Abstract
Volwassen neurogenese is een sterk gereguleerd, meertraps proces waarbij nieuwe neuronen worden gegenereerd uit een geactiveerde neurale stamcel via steeds gecommitteerde tussenliggende progenitor subtypes. Elk van deze subtypen drukt een reeks specifieke moleculaire merkers die, samen met specifieke morfologische criteria, kunnen worden gebruikt voor hun identificatie. Typisch worden immunofluorescentie technieken toegepast waarbij subtype-specifieke antilichamen in combinatie met exo- of endogene proliferatiemerkers. We beschrijven hierin immunokleuring werkwijzen voor de detectie en kwantificering van alle stadia van volwassen hippocampale neurogenese. Deze bestaan uit de toepassing van thymidine-analogen, transcardial perfusie, weefsel verwerking, warmte-geïnduceerde epitoopversterking, ABC immunohistochemie, meerdere indirecte immunofluorescentie, confocale microscopie en cel kwantificering. Verder presenteren we een sequentiële multipele immunofluorescentie protocol welke problemen u omzeiltsually voortvloeien uit de noodzaak van het gebruik van primaire antilichamen opgewekt in dezelfde soort gastheer. Het maakt het mogelijk een nauwkeurige identificatie van alle hippocampus voorlopercellen subtypen samen met een wildgroei marker binnen één sectie. Deze technieken zijn een krachtig instrument om de regelgeving van de diverse voorlopercellen subtypes in parallel, hun betrokkenheid bij de hersenen pathologieën en hun rol in specifieke hersenfuncties te bestuderen.
Introduction
Twee hersengebieden constitutief het genereren van nieuwe neuronen gedurende het hele leven, de subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) van de hippocampus dentate gyrus (DG). De pasgeboren neuronen afkomstig van neurale stamcellen en gaan door verschillende stadia van de morfologische en fysiologische ontwikkeling vóór het bereiken van volwassenheid 1,2. Van een langzaam delende radiale glia-achtige stamcel (type 1) opeenvolgende stadia van doorvoer versterken tussenliggende voorlopercellen ontstaan. Hoe meer ongedifferentieerde subtypes (type 2a en het type 2b) hebben een onregelmatige vorm met korte, tangentiële processen. Zij genereren neuroblasts (type 3) de celcyclus verlaten geleidelijk aan onvolwassen neuronen (met dendrieten uitgebreid tot de moleculaire laag) en tenslotte integreren in de hippocampus netwerk rijpe granule cellen. Vanwege hun bijzondere fysiologische eigenschappen van deze cellen de schakelingen met verhoogde plasticiteit 3 suggesting een unieke rol in de hippocampus functie. Eigenlijk, studies van de laatste tien jaar substantieel bewijs dat volwassen neurogenese bijdraagt aan ruimtelijk geheugen, patroon scheiding en emotioneel gedrag 4,5 gegenereerd.
Volwassen neurogenese kan worden bestudeerd met behulp van verschillende benaderingen. Thymidine analogen nemen in DNA tijdens de S-fase van de celcyclus en mogelijk geboorte dating, kwantificering en lot analyse van pasgeboren cellen 6-8. Opeenvolgende toepassing van verschillende thymidine analogen (bv CldU, edu of IDU) kan worden gebruikt voor celvernieuwing of celpopulaties geboren op verschillende tijdstippen in de loop van een experiment 9 bestuderen. Een alternatief, endogene marker voor celproliferatie is Ki67. Het wordt uitgedrukt in delende cellen gedurende alle fasen van de celcyclus (G1, S, G2, M), behalve de rustfase (G0) en begin G1 10,11. Om het fenotype van de pasgeboren celpopulaties analyseren de volwassen dentate gyrus verschillende fase-specifieke moleculaire markers kunnen worden gebruikt, zoals GFAP, nestine, DCX en NeuN 1,6. GFAP is een merker rijpe astrocyten maar zich ook in radiale glia-achtige cellen in de volwassen voorhersenen. Nestin een intermediair filament specifiek voor radiale glia-achtige cellen en vroege tussenproduct progenitorcellen. DCX is een microtubule geassocieerde eiwit expressie intermediair progenitors, neuroblasts en onvolwassen neuronen. Op basis van de (co-) expressie van deze drie markers en de morfologische kenmerken van de gelabelde cellen vier verschillende progenitorcel subtypen worden onderscheiden: type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), het type 2a (GFAP -, nestine + , DCX -), het type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) en type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +) 1. Co-etikettering van DCX met NeuN, dat wordt uitgedrukt in postmitotische neuronen, maakt de differentiatie van immature (DCX +, NeuN +) en volwassen (DCX -, NeuN +) korrel neuronen.
De hierboven vermelde merkers worden vaak gebruikt voor immunofluorescentie co-labeling en daaropvolgende confocale microscopie met het aantal en de identiteit van pasgeboren cellen geanalyseerd. Dit vereist gewoonlijk antilichamen van verschillende gastheersoorten ongewenste antilichaam kruisreactiviteit voorkomen. De meeste primaire antilichamen geschikt voor neurogenese onderzoek worden gebracht hetzij in konijnen of muizen (bijvoorbeeld muizen α-BrdU, muis α-NeuN, konijn α-Ki67, konijn α-GFAP). Dit leidt tot ernstige beperkingen in het aantal en de combinatie van antigenen die in één segment kan worden geëvalueerd. Hierdoor verhoogt niet alleen de kleuring inspanning, als meervoudige kleuringen moeten worden uitgevoerd, maar kan ook gevaar opleveren voor de betrouwbaarheid van de resultaten. Bovendien zijn sommige antigenen zijn gevoelig voor formaline-fixatie geïnduceerde epitoop maskeren (bijvoorbeeld Ki67, Nestine). We beschrijven hierin wijzigingen van de klassieke enkelvoudige als meervoudige immunokleuring protocollen (bijvoorbeeld epitoop, meerdere opeenvolgende immunokleuring, gebruik van nestin-GFP transgene muizen 12) dat veel van deze problemen overwinnen. Met name de sequentiële multipele immunofluorescentie kleuring protocol maakt tegen maximaal vier verschillende antigenen, zelfs indien een deel van de antilichamen afgeleid van dezelfde gastheer. Dit maakt de gelijktijdige detectie van het type 1, type 2a, het type 2b en type 3 progenitorcellen, alsook hun proliferatie activiteit in één sectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures waarbij levende dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de EG-richtlijn 86/609 / EEG van de Raad richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en door de lokale ethische commissie (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) goedgekeurd uitgevoerd.
1. intraperitoneale injectie van Thymidine Analogs
- Weeg de dieren op de dag voor injectie. Bereken de hoeveelheid thymidine analoge vereist voor alle injecties gepland op de volgende dag als individuele gewichtsgecorrigeerde injectievolumes van een 10 mg / ml stamoplossing.
- Bereid 10 mg / ml thymidine stamoplossing. (LET OP! Thymidine analogen zijn giftig. Volg de specifieke Material Safety Data Sheets (MSDS) die door de leveranciers, dat wil zeggen, slijtage laboratoriumjas en handschoenen, gebruik een chemische dampkap).
- Neem thymidine analoog uit de vriezer en breng het naar RT, ong. 21 ° C. Weeg 10 mg en voegsteriele zoutoplossing (voor BrdU en CldU) of 0,04 N NaOH (in steriele zoutoplossing, want IDG), vortex. Gedurende ten minste 10-15 minuten in een 50 ° C waterbad en vortex elke 2-3 min het poeder oplost.
OPMERKING: Gebruik oplossingen tot 24 uur indien bewaard bij kamertemperatuur en gedurende enkele weken bij -20 ° C. Bescherm oplossingen van licht (cover met aluminiumfolie). Controleer altijd voor neerslagen en opnieuw te ontbinden indien nodig.
- Neem thymidine analoog uit de vriezer en breng het naar RT, ong. 21 ° C. Weeg 10 mg en voegsteriele zoutoplossing (voor BrdU en CldU) of 0,04 N NaOH (in steriele zoutoplossing, want IDG), vortex. Gedurende ten minste 10-15 minuten in een 50 ° C waterbad en vortex elke 2-3 min het poeder oplost.
- Weerhouden de muis door het nekvel en intraperitoneaal injecteren van een passende, op gewicht aangepast volume van de stockoplossing (bij RT) met een fijne dosis spuit met een 30 G naald.
OPMERKING: Indien CldU en IDU sequentieel in hetzelfde dier toegediend, overwegen equimolaire concentraties injecteren (bijvoorbeeld 42,5 mg / kg CldU en 57,5 mg / kg IDU, die overeenkomen met 50 mg / kg BrdU). Daarom dienovereenkomstig aanpassen het injectievolume van 10 mg / ml voorraadoplossingen.
2. Tissue Voorbereiding
- Prepare 4% formaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4 op de dag voor perfusie. Bewaar bij 4 ° C.
- Transcardially perfuseren de diep verdoofde muizen (3,5% isofluraan) via de linker ventrikel met 10 ml ijskoude PBS, daarna met 40 ml ijskoude formaldehyde (stroomsnelheid 5 ml / min). Prepareer de hersenen en post-fix in hetzelfde fixeermiddel gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- Breng de hersenen achtereenvolgens in 10% (24 uur bij 4 ° C) en 30% sucrose (tot de hersenen wastafels, ong. 48 uur). Voor het invriezen, langzaam onderdompelen cryobeschermd hersenen in -25 ° C isopentaan tot er geen luchtbellen ontstaan uit het weefsel. Bewaren bij -80 ° C.
- Snijd coronale secties van 40 pm dikte op een ijskoude microtoom (blok temperatuur op -25 tot -16 ° C). Sequentieel overdracht secties in antivries oplossing met putjes van een 24-well celkweek plaat (zie figuur 1). Bewaren bij -20 ° C.
Figuur 1. Schematische weergave van het overbrengen van microtoom plakjes in een 24-well plaat. Begin bij de A1 en leg daarop plakjes in rij A, na de A6 naar de volgende rij B, enzovoort. Bij het bereiken van D6, ga terug naar de A1 en ga verder. Deze opstelling van segmenten maakt kwantificering van elk nde deel van een gehele hersenen. Voor kwantificering van de pasgeboren cellen nemen elke 6e hersenen gedeelte (gelijk aan de inhoud van één kolom), voor immunofluorescentie fenotypering nemen elke 12de deel (equivalent aan de inhoud van 2 afwisselende rijen van een kolom).
3. Immunokleuring
OPMERKING: Secties worden verwerkt vrij zwevende, meestal in 6-well platen uitgerust met een draagplaat en mesh inserts. Bij wijze van uitzondering, het blokkeren, antilichaam incubatie en ABC reactie worden gedaan in 12- of 24-well platen zonder gaas inzetstukken (0,5 tot 1 ml per well voldoende, afhankelijk van het aantal segmenten die moeten worden gekleurd). Tijdens deze stappen overdragen secties met behulp van een fijne borstel (spoelen met elke nieuwe oplossing). Alle incubaties worden uitgevoerd onder voortdurend roeren (max 150 rpm).
- Immunohistochemie (ABC-methode)
- Transfer secties van antivries in TBS en naspoelen (eenmaal O / N bij 4 ° C, 5 keer bij kamertemperatuur gedurende 10 min elk) volledig te verwijderen antivries.
- Incubeer gedurende 30 min in 1,5% H 2 O 2 in TBS-T om endogene peroxidase activiteit te blussen. Besteed aandacht aan het borrelen en opnieuw onderdompelen secties indien nodig. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
- Optioneel: Verwarm ondertussen een verwarmingskast en 2N HCl tot 37 ° C. Incubeer secties gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 2 N HCl DNA denatureren. Voorzichtig afzonderlijke secties met behulp van een borstel.
- Optioneel: Neutraliseren secties 10 min in 0,1 M boraatbuffer pH8.5, RT. Tijdens het overzetten kort zwabberen de mesh inzetstukken met de secties op een papieren handdoek om HCl leavings verwijderen. Spoel 2 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
- Incubeer in TBSplus het weefsel doorlaatbaar en niet-specifieke antilichaam bindingsplaatsen, 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd.
- Incubeer in primaire antilichaam verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
- Incubeer in gebiotinyleerd secundair antilichaam verdund in TBSplus, 3 uur bij kamertemperatuur. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. Ondertussen ...
- Bereid ABC complex volgens protocol van de fabrikant (1% A + 1% B in TBS-T). Laat gedurende 30 minuten staan bij kamertemperatuur voor gebruik. Incubeer secties AB reagens gedurende 1 uur bij KT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
- Bereid 50 ml 0,5 mg / ml DAB in TBS-T per 6- of 12-well plaat, opgesplitst in twee helften en pipet 4 ml of 2 ml per well, respectievelijk. Transfer secties in DAB-oplossing (LET OP! DAB is giftig. Volg de specific VIB verstrekt door de leverancier, dat wil zeggen, slijtage laboratoriumjas en handschoenen, gebruik een chemische dampkap).
- Voeg 0,5 ml 1% H 2 O 2 de resterende 25 ml DAB oplossing, mengen en pipet dezelfde hoeveelheden als hierboven beschreven om elk putje te peroxidase reactie te starten. Incubeer gedurende 12 min. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
- Mount secties om dia's in gelatine, lucht drogen O / N. Dekglaasje met permanente montage medium.
- Optioneel: tegenkleuring voor het plaatsen van het dekglaasje (zie paragraaf 3.5).
OPMERKING: Als de signaal-ruisverhouding is laag vanwege de hoge achtergrond, herhaal H 2 O 2 behandeling na de incubatie met AB reagens (stap 3.1.8).
- Multiple-immunofluorescentie
- Enkelvoudige of meervoudige gelijktijdige immunofluorescentie
- Transfer secties van antivries in TBS en naspoelen (eenmaal O / N bij 4 ° C, 5 keer bij kamertemperatuur gedurende 10 min elk) volledig te verwijderen eentifreeze.
- Optioneel: als de stappen 3.1.3 - 3.1.4.
- Incubeer in TBSplus het weefsel doorlaatbaar en blok aspecifieke antilichaam bindingsplaatsen, 1 uur bij KT.
- Incubeer in primaire antilichaam cocktail (bijvoorbeeld rat α-BrdU, cavia α-DCX, geit α-GFP) verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
- Incubeer in cocktail van fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen (bijvoorbeeld, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cavia, Alexa-488 α-geit; allemaal afgeleid in ezel) verdund in TBSplus, 3 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Vanaf nu secties bescherming tegen licht. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
- Mount secties om dia's in gelatine, lucht drogen O / N. Dekglaasje met waterige montage medium.
- Sequentiële meerdere immunofluorescentie met primaire antilichamen van dezelfde host soorten
- Zoals stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- Incubeer in fieerste primair antilichaam (bijvoorbeeld konijn α-antigeen A), O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in eerste fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (bijvoorbeeld, Rhodamine Rood-conj. Ezel α-konijn), 3 uur RT. Vanaf nu secties bescherming tegen licht. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in 10% normaal serum van dezelfde host als de primaire antilichamen (bijvoorbeeld, konijn serum) gedurende 3 uur RT open paratopen verzadigen op de eerste secundaire antilichaam. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in TBSplus met 50 ug / ml niet geconjugeerde monovalente Fab-fragmenten gericht tegen de gastheer van de primaire antilichamen (bijvoorbeeld, α-konijn IgG (H + L)) naar epitopen die kunnen worden herkend door de tweede secundaire antilichaam, O / N in te dekken 4 ° C.
- Spoel minstens 3 maal in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. Tijdens het overzetten kort swab de mesh inzetstukken met de secties op een papieren handdoek om elke Fab leavings verwijderen.
- Incubeer in tweede primaire antilichaam (bijvoorbeeld konijn α-antigen B), O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in tweede fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (bijv Alexa-488-conj. Ezel α-konijn), 3 uur RT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven.
OPMERKING: Om antigenen met antilichamen labelen van verschillende gastheerspecies voeg ze toe aan stap 3.2.2.2 en de respectievelijke secundaire antilichamen naar stap 3.2.2.3.
- Een van de secondaire antilichamen van dezelfde soort als één van de primaire antilichamen
LET OP: Dit protocol is geschikt voor quadruple-kleuring tegen BrdU of Ki67 samen met GFAP, nestine-GFP en DCX.- Volg strikt protocol stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Tot op dit moment alleen te gebruiken ezel serum in TBSplus.
- Incubeer in TBSplus bevattende 3% geit serum gedurende 1 uur bij KT. Dit omvat geopend paratopen op de α-geit secundair antilichaam. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in het AMCA-conj. geit α-konijn verdund in TBSplus, 3 uur RT of O / N 4 ° C. Driemaal spoelen in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven.
- CldU, IDG co-kleuring
- Spoelen, denatureren en neutraliseren secties zoals beschreven in paragraaf 3.2.1 (stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- Incubeer bij 20 ug / ml ongeconjugeerd Fab-fragmenten α-muis IgG (H + L) in TBSplus, 1 uur bij KT. Spoel 4 maal in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in primair antilichaam cocktail bevattende rat α-BrdU (1: 400; gezuiverde IgG2) en muis α-BrdU (1: 350) verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in het secundair antilichaam cocktail met gebiotinyleerd ezel α-rat (1: 500) en FITC-conj. ezel α-muis Fab-fragmenten (1: 100). Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer in Rhodamine Rood-conj. Streptavidin, 2 uur bij KT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven.
- Amplificatie van fluorescentiesignaal in nestin-GFP muizen
- Voeg geit α-GFP aan het primaire antilichaam cocktail.
- Voeg een fluorochroom geconjugeerd secundair antilichaam met spectrale eigenschappen vergelijkbaar met GFP (zoals Alexa 488 conj. Ezel α-geit) aan het secundaire antilichaam cocktail.
- Enkelvoudige of meervoudige gelijktijdige immunofluorescentie
- Epitoopversterking
- Voeren epitoopversterking na het spoelen uit antivries. Verwarm stomer met 6- of 12-well platen met 0,1 M citraatbuffer pH 6,0-95 - 99 ° C (ongeveer 25 min).
- Breng de secties in de hete citraatbuffer en stoom gedurende 30 min (bovenkant van de platen met aluminiumfolie als plastic lids zijn niet hittebestendig).
- Onmiddellijk plaats de platen in een ijsbad afgekoeld. Dit helpt om weefsel morfologie, hetgeen vooral van belang bij het werken met hersencoupes van postnatale dieren te beschermen.
- Spoel 3 maal in TBS gedurende 10 min elk spoelen en neutraliseren citraat en verder kleuring.
- Muizenantistoffen op de muis weefsel
- Voeg 20 ug / ml monovalente Fab-fragmenten α-muis IgG (H + L, dezelfde gastheersoort dan secundair antilichaam) aan de eerste blokkerende stap (bijvoorbeeld stap 3.1.5 of 3.2.1.3).
- Spoel 4 keer in TBS en eenmaal in TBS-T voor 10 minuten elk, en ga verder met bijbehorende protocol.
- Cresylviolet tegenkleuring
- Verwarm cresylviolet oplossing tot 60 ° C (in glazen pot). Incubeer dia's in de hete oplossing gedurende 3 min.
- Spoel in aq. dest. en dehydrateren 2 maal gedurende 1 min elk in 70%, 96% en 100% isopropanol. Clear voor 5-6 min in xyleen of een xyleen vervanger en dekglaasje met een compatibele permanente montage medium.
4. Data Analyse
- Telling peroxidase gekleurde pasgeboren cellen in elke 6e doorsnede langs de gehele rostrocaudal omvang van de dentate gyrus. Gebruik een lichtmicroscoop bij 400X vergroting.
- Vermenigvuldig het resulterende celaantallen de kruising interval van een schatting van de totale aantallen pasgeboren cellen te verkrijgen.
- Afbeelding de fluorescentie gemerkte secties met een confocale laser microscoop uitgerust met geschikte lasers en filtersystemen. Neem image stacks op willekeurige posities langs de gehele omvang van de dentate gyrus bij 400X vergroting en analyseren ten minste 50 willekeurig gekozen cellen van belang per halfrond voor co-labeling met andere markers.
- Vermenigvuldig de verkregen percentages van gelijktijdig gelabelde cellen (% / 100) van het totale aantal pasgeboren cellen te berekenen absoluteaantal specifieke pasgeboren celpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We pasten de hierboven beschreven kwantificeren en karakteriseren pasgeboren cellen in de postnatale en volwassen hippocampus methoden. Daarom gebruikten we wildtype en neurogenese-deficiënte cycline D2 knock-out (Ccnd2 KO) muizen gehuisvest onder voorwaarden bekend om de snelheid van neurogenese (dwz, verrijkt milieu, EE) 13,14 beïnvloeden. Immunohistochemische kleuring met DAB of Ki67, BrdU, CldU of IDU consistent gebleken verschillen pasgeboren aantal cellen tussen wildtype en Ccnd2 KO muizen (figuur 3) 15. Bovendien, met equimolaire opeenvolgende injecties van CldU en IDU konden we celpopulaties geboren in bepaalde perioden van EE (Figuur 3C, D) discrimineren. De goedkeuring van sectie 3.2.4 kunnen we met succes gelijke signaalintensiteiten en uitstekende overlap van CldU en IDG na hun gelijktijdige levering (figuur 4) te detecteren. BrdU gelabelde pasgeboren cellen kunnen worden fenotype met een standard immunofluorescentie wijze gelijktijdig toepassen BrdU en NeuN, (figuur 5) of BrdU, GFAP, nestine-GFP en DCX antilichamen (Figuur 6B). Deze techniek maakt succesvolle identificatie type 1, 2a, 2b en 3 progenitorcellen binnen één monster (figuur 6B, D). Co-labeling van Ki67 met progenitor markeringen vereist de achtereenvolgende aanbrenging van antilichamen als primaire antilichamen tegen Ki67 en GFAP werden opgewekt in konijnen (voor paragraaf 3.2.2) bovendien één van de primaire antilichamen (geit α-GFP) is in de geproduceerde dezelfde gastheer als een van de secundaire antilichamen (AMCA conj. geit α-konijn). Een combinatie van secties 3.2.2 en 3.2.3 werkte perfect als secties eerst werden geïncubeerd in Ki67 met nestin-GFP antilichaam en anderzijds het GFAP antilichaam maar niet vice versa (figuur 6C). Figuur 2B vat de goedgekeurde toepassingsschemas.
Figuur 2. Sequential meerdere immunofluorescentie met primaire antilichamen afkomstig van dezelfde host soorten. (A) Schematische weergave. (B) Succesvolle combinaties van antilichamen en hun chronologische volgorde in immunofluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Lichtmicroscopie beelden van ABC-immunohistochemie voor het kwantificeren van pasgeboren cellen in de dentate gyrus. Afgebeeld zijn vergelijkingen van verschillende proliferatiemerkers in WT en neurogenese-deficiënte Ccnd2 KO muizen bij 100X en 400X vergroting. (A) G> Ki67-DAB kleuring toont clusters van prolifererende cellen in de subgranulaire zone van de dentate gyrus (postnatale dag 35). Het aantal delende cellen is verminderd in Ccnd2 KO muizen in vergelijking met WT muizen. (B) Pasgeboren cellen op 28 dagen na BrdU toediening (injectie schema hierboven beelden) bevestigt het verlaagde tarief proliferatie in Ccnd2 KO muizen. (C) CldU-administratie tijdens de 6e week van EE (injectieschema de afbeelding) onthulde een toename van het aantal pasgeboren cellen in de dentate gyrus van WT maar niet Ccnd2 KO muizen. (D) IDU toediening in de 8e week van EE toonde vergelijkbare resultaten. Schaal balk vertegenwoordigt 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
fig4.jpg "/>
Figuur 4. Immuunfluorescentie co-kleuring van CldU en IDG na gelijktijdige levering van equimolaire concentraties. Signaalversterking van CldU gelabelde cellen resulteerde in een uitstekende overlap van CldU en IDG. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Immuunfluorescentie co-etikettering van NeuN en BrdU. (A) BrdU werd 6 maal elke 8 uur toegediend gedurende 2 achtereenvolgende dagen vanaf postnatale dag 28 dagen later werden 14 dieren opgeofferd. (B) Immunofluorescentie co-labeling van prolifererende cellen met de volwassen neurale marker NeuN toont een gereduceerd aantal prolifererende cellen in Ccnd2 KO opzichte WT dieren. Schaalbalk is 50 urn. (C) vergroot aanzicht van (B) toont co gelabelde cellen in beide genotypen. Schaal balk vertegenwoordigt 20 pm. (D) Hoge vergroting voorbeeld van een BrdU / NeuN-co gelabelde cel in de dentate gyrus. Schaal balk vertegenwoordigt 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Viervoudige immunofluorescentie co-labeling van verschillende proliferatiemerkers met GFAP, nestine-GFP en DCX voor fenotypering pasgeboren granule cellen in de dentate gyrus van nestin-GFP muizen. (A) BrdU werd 3 maal elke 2 uur toegediend op postnatale dag 70 . De dieren werden 2 uur later opgeofferd. (B) representatief beeld van een co-kleuring voor BrdU, GFAP,nestine-GFP en DCX. (C) representatief beeld van viervoudige immunofluorescentie voor Ki67, GFAP, nestine-GFP en DCX. (D) Indeling van voorlopercellen celtypen volgens hun immunofluorescentie etikettering. Gebaseerd op de co-expressie van verschillende markers en de morfologische kenmerken van de gelabelde cellen vier verschillende progenitorcel subtypen worden onderscheiden: type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), het type 2a (GFAP -, nestine +, DCX - ), het type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) en type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +). Schaal balk vertegenwoordigt 20 pm. (E) Schematisch overzicht van de verschillende stadia van de volwassen hippocampus neurogenese. Het illustreert de 4 types voorlopercellen, onvolwassen neuronen en volwassen granule cellen, hun karakteristieke uitdrukking van markers en hun proliferatieve capaciteit. ML - moleculaire cellaag, GCL -granulaire cellaag, SGL -. subgranulaire cellaag Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Voorbeeld van succesvolle en niet-succesvolle sequentiële kleuringen met twee primaire antilichamen die in hetzelfde species, afhankelijk van de sequentie van antilichaam incubatie. De confocale microfoto's tonen het resultaat van een sequentiële co-kleuring met Ki67 en GFAP met primaire antilichamen beiden afgeleid van konijn. In (A) immunohistochemie werd eerst ingevuld voor GFAP, gevolgd door kleuring met Ki67 hetgeen een uitgesproken overlap van de twee signalen. In het bijzonder was de Ki67 signaal atypische en leek het signaal van de GFAP kleuring. (B) toont de resultaten van de omgekeerdekleuring sequence met de Ki67 vlekken afgerond eerste en volgende kleuring tegen GFAP. Hier, de voor beide antigenen leek het verwachte patroon uitdrukking: De Ki67 signaal werd beperkt tot kernen in de subgranulaire zone terwijl de GFAP signaal cytoplasmatically werd gevonden, voornamelijk in de cellulaire processen die voortkomen uit de subgranulaire zone. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn. RHX - Rhodamine X. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8. Specificiteit van de α-BrdU-antilichamen gebruikt voor het detecteren CldU en IDU. Muizen werden geïnjecteerd met hetzij CldU of IDU (niet- simultane toepassing). In (A) hersencoupes van CldU (A1) of IDU (A2) geïnjecteerde muizen immunostained met gezuiverde rat α-BrdU antilichaam dat specifiek moeten kruisreageren met CldU, maar niet IDU. (B) toont de resultaten van vlekken hersenen van CldU (B1) of IDU (B2) muizen geïnjecteerd met de muis α-BrdU antilichaam dat wordt verwacht dat cross-reageren met IDG, maar niet CldU. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kwantificering en identificatie van subpopulaties van pasgeboren cellen is een centraal thema in het volwassen neurogenese onderzoek. De combinatie van proliferatie markers en antilichamen tegen eiwitten die tijdens bepaalde stadia van volwassen neurogenese maakt immunohistochemische detectie van deze subpopulaties. Sommige antilichamen of antilichaam combinaties vereisen specifieke kleuring omstandigheden.
Labeling van delende cellen met synthetische thymidine analogen nog steeds de gouden standaard voor het onderzoeken volwassen hippocampale neurogenese. Het is cruciaal om de juiste injectie protocol voor aanvang van het experiment beschouwen. We meestal toedienen van 50 mg / kg (lichaamsgewicht, ip) BrdU, maar concentraties kunnen verschillen, afhankelijk van de experimentele eisen (tot 300 mg / kg voor een bolus injectie) 8,16. Als IDG en CldU moeten worden geïnjecteerd sequentieel voor tijdelijke discriminatie van celpopulaties is het verplicht om equimolaire concentraties injecteren (
Voor immunokleuring, worden secties algemeen verwerkt vrij zwevende, meestal in 6-well platen voorzien van een dragerplaat en mesh inserts die de overdracht van de ene naar de andere oplossing vereenvoudigt. Bij wijze van uitzondering, het blokkeren, antilichaam incubatie en ABC reactie worden gedaanin 12- of 24-well platen zonder mesh inzetstukken dure oplossingen bezuinigen (0,5 tot 1 ml per well voldoende, afhankelijk van het aantal segmenten die moeten worden gekleurd). Tijdens deze stappen overdragen secties met behulp van een fijne borstel die moet worden gespoeld bij het wisselen oplossingen. Voorkomen dat delen van het uitdrogen en incubaties die rekening> 1 uur in een humified kamer uit te voeren. Alle incubaties moeten worden gedaan onder voortdurend roeren (max 150 rpm). Test altijd en titreer elk nieuw antilichaam veel. Langere antilichaam incubatie tijden (tot 2 dagen bij 4 ° C) kunnen vlekken te verbeteren. In het geval dat alleen de muis antilichamen beschikbaar tegen antigenen die u wilt visualiseren in muis weefsel is het raadzaam om endogene immunoglobulinen met sterk geconcentreerde monovalente Fab-fragmenten α-muis (paragraaf 3.4) te blokkeren. Wanneer het gebruik van deze techniek uit te breiden de volgende spoelstappen. Anders zou ongebonden Fab fragmenten binden aan uw primaire muis antilichaam. HCl voorbehandeling en boraatneutralisatie zijn alleen vereist voor de detectie van thymidine-analogen. De 12 min peroxidase reactie leiden tot een optimale signaal-ruisverhouding van de voorwaarden en antilichamen toegepast ons protocol. Zoals bij elke enzymatische reactie, de snelheid van de peroxidase reactie hangt van vele factoren (zoals temperatuur, pH, concentratie van enzym en substraat). Bijgevolg reactietijden moeten worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe antilichaam set. Anatomische structuren in DAB vlekken te visualiseren met een zeer zwakke achtergrond (bv CldU), kunnen plakken worden tegengekleurd. De cresylviolet methode beschreven in paragraaf 3.5 resulteert in een zeer zwakke tegenkleuring dat de specifieke DAB signaal niet in gevaar brengt.
Voor meerdere immunofluorescentie, gebruiken primaire antilichamen die zijn opgegroeid in verschillende soorten of van verschillende isotypen en volg paragraaf 3.2.1. Anders, het uitvoeren van een sequentiële meerdere immunolabeling die is geoptimaliseerd voor meerdere primaire antilichamen te detecterenvan dezelfde host soorten (dwz, muis of konijn; paragraaf 3.2.2). Het basisprincipe van deze methode is uitgevonden door Ferguson en collega's die met succes gekleurd verschillende spieren markers met twee muis primaire antilichamen 17. De Fab-fragmenten die voor het blokkeren in stap 3.2.2.5 moet worden afgeleid van dezelfde gastheersoort als secundaire antilichamen. De concentraties en de incubatietijd in paragraaf 3.2.2 beschreven zijn geoptimaliseerd voor de specifieke antilichamen die hierin zijn beschreven en moeten worden gecorrigeerd voor een eventuele nieuwe antilichaam combinatie. Wees ervan bewust dat de volgorde van de primaire antilichaam incubatie sterk zou beïnvloeden de uitkomst (zoals aangegeven in figuur 7A). Waar van toepassing, dient gedetecteerd door de primaire antilichamen die zijn afgeleid van dezelfde soort antigenen een verschillend expressiepatroon waarbij de detectie onvoldoende blokkering vereenvoudigt tonen. Om elke mogelijkheid van antilichamen kruisreacties of vals-positieven te elimineren is het essentieel om passende controles (dat wil zeggen, alleen-secundair antilichaam controles; volledige immunohistochemie voor eerste antigen gevolgd door een incubatie met tweede primaire antilichaam of tweede secundaire antilichaam alleen) op te nemen. 18 Figuur 2B toont antilichaam combinaties die goed in onze handen gewerkt. Voor meerdere immunofluorescentie is het ook raadzaam om secundaire antilichamen die zijn opgegroeid in dezelfde soort (bijvoorbeeld, ezel) te gebruiken en hebben een minimale kruisreactiviteit voor uw weefsel en om eiwitten van andere soorten (dwz pre-geadsorbeerd) serum. Anders sectie 3.2.3 kan helpen om eventuele onverwachte interspecies voorkomen cross-reactiviteit. Selecteer fluorochromen met minimale spectrale overlap geschikt is voor uw detectiesysteem (bv AMCA, Alexa Fluor 488, Rhodamine Rood, Alexa Fluor 647). Als een nucleaire tegenkleuring nodig, voeg DAPI of Hoechst 33342 (10 ug / ml) aan het secundaire antilichaam cocktail (dus geen nabij-UV secundair antilichaam ons kan wordened). Deze nucleaire counterstains werken niet als weefsel is voorbehandeld met HCl. Evenzo kan HCl behandeling de detectie van bepaalde antigenen beschadigen en derhalve de invloed van individuele prestaties antilichaam getest moet worden. Zodra de fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen zijn toegepast protect secties tegen licht.
CldU en IDG kan worden gevisualiseerd met behulp van twee verschillende BrdU-antilichamen die kruisreageren met CldU (rat α-BrdU) of IDG (muis α-BrdU) 9,19 ofwel. Als beide thymidine-analogen zijn geïnjecteerd in één dier is het absoluut noodzakelijk om het gezuiverde rat α-BrdU-antilichaam te detecteren CldU omdat de niet-gezuiverde antilichaam cross-reageert op IDU. Zoals beschreven door Vega et al. 9 de CldU signaal moet worden geamplificeerd voor immunofluorescentie co-labeling gelijkwaardige detectie van thymidine analogen bereiken. Daarom, in plaats van een fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (α-rat) een fluorochroom geconjugeerd streptavidine wordt toegevoegd na incubatie in een gebiotinyleerd secundair antilichaam (α-rat; paragraaf 3.2.4). Om ongewenste antilichamen kruisreacties onder controle secties van muizen die ofwel IDG of CldU ontvangen uit te sluiten (afzonderlijk; zie figuur 8). Gelijkwaardige detectie van IDU en CldU gebruik gedeelten van dieren die tegelijkertijd werden geïnjecteerd met equimolaire hoeveelheden CldU en IDU controleren (zie figuur 4).
Naar type 1 te bestuderen en 2 voorlopercellen typen we de voorkeur aan nestin-GFP transgene muizen 12 te gebruiken als nestin antilichamen vaak niet bevredigende resultaten opleveren. Nestin-GFP muizen hebben het voordeel dat betrouwbaar visualiseren nestin-positieve stamcellen en hun morfologische kenmerken in een bepaald ontwikkelingsstadium. De GFP-signaal moet worden versterkt door indirecte immunofluorescentie met een α-GFP antilichaam. Het secundaire antilichaam moet worden gekoppeld aan een fluorochrome met spectrale eigenschappen vergelijkbaar met GFP. Desgewenst kan nestin-GFP muizen worden gekruist met andere mutante muis lijnen de betrokkenheid van bepaalde genen in neurogenese onderzoeken. Inmiddels zijn er verbeterde nestin antilichamen Verstrekte label cellichamen en processen en kan worden gebruikt als alternatief voor de transgene benadering (zie materiaal lijst).
Het is cruciaal om te voldoen aan de 24 hr bevestiging aan overfixation voorkomen. De chemische reactiepartners formaldehyde in weefsel hoofdzakelijk eiwitten en formaldehyde genereert reactieve hydroxy- groepen op hun zijketens leidt tot verknoping van naburige aminozuren (vorming van methyleen bruggen). Dit kan maskeren van antigeen-epitopen en verlies van immunologische veroorzaken (zie de opmerkingen over specifieke antilichamen in het Materials List). Om verloren immunologische herstellen, meerdere epitoopversterking methoden bestaan die break-formaldehyde veroorzaakte eiwit cross-verbanden via eXposure warmte 20. In dit protocol, het citraat buffer methode werkt superieur aan anderen voor de detectie van neurogenese in de postnatale en volwassen hippocampus (paragraaf 3.3). Merk op dat de schijfjes van zeer jonge dieren (<P21) kan erg kwetsbaar of vervormd worden en moet met speciale zorg worden behandeld. Bovendien kan de epitoop schadelijk voor sommige epitopen en daarom afzonderlijke antilichamen worden getest of ze geschikt zijn voor meerdere kleuring dat voorbehandeling vereist is.
Kortom, dit protocol is een verzameling van basis en uitgewerkt technieken die de analyse van de volwassen hippocampus neurogenese te vergemakkelijken. Het laat vooral een duidelijke identificatie van alle hippocampus voorlopercellen subpopulaties samen met een wildgroei of geboorte-dating marker uit één sectie. Deze technieken kunnen worden aangepast aan elke combinatie van antilichamen of andere soorten van de ontwikkeling en regulering van hippocam bestuderenpal progenitorcellen in reactie op specifieke stimuli en hun betrokkenheid name hersenfuncties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
