metoder for påvisning og kvantifisering av alle stadier av voksen hippocampus neurogenesis. Disse omfatter bruk av tymidin-analoger, transcardial perfusjon, vev behandling, varme-indusert epitope henting, ABC immunhistokjemi, flere indirekte immunfluorescens, konfokal mikroskopi og celle kvantifisering. Videre kan vi presentere en sekvensiell multippel immunfluorescens protokoll som omgår problemene usually som følge av behovet for å bruke primære antistoffer dannet i de samme vertsarter. Den lar en nøyaktig identifikasjon av alle hippocampus progenitor undergrupper sammen med en spredning markør innenfor en enkelt seksjon. Disse teknikkene er et kraftig verktøy for å studere regulering av ulike progenitor subtyper parallelt, deres engasjement i hjernesykdommer og deres rolle i spesifikke hjernefunksjoner.
Introduction
To hjerneregioner konstitutivt generere nye nerveceller gjennom hele livet, subventricular sonen av de laterale ventrikler og subgranular sone (SGZ) av hippocampal dentate gyrus (DG). De nyfødte nerveceller stammer fra nevrale stamceller og gå gjennom ulike stadier av morfologiske og fysiologiske utvikling før de når modenhet 1,2. Fra en sakte dele radial gliaceller-lignende stamcelle (type 1) stadier i transitt forsterke mellom stamceller oppstår. De mer udifferensierte undergrupper (type 2a og type 2b) har en uregelmessig form med korte, tangentielle prosesser. De genererer neuroblasts (type 3) som gradvis avslutte cellesyklus til å bli umodne nerveceller (med dendritter utvidet mot molekylær lag) og til slutt integreres i hippocampus nettverk som modne granule celler. På grunn av sine spesielle fysiologiske egenskaper disse cellene gi kretsene med forbedrede plastisitet 3 forslagting en unik rolle i hippocampus funksjon. Egentlig studier av det siste tiåret generert betydelig bevis for at voksen neurogenesis bidrar til romlig minne, mønster separasjon og emosjonelle oppførsel 4,5.
Voksen neurogenesis kan studeres ved hjelp av ulike tilnærminger. Tymidin analoger innlemme i DNA i S-fasen av cellesyklus og tillater fødsel dateres, kvantifisering og skjebnen analyse av nyfødte celler 6-8. Sekvensiell anvendelse av ulike tymidin-analoger (f.eks CldU, Edu eller IDU) kan brukes til å studere cellefornyelsen eller celle populasjoner født ved ulike tidspunkt i løpet av et eksperiment 9. En alternativ, endogen markør for celleformering er Ki67. Den er uttrykt i delende celler i alle faser av cellesyklusen (G1, S og G2, M), bortsett fra hvilefase (G0) og begynnelsen av G1 10,11. For å analysere fenotypen av nyfødte cellepopulasjoner i voksen dentate gyrus flere scene-spesifikke molekylære markører kan brukes som GFAP, nestin, DCX og Neun 1,6. GFAP er en markør for modne astrocytter men kommer også til uttrykk i radial gliaceller-lignende celler i voksen forhjerne. Nestin er et mellomliggende filament spesifikk for radiale gliaceller-lignende celler og tidlig mellom stamceller. DCX er en microtubule-assosiert protein uttrykt i mellom stamceller, neuroblasts og umodne nerveceller. Basert på (med) uttrykk for disse tre markørene og morfologiske trekk ved de merkede cellene fire distinkte stamcelle subtyper kan identifiseres: type 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), type 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), type 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) og type 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-merking av DCX sammen med Neun, som er uttrykt i postmitotic neuroner, tillater differensiering av immature (DCX +, Neun +) og moden (DCX -, Neun +) granule nevroner.
De ovenfor nevnte markører blir ofte brukt for immunofluorescerende co-merking og påfølgende konfokal mikroskopi for å analysere antallet og identiteten til nyfødte celler. Dette krever vanligvis antistoffer fra ulike vertsarter for å hindre uønsket antistoff kryssreaktivitet. Imidlertid er de fleste av primære antistoffer egnet for neurogenesis forskning hevet enten i kaniner eller mus (f.eks muse α-BrdU, mus α-Neun, kanin α-Ki67, kanin α-GFAP). Dette fører til alvorlige begrensninger i antall og kombinasjoner av antigener som kan bli evaluert i et enkelt stykke. Dette i sin tur øker ikke bare flekker innsats, som flere stainings må utføres, men kan også svekke påliteligheten av resultatene. Videre har en del antigenene er utsatt for fiksering formalin-indusert epitop maskering (f.eks Ki67, Nestin). Vi her beskriver endringer fra de klassiske en- og fler immunolabeling protokoller (f.eks epitope henting, multippel sekvensiell farging, bruk av nestin-GFP transgene mus 12) som overvinne mange av disse spørsmålene. Særlig gjør den sekvensielle flere immunfluorescens protokollen flekker mot opptil fire forskjellige antigener selv om en del av antistoffene er avledet fra den samme vert. Dette muliggjør simultan deteksjon av type 1, type 2a, 2b typen og type 3-progenitorceller, så vel som deres proliferativ aktivitet i et enkelt avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer som involverer levende dyr ble utført i henhold til EU-direktiv 86/609 / EEC-forskrifter om omsorg og bruk av forsøksdyr og godkjent av lokal etisk komité (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. intraperitoneal injeksjon av thymidin Analoger
- Veie dyr dagen før injeksjon. Beregne mengden av tymidinanalog kreves for alle injeksjoner planlagt på neste dag, så vel som individuelle vektjustert injeksjonsvolumer av en 10 mg / ml stamløsning.
- Forbered 10 mg / ml tymidin stamløsning. (OBS! Thymidin analoger er giftig. Følg de spesifikke HMS-datablad (MSDS) som tilbys av leverandørene, dvs. slitasje laboratoriefrakk og hansker, bruke avtrekksskap).
- Ta tymidinanalog fra fryseren og ta den med til RT, ca. 21 ° C. Veie 10 mg og leggesterilt saltvann (for BrdU og CldU) eller 0,04 N NaOH (i sterilt saltvann, for IDU), vortex. Plassere minst 10 - 15 min i et 50 ° C vannbad og vortex hver 2 - 3 minutter for å oppløse pulveret.
MERK: Bruk løsninger for opp til 24 timer når den lagres ved RT og i flere uker ved -20 ° C. Beskytt løsninger fra lys (cover med aluminiumsfolie). Sjekk alltid for utfellinger og re-oppløse om nødvendig.
- Ta tymidinanalog fra fryseren og ta den med til RT, ca. 21 ° C. Veie 10 mg og leggesterilt saltvann (for BrdU og CldU) eller 0,04 N NaOH (i sterilt saltvann, for IDU), vortex. Plassere minst 10 - 15 min i et 50 ° C vannbad og vortex hver 2 - 3 minutter for å oppløse pulveret.
- Beherske musen ved Scruff og intraperitonealt injisere en passende, vektjustert volum av stamløsningen (ved RT) med en fin dose sprøyte med en 30 G nål.
MERK: I tilfelle CldU og IDU må gis sekvensielt innenfor samme dyr, bør du vurdere å injisere ekvimolare konsentrasjoner (f.eks 42,5 mg / kg CldU og 57,5 mg / kg IDU, som tilsvarer 50 mg / kg BrdU). Derfor justere injeksjonsvolumer på 10 mg / ml stamløsninger tilsvarende.
2. Vevspreoarerlng
- Behandling anleggre 4% formaldehyd i 0.1 M fosfatbuffer pH 7,4 på dagen før perfusjon. Oppbevares ved 4 ° C.
- Tran perfuse de dypt bedøvde mus (3,5% isofluran) via den venstre ventrikkel med 10 ml iskald PBS, deretter med 40 ml iskald formaldehyd (strømningshastighet 5 ml / min). Dissekere hjernen og post-fix i samme fiksativ i 24 timer ved 4 ° C.
- Overfør hjernen etter hverandre i 10% (24 timer ved 4 ° C) og 30% sukrose (til hjernen synker, ca. 48 timer). For frysing, sakte senk cryoprotected hjerner til -25 ° C isopentan til ingen bobler dukke opp fra vevet. Lagre ved -80 ° C.
- Skjær koronale seksjoner av 40 mikrometer tykkelse på et fryse mikrotom (blokktemperatur på -25 til -16 ° C). Sekvensielt overføringsseksjonene i antifryseoppløsning inneholdende brønnene i en 24-brønners cellekulturplate (se figur 1). Lagre ved -20 ° C.
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av overføring av mikrotom skivene i en 24-brønns plate. Start kl A1 og legge påfølgende skivene i rad A, etter A6 gå til neste rad B og så videre. Når man kommer D6, gå tilbake til A1 og fortsette. Dette arrangement av skivene tillater kvantifisering av hver n-te del av en hel hjerne. For kvantifisering av nyfødte celler tar hver 6. hjernen seksjon (tilsvarer innholdet i en kolonne), for immunfluorescens fenotyping ta hver 12. seksjonen (tilsvarer innholdet av to alternerende rader med én kolonne).
3. Farging
MERK: Seksjoner behandles frittflytende, vanligvis i seks-brønns plater utstyrt med en bæreplate og mesh inserts. Som et unntak, blokking, er antistoff inkuberinger og ABC reaksjon gjort i 12- eller 24-brønners plater uten mesh inserts (0,5 til 1 ml pr well er tilstrekkelig, avhengig av antallet av stykker som må være farget). I løpet av disse trinnene, overføre deler ved hjelp av en fin pensel (skyll med hver ny løsning). Alle inkubasjoner blir gjort med kontinuerlig omrøring (maks 150 rpm).
- Immunhistokjemi (ABC-metoden)
- Overfør seksjoner fra frostvæske i TBS og skyll godt (en gang O / N ved 4 ° C, fem ganger ved RT i 10 min hver) for å fjerne frostvæske.
- Inkuber i 30 minutter i 1,5% H 2 O 2 i TBS-T for å slukke endogen peroksidaseaktivitet. Ta hensyn til bobler og re-dukke seksjoner om nødvendig. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver.
- Valgfritt: I mellomtiden forvarme et varmeskap og 2 N HCl til 37 ° C. Inkuber seksjoner i 30 minutter ved 37 ° C i 2 N HCl for å denaturere DNA. Forsiktig egne seksjoner med hjelp av en børste.
- Valgfritt: Nøytraliser seksjoner for 10 min i 0,1 M boratbuffer pH8,5, RT. Under overføringen, kort vattpinne mesh inserts inneholder avsnittene om et papirhåndkle for å fjerne HCl leavings. Skyll to ganger i TBS i 15 minutter hver.
- Inkuber i TBSplus å permeabilisere vev og for å blokkere uspesifikke antistoffbindingsseter, 1 time ved RT.
- Inkuberes i primær antistoff fortynnet i TBSplus, O / N ved 4 ° C. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver.
- Inkuber i biotinylert sekundært antistoff fortynnet i TBSplus, 3 timer ved romtemperatur. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver. I mellomtiden ...
- Forberede ABC kompleks i henhold til produsentens protokoll (1% A + 1% B i TBS-T). La det stå i 30 minutter ved romtemperatur før bruk. Inkuber seksjoner i AB-reagens i 1 time ved RT. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver.
- Forbered 50 ml 0,5 mg / ml DAB i TBS-T pr 6- eller 12-brønns plate, delt i to halvdeler og pipette 4 ml eller 2 ml per brønn, respektivt. Overføre deler inn DAB-løsning (OBS! DAB er giftig. Følg den spesific datablad gitt av leverandøren, dvs. slitasje laboratoriefrakk og hansker, bruke avtrekksskap).
- Tilsett 0,5 ml 1% H 2 O 2 til de resterende 25 ml DAB løsning, bland og pipette ekvivalente volumer som ovenfor til hver brønn for å starte reaksjonen peroksidase. Inkuber i 12 min. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver.
- Mount deler til lysbilder i gelatin, lufttørke O / N. Dekkglass med permanent monteringsmedium.
- Valgfritt: Counterstain før du legger dekkglass (se avsnitt 3.5).
MERK: Hvis signal-til-støy-forholdet er lavt på grunn av høy bakgrunn, gjentar H 2 O 2 behandling etter inkubasjon med AB-reagens (trinn 3.1.8).
- Multiple-immunfluorescens
- Singel eller samtidig flere immunfluorescens
- Overføre seksjoner fra frostvæske i TBS og skyll grundig (en gang O / N ved 4 ° C, 5 ganger på RT for 10 min hver) for å fjerne entifreeze.
- Valgfritt: som trinn 3.1.3 - 3.1.4.
- Inkuber i TBSplus å permeabilisere vevet og blokkere uspesifikke antistoffbindingsseter, 1 time ved RT.
- Inkuberes i primær antistoff cocktail (f.eks rotte α-BrdU, marsvin α-DCX, geit α-GFP) fortynnet i TBSplus, O / N ved 4 ° C. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver.
- Inkuber i cocktail av fluorokromkonjugerte konjugert sekundære antistoffer (f.eks Rhodamine Red α-rotte, Alexa-647 α-marsvin, Alexa-488 α-geit, alle hentet i esel) fortynnet i TBSplus, 3 timer ved romtemperatur eller O / N ved 4 ° C. Fra nå beskytte seksjoner fra lys. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver.
- Mount deler til lysbilder i gelatin, lufttørke O / N. Dekkglass med vandig montering medium.
- Sekvensiell flere immunofluoresens med primære antistoffer fra samme vertsarter
- Som trinn 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- Inkuber i fiførste primære antistoff (for eksempel kanin α-antigen A), O / N ved 4 ° C. Skyll 3 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkuber i første fluorokromkonjugerte sekundært antistoff (f.eks Rhodamine Red-conj. Esel α-kanin), 3 t RT. Fra nå beskytte seksjoner fra lys. Skyll 3 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkuber i 10% normalt serum fra samme vert som de primære antistoffer (for eksempel kaninserum) i 3 timer RT for å mette åpne paratopes på den første sekundære antistoff. Skyll 3 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkuber i TBSplus med 50 ug / ml ukonjugert monovalente Fab-fragmenter som er rettet mot mange av de primære antistoffer (f.eks α-kanin IgG (H + L)) for å dekke epitoper som kan bli gjenkjent av den andre sekundære antistoff, O / N i 4 ° C.
- Skyll minst tre ganger i TBS, og en gang i TBS-T i 10 minutter hver. Under overføringen, kort SWAb mesh inserts inneholder seksjonene på et papirhåndkle for å fjerne eventuelle Fab leavings.
- Inkuber i andre primære antistoff (for eksempel kanin α-antigen B), O / N ved 4 ° C. Skyll 3 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkuber i andre fluorokromkonjugerte sekundært antistoff (f.eks Alexa-488-conj. Esel α-kanin), 3 t RT. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver, montere og dekkglass som ovenfor.
MERK: For å merke antigener med antistoffer fra ulike vertsarter legge dem til trinn 3.2.2.2 og de respektive sekundære antistoffer til trinn 3.2.2.3.
- En av de sekundære antistoffer fra samme art som en av de primære antistoffene
MERK: Denne protokollen er egnet for firedobbel-flekker mot BrdU eller Ki67 sammen med GFAP, nestin-GFP og DCX.- Følg strengt protokollen trinn 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Inntil dette punktet bare bruke esel serum i TBSplus.
- Inkuber i TBSplus inneholdende 3% geiteserum i 1 time ved RT. Dette dekker åpne paratopes på α-geit sekundært antistoff. Skyll 3 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkuber i AMCA-conj. geit α-kanin fortynnet i TBSplus, 3 hr RT eller O / N 4 ° C. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver, montere og dekkglass som ovenfor.
- CldU, IDU co-farging
- Skyll, denaturering og nøytralisere seksjoner som beskrevet i avsnitt 3.2.1 (trinn 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- Inkuber med 20 pg / ml ukonjugert Fab-fragmenter α-mus IgG (H + L) i TBSplus, 1 time ved RT. Skyll 4 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkubasjon i primært antistoff cocktail inneholdende rotte α-BrdU (1: 400; renset IgG2) og muse α-BrdU (1: 350) fortynnet i TBSplus, O / N ved 4 ° C. Skyll 3 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkuber i sekundært antistoff cocktail som inneholder biotinylerte esel α-rotte (1: 500) og FITC-konjugerte. esel α-mus Fab-fragmenter (1: 100). Skyll 3 ganger i TBS og en gang i TBS-T for 10 min hver.
- Inkuber i Rhodamine Red-conj. Streptavidin, 2 timer ved romtemperatur. Skyll tre ganger i TBS i 15 minutter hver, montere og dekkglass som ovenfor.
- Forsterkning av fluorescens signal i nestin-GFP mus
- Legg geit α-GFP til det primære antistoff cocktail.
- Legg en fluorokrom konjugert sekundært antistoff med spektrale egenskaper som ligner på GFP (slik som Alexa 488 conj. Esel α-geit) til den sekundære antistoff cocktail.
- Singel eller samtidig flere immunfluorescens
- Epitope gjenfinning
- Gjennomføre epitope henting etter skylling ut frostvæske. Forvarme damperen med 6- eller 12-brønners plater inneholdende 0,1 M citrat-buffer pH 6,0 til 95 til 99 ° C (ca. 25 min).
- Overfør seksjonene i den varme citratbufferen og damp i 30 min (dekker platene med aluminiumsfolie som plast lids er ikke varmebestandig).
- Umiddelbart plasserer platene i et isbad for å kjøle seg ned. Dette bidrar til å beskytte vev morfologi, noe som er spesielt viktig når du arbeider med hjerne deler av postnatal dyr.
- Skyll tre ganger i TBS i 10 minutter hver til å skylle ut og nøytralisere citrat og fortsette farging.
- Mus antistoffer på mus vev
- Tilsett 20 ug / ml monovalente Fab-fragmenter α-mus IgG (H + L; samme vert-arter enn sekundært antistoff) til det første sperretrinnet (f.eks trinn 3.1.5 og 3.2.1.3).
- Skyll 4 ganger i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver, og fortsette med respektive protokollen.
- Cresylfiolett kontra
- Forvarm cresylfiolett løsningen til 60 ° C (i glasskrukke). Inkuber lysbilder i den varme løsningen for 3 min.
- Skyll i aq. dest. og dehydrere to ganger i 1 minutt hver på 70%, 96% og 100% isopropanol. Klar i 5 - 6 min i xylen eller et xylen erstatning og dekkglass med en kompatibel permanent monteringsmedium.
4. Data Analysis
- Telle-peroksidase farget nyfødte celler i hver 6. snitt langs hele rostrocaudal utstrekning av dentate gyrus. Bruke et lysmikroskop ved 400 x forstørrelse.
- Multipliser de resulterende celle tall med krysset intervall for å få et anslag av totale antall nyfødte celler.
- Bilde fluorescens merkede seksjoner med et konfokal laser mikroskop utstyrt med passende lasere og filtersystemer. Ta bildestakker på tilfeldige posisjoner langs hele omfanget av dentate gyrus på 400X forstørrelse og analysere minst 50 tilfeldig utvalgte celler av interesse per halvkule for co-merking med andre markører.
- Multipliser de resulterende prosenter av co-merkede celler (% / 100) med det totale antallet nyfødte celler for å beregne absolutteantall spesifikke nyfødte celle populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har anvendt de ovenfor beskrevne fremgangsmåter for å kvantifisere og beskrive nyfødte celler i postnatale og voksen hippocampus. Derfor brukte vi villtype og neurogenesis-mangel cyklin D2 knock out (Ccnd2 KO) mus plassert under forhold som er kjent for å påvirke hastigheten av neurogenesis (dvs. beriket miljø, EE) 13,14. Immunohistokjemisk DAB farging mot enten Ki67, BrdU, CldU eller IDU konsekvent avslørte forskjeller i nyfødte celle tall mellom villtype og Ccnd2 KO mus (figur 3) 15. Videre, med påfølgende ekvimolære injeksjoner av CldU og IDU var vi i stand til å diskriminere celle populasjoner født under bestemte perioder av EE (Figur 3C, D). Vedta avsnitt 3.2.4 vi kunne med hell oppdage like signalintensitet og god overlapping av CldU og IDU etter deres samtidig levering (figur 4). BrdU merket nyfødte celler kan fenotypiseres med en standard immunfluorescens metoden enten samtidig påføre BrdU og Neun, (figur 5) eller BrdU, GFAP, nestin-GFP og DCX antistoffer (Figur 6b). Denne teknikken tillater vellykket identifikasjon type 1, 2a, 2b og 3 progenitorceller innenfor et enkelt eksemplar (figur 6B, D). Co-merking av Ki67 med progenitor markører krevde sekvensiell bruk av antistoffer som primære antistoffer mot Ki67 og GFAP ble oppvokst i kanin (gjelder pkt 3.2.2), dessuten en av de primære antistoffer (geit α-GFP) ble produsert i samme vert som en av de sekundære antistoffer (AMCA konj. α geit-kanin). En kombinasjon av §§ 3.2.2 og 3.2.3 perfekt arbeidet hvis delene ble inkubert først i Ki67 sammen med nestin-GFP antistoff, og for det andre i GFAP antistoff, men ikke vice versa (figur 6C). Figur 2B oppsummerer de godkjente søknadsordninger.
Figur 2. Sekvensiell flere immunfluorescens med primære antistoffer avledet fra samme vertsarter. (A) Skjematisk illustrasjon. (B) Vellykkede kombinasjoner av antistoffer og deres kronologisk rekkefølge i immunfluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. lysmikroskopi bilder av ABC-immunhistokjemi for kvantifisering av nyfødte celler i dentate gyrus. Avbildet er sammenligninger av ulike sprednings markører i WT og nevrogenesen-mangel Ccnd2 KO mus ved 100X og 400X forstørrelse. (A) g> Ki67-DAB-farging viser klynger av prolifererende celler i subgranular sone av dentate gyrus (postnatal dag 35). Antallet prolifererende celler er redusert i Ccnd2 KO mus sammenlignet med WT mus. (B) Nyfødte celler på 28 dager etter BrdU-administrasjon (injeksjon ordningen over bilder) bekrefter redusert proliferasjonsrate i Ccnd2 KO mus. (C) CldU-administrasjon under den sjette uke av EE (injeksjonsordning bildet) viste en økning i antallet nyfødte celler i dentate gyrus av WT men ikke Ccnd2 KO-mus. (D) IDU-administrering i løpet av 8. uke av EE viste lignende resultater. Scale bar representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
fig4.jpg "/>
Figur 4. Immunfluorescens co-farging av CldU og IDU etter samtidig levering av ekvimolære konsentrasjoner. Signal forsterkning av CldU merkede celler resulterte i en utmerket overlapping av CldU og IDU. Scale bar representerer 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Immunfluorescens co-merking av Neun og BrdU. (A) BrdU ble administrert 6 ganger hver 8. time i 2 påfølgende dager med start på postnatal dag 14. Dyrene ble avlivet 28 dager senere. (B) Immunfluorescens co-merking av prolifererende celler med det modne neuronal markør Neun viser et redusert antall prolifererende celler i Ccnd2 KO sammenlignet med WT dyr. Scale bar representerer 50 mikrometer. (C) Forstørret visning av (B) viser co-merkede celler i begge genotyper. Skala bar utgjør 20 pm. (D) høy forstørrelse eksempel på en BrdU / Neun co-merket celle i gyrus dentatus. Scale bar representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Quadruple immunfluorescens co-merking av forskjellige spredning markører med GFAP, nestin-GFP og DCX for fenotyping nyfødte granule celler i dentate gyrus av nestin-GFP mus. (A) BrdU ble administrert tre ganger hver 2 time på postnatal dag 70 . Dyrene ble avlivet 2 timer senere. (B) Representant bilde av en co-farging for BrdU, GFAP,nestin-GFP og DCX. (C) Representant bilde av firedoble immunfluorescens for Ki67, GFAP, nestin-GFP og DCX. (D) Klassifisering av stamcelletyper i henhold til deres immunfluorescens merking. Basert på co-uttrykk for ulike markører og de morfologiske funksjoner i de merkede cellene fire distinkte stamcelle subtyper kan identifiseres: type 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), type 2a (GFAP -, nestin +, DCX - ), type 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) og type 3 (GFAP -, nestin -, DCX +). Scale bar representerer 20 mikrometer. (E) Skjematisk oversikt over de forskjellige stadier av voksen hippocampus neurogenesis. Det illustrerer de fire progenitor celletyper, umodne nevroner og modne granule celler, deres karakteristiske uttrykk av markører og deres proliferativ kapasitet. ML - molekylær cellelaget, GCL -granulær celle laget, SGL -. subgranular celle laget Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Eksempel på vellykket og ikke-vellykket sekvensielle stainings med to primære antistoffer dannet i de samme arter, avhengig av sekvensen av antistoffet inkubasjon. De konfokale mikrografer viser resultatet av en sekvensiell ko-farging mot Ki67 og GFAP med primære antistoffer både avledet fra kanin. I (A) immunhistokjemi ble først gjennomført for GFAP etterfulgt av farging mot Ki67 som førte til en markert overlapping av de to signalene. Spesielt var Ki67-signalet var atypisk og lignet signalet fra GFAP farging. (B) viser resultatene fra den motsattefarging sekvens med Ki67 farging gjennomført først og påfølgende farging mot GFAP. Her signalene for begge antigener lignet den forventede uttrykk mønster: The Ki67 signalet ble begrenset til kjerner innenfor subgranular sone mens GFAP signalet ble funnet cytoplasmatically, hovedsakelig i de cellulære prosessene som oppstår fra subgranular sone. Scale bar representerer 20 mikrometer. RhX - Rhodamine X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Spesifisitet av α-BrdU antistoff som brukes til å detektere CldU og IDU. Mus ble injisert med enten CldU eller med IDU (ikke-samtidige søknad). I (A) hjerne deler av CldU (A1) eller IDU (A2) injisert mus var immunofluorescensnostained bruker renset rotte α-BrdU antistoff som bør spesielt kryssreagerer til CldU, men ikke til IDU. (B) viser resultatene fra farging hjerner fra CldU (B1) eller IDU (B2) injisert mus med muse α-BrdU antistoff som er forventet å kryssreagere med IDU, men ikke CldU. Scale bar representerer 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifisering og identifisering av subpopulasjoner av nyfødte celler er et sentralt tema i voksen neurogenesis forskning. Kombinere spredning markører og antistoffer mot proteiner uttrykt under bestemte stadier av voksen neurogenesis tillater immunhistokjemisk påvisning av disse undergruppene. Noen av antistoffer eller antistoff-kombinasjoner krever bestemte fargingsbetingelser.
Merking av dele celler med syntetisk tymidin-analoger er fortsatt gullstandarden for å studere voksen hippocampus neurogenesis. Det er viktig å vurdere den aktuelle injeksjonsprotokoll før start av eksperimentet. Vanligvis administrere vi 50 mg / kg (kroppsvekt, ip) BrdU, men konsentrasjoner kan variere avhengig av eksperimentelle krav (opp til 300 mg / kg for en bolusinjeksjon) 8,16. Hvis IDU og CldU har injiseres sekvensielt for timelig diskriminering av cellepopulasjoner er det obligatorisk å injisere ekvimolare konsentrasjoner (
For farging, blir deler vanligvis behandlet frittflytende, vanligvis i seks-brønns plater som er utstyrt med en bæreplate og mesh inserts som forenkler deres overføring fra en løsning til en annen. Som et unntak, blokkering, er antistoff inkuberinger og ABC reaksjon gjorti 12- eller 24-brønners plater uten mesh inserts å økonom dyre løsninger (0,5 til 1 ml per brønn er tilstrekkelig, avhengig av antallet av stykker som må være farget). I løpet av disse trinnene, overføre deler ved hjelp av en fin pensel som må skylles ved skifte løsninger. Forhindre seksjoner fra uttørking og utføre inkubasjonene som tar> 1 time i en humified kammer. Alle inkubasjoner må gjøres med kontinuerlig omrøring (maks 150 rpm). Teste og titrere hver nye antistoff mye alltid. Lengre antistoff inkubasjonstid (opp til 2 dager ved 4 ° C) kan forbedre farging. I tilfelle bare mus antistoffer er tilgjengelig mot antigener du ønsker å visualisere i mus vev det er tilrådelig å blokkere endogene immunglobuliner med høykonsentrert énverdige Fab-fragmenter α-mus (kapittel 3.4). Når du bruker denne teknikken forlenge følgende skylle trinn. Ellers kan ubundne Fab-fragmenter binde til den primære mus antistoff. HCl forbehandling og boratnøytralisering er nødvendig bare for påvisning av tymidin analoger. Den 12 min peroksidase reaksjon resulterer i et optimalt signal-til-støyforholdet med forholdene og antistoffer anvendes i vår protokoll. Som med alle enzymatiske reaksjon, frekvensen av peroksydasereaksjonen avhenger av mange faktorer (for eksempel temperatur, pH, konsentrasjon av enzym og substrat). Følgelig er reaksjonstidene må optimaliseres for enhver ny antistoffsett. For å visualisere anatomiske strukturer i DAB flekker med svært svak bakgrunn (f.eks CldU), kan skivene legges motfarget. Den cresylfiolett metoden beskrevet i kapittel 3,5 resultater i en meget svak counterstain som ikke går ut over spesifikke DAB-signalet.
For flere immunfluorescens, bruke primære antistoffer som er oppvokst i forskjellige arter eller forskjellige isotyper og følg kapittel 3.2.1. Ellers utfører en sekvensiell multippel immunolabeling som har blitt optimalisert for å oppdage flere primære antistofferfra de samme vertsarter (dvs. mus eller kanin, § 3.2.2). Det grunnleggende prinsippet om denne metoden har blitt oppfunnet av Ferguson og kolleger som klarer farget forskjellige muskel markører med to muse primære antistoffer 17. Fab-fragmenter som brukes til å blokkere i trinn 3.2.2.5 bør være avledet fra de samme vertsarter som det sekundære antistoff. Konsentrasjonene og inkubasjonstid er beskrevet i avsnitt 3.2.2 er optimalisert for de spesifikke antistoffer som er beskrevet her, og må justeres for eventuelle nye antistoff kombinasjon. Vær oppmerksom på at sekvensen av primær antistoff inkubasjon kan sterkt påvirke utfallet (som vist i figur 7A). Der det er aktuelt, bør de antigener som detekteres av de primære antistoffer som er utledet fra de samme artene viser en annen uttrykksmønster som forenkler påvisning av manglende blokkering. For å eliminere enhver mulighet for antistoff kryssreaksjon eller falske positiver det er essenvendig å omfatte hensiktsmessige kontroller (dvs. kun videregående-antistoff kontroller, komplett immunhistokjemi for første antigen etterfulgt av en inkubasjon med andre primære antistoff eller andre sekundære antistoff alene). 18 Figur 2B viser antistoff kombinasjoner som fungerte bra i våre hender. For flere immunfluorescens er det også lurt å bruke sekundære antistoffer som er oppvokst i samme art (f.eks esel) og har minimal kryssreaktivitet til vev og til serumproteiner fra andre arter (dvs. pre-adsorberte). Ellers avsnitt 3.2.3 kan bidra til å forebygge eventuelle uventede arts kryssreaktivitet. Velg fluorokromer med minimal spektral overlapp passer til din deteksjonssystem (f.eks AMCA, Alexa Fluor 488, Rhodamine Rød, Alexa Fluor 647). Dersom en kjernefysisk counterstain er nødvendig, tilsett DAPI eller Hoechst 33342 (10 ug / ml) til den sekundære antistoff cocktail (da, ingen nær-UV-sekundært antistoff kan være ossed). Disse atom counterstains fungerer ikke hvis vevet har blitt forbehandlet med HCl. Likeledes kan HCl-behandling kompromiss påvisning av noen antigener, og derfor dens innflytelse på individuelle antistoff ytelse må testes. Når fluorokromkonjugerte konjugert sekundære antistoffer har vært brukt Protect seksjoner fra lys.
CldU og IDU kan visualiseres ved hjelp av to ulike BrdU antistoffer som kryssreagerer enten med CldU (rotte α-BrdU) eller IDU (mus α-BrdU) 9,19. Hvis begge tymidin-analoger er blitt injisert inn i et dyr er det absolutt nødvendig å bruke det rensede rotte α-BrdU-antistoff for å påvise CldU fordi den ikke-renset antistoff kryssreagerer til IDU. Som beskrevet av Vega et al. 9 er CldU signalet må forsterkes for immunofluorescerende co-merking for å oppnå tilsvarende påvisning av begge tymidin-analoger. Derfor, i stedet for en fluorokromkonjugerte sekundært antistoff (α-rotte) en fluorokrom konjugert streptavidin tilsettes etter inkubasjon i en biotinylert sekundært antistoff (α-rat; § 3.2.4). Å ekskludere uønskede antistoff kryssreaksjoner omfatter kontroll seksjoner fra mus som fikk enten IDU eller CldU (separat, se figur 8). Å verifisere tilsvarende påvisning av IDU og CldU bruk seksjoner fra dyr som ble samtidig injisert med ekvimolare mengder CldU og IDU (se figur 4).
Å studere type 1 og type 2 stamceller vi foretrekker å bruke nestin-GFP transgene mus 12 som nestin antistoffer ofte ikke gir tilfredsstillende resultater. Nestin-GFP mus har den fordel at en pålitelig måte å visualisere nestin-positive stamceller og deres morfologiske egenskaper ved et bestemt utviklingsstadium. GFP-signal må forsterkes ved indirekte immunfluorescens med en α-GFP antistoff. Det sekundære antistoff bør være koplet til en fluorochrome med spektrale egenskaper som ligner på GFP. Ved behov kan nestin-GFP mus bli cross til andre mutante mus linjer for å undersøke involvering av bestemte gener i neurogenesis. Nå blir forbedret nestin antistoffer levert som etiketten cellelegemer, samt fremgangsmåter, og kan brukes som et alternativ til den transgene tilnærmingen (se materialliste).
Det er viktig å overholde 24-timers fiksering for å hindre overfixation. De kjemiske stoffer som reagerer med formaldehyd i vevet er i hovedsak proteiner og formaldehyd genererer reaktive hydroksymetylgrupper på sine sidekjeder som fører til tverrbinding av tilstøtende aminosyrer (ved dannelse av metylenbroer). Dette kan føre til maskering av antigen-epitoper og tap av immunoreaktivitets (se kommentarer til spesifikke antistoffer i Materials List). Å gjenopprette tapte immunoreaktivitets, flere epitope gjeninnhentingsmetodene eksisterer at break formaldehyd-indusert proteintverrbindinger gjennom eXposure å varme 20. I denne protokollen, citratbufferen metoden fungerer bedre enn andre for deteksjon av neurogenesis i barsel og voksne hippocampus (punkt 3.3). Merk at stykker av svært unge dyr (<P21) kan bli svært skjøre eller forvrengt og må håndteres med forsiktighet. Videre kan epitop gjenfinning være skadelig for noen epitoper og dermed individuelle antistoff bør testes om de er egnet for flere flekker som krever denne forbehandling.
Oppsummert er denne protokollen en samling av grunnleggende og utarbeidet teknikker som letter analyse av voksen hippocampus neurogenesis. Det gjør at spesielt en entydig identifikasjon av alle hippocampus progenitor subpopulasjoner sammen med en spredning eller fødsel-dating markør fra en enkelt seksjon. Disse teknikkene kan tilpasses til en hvilken som helst kombinasjon av antistoffer eller til andre arter for å studere utviklingen og regulering av hippocampal stamceller i respons til spesifikke stimuli og deres engasjement i bestemte hjernefunksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
