Abstract
Neurogenese ist ein stark reguliert, mehrstufiges Verfahren, bei dem neue Neuronen aus einer aktivierten neuronalen Stammzelle über setzen verstärkt Zwischenvorläufertypen erzeugt. Jede dieser Subtypen exprimiert ein Satz spezifischer molekularer Marker, der zusammen mit spezifischen morphologischen Kriterien können für die Identifikation verwendet werden. Typischerweise werden Immuntechniken aufgebracht mit Subtyp-spezifische Antikörper in Kombination mit exo- oder endogenen Proliferationsmarker. Wir beschreiben hier Immunmarkierung Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von allen Stadien der Erwachsenen Neurogenese. Diese umfassen die Anwendung der Thymidinanaloga, transkardialer Blutung, Gewebeverarbeitung, hitzeinduzierter Epitopdemaskierung, ABC Immunhistochemie, mehrere indirekte Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Zell Quantifizierung. Außerdem eine sequentielle Mehrfachimmunfluoreszenz-Protokoll, das Probleme u umgeht präsentieren wirsually sich aus der Notwendigkeit der Verwendung von primären Antikörpern in den gleichen Wirtsspezies erhöht. Es ermöglicht eine genaue Identifizierung aller Hippocampus-Vorläuferuntertypen zusammen mit einem Proliferationsmarker in einem einzigen Abschnitt. Diese Techniken sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung der unterschiedlichen Vorläufertypen parallel, ihre Beteiligung an der Hirnerkrankungen und deren Rolle in spezifischen Gehirnfunktionen zu untersuchen.
Introduction
Zwei Hirnregionen konstitutiv erzeugen neue Nervenzellen während des gesamten Lebens, das Subventrikularzone der Seitenventrikel und der Subgranularzone (SGZ) des Gyrus dentatus des Hippocampus (DG). Die neugeborenen Neuronen stammen aus neuralen Vorläuferzellen und durchlaufen verschiedene Stadien der morphologischen und physiologischen Entwicklung vor Erreichen der Geschlechtsreife 1,2. Aus einem sich langsam teil radialen Gliazellen artigen Stammzellen (Typ 1) aufeinanderfolgenden Stufen der transit amplifying Zwischenvorläuferzellen entstehen. Je mehr undifferenzierte Untertypen (Typ 2a und Typ 2b) eine unregelmäßige Form mit kurzen, tangentialen Prozesse. Sie erzeugen Neuroblasten (Typ 3), die nach und nach in den Zellzyklus verlassen, um unreife Neuronen werden (mit Dendriten erweitert in Richtung der molekularen Schicht) und schließlich in den Hippocampus-Netzwerk als reife Körnerzellen zu integrieren. Aufgrund ihrer besonderen physiologischen Eigenschaften diese Zellen stellen die Schaltung mit verbesserter Plastizität 3 suggesting eine einzigartige Rolle bei der Funktion des Hippocampus. Eigentlich Studien der letzten zehn Jahre generiert erhebliche Beweise dafür, dass die adulte Neurogenese trägt zur räumlichen Gedächtnisses, Muster Trennung und emotionales Verhalten 4,5.
Adulte Neurogenese kann durch verschiedene Ansätze untersucht werden. Thymidinanaloga integrieren in die DNA während der S-Phase des Zellzyklus und ermöglichen Geburt aus, Quantifizierung und Schicksal Analyse der neugeborenen Zellen 6-8. Sequentielle Anwendung unterschiedlicher Thymidin-Analoga (zB CldU, EdU oder IdU) kann zur Zellerneuerung oder Zellpopulationen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs des Experiments 9 geboren untersuchen. Eine Alternative, endogenen Marker für Zellproliferation Ki67. Es ist in sich teilenden Zellen in allen Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M), mit Ausnahme der Ruhephase (G0) und dem Beginn des G1 10,11 ausgedrückt. Um den Phänotyp Neugeborenen Zellpopulationen in der Erwachsenen dentat analysierene Gyrus mehrere stufenspezifische molekulare Marker wie GFAP, Nestin, DCX und NeuN 1,6 verwendet werden. GFAP ist ein Marker für reife Astrozyten wird aber auch in radialer Gliazellen-ähnlichen Zellen in der adulten Vorderhirn exprimiert. Nestin ist ein Zwischenfaden spezifisch für radiale Glia-ähnlichen Zellen und frühen Zwischen Progenitorzellen. DCX ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein in Zwischenvorläuferzellen, Neuroblasten und unreife Neuronen exprimiert. Auf der Grundlage der (Mit-) Expression dieser drei Marker und die morphologischen Merkmale der markierten Zellen vier verschiedene Vorläuferzelltypen zu unterscheiden: Typ 1 (GFAP +, Nestin +, DCX -), Typ 2a (GFAP - Nestin + , DCX -) Typ 2b (GFAP - Nestin +, DCX +) und Typ 3 (GFAP - Nestin -, DCX +) ein. Co-Kennzeichnung von DCX mit NeuN, die in postmitotischen Neuronen exprimiert wird, ermöglicht die Differenzierung von immature (DCX +, NeuN +) und reifen (DCX -, NeuN +) Körnerzellen.
Die oben genannten Markierungen werden häufig für Immunofluoreszenz co-Kennzeichnung und anschließende konfokale Mikroskopie verwendet, um die Anzahl und die Identität von neugeborenem Zellen zu analysieren. Dies erfordert typischerweise Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies zu unerwünschten Antikörper Kreuzreaktivität verhindern. Allerdings ist die Mehrzahl der primären Antikörper für die Neurogenese Forschung angehoben entweder in Kaninchen oder Mäusen (zB Maus-α-BrdU, Maus α-NeuN, Kaninchen α-Ki67, Kaninchen α-GFAP). Dies führt zu starken Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl und Kombination von Antigenen, die in einer einzigen Scheibe ausgewertet werden konnte. Dies wiederum nicht steigt nur der Färbung Aufwand, da mehrere Färbungen müssen durchgeführt werden, sondern könnte auch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Darüber hinaus sind einige Antigene anfällig für Formalinfixierung induzierte Epitop Maskierung (zB Ki67Nestin). Wir beschreiben hier Änderungen von den klassischen Ein- und Mehr Immunomarkierung Protokolle (zB Epitopdemaskierung, mehrere aufeinander folgende Immunfärbung, die Verwendung von Nestin-GFP transgenen Mäusen, 12), die viele dieser Probleme zu überwinden. Insbesondere erlaubt die sequenzielle Mehrfachimmunfärbungsprotokolls gegen bis zu vier unterschiedlichen Antigene auch wenn ein Teil der Antikörper wird aus dem gleichen Wirt stammen. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Typ 1, Typ 2a, 2b Typ und Typ 3-Vorläuferzellen, sowie ihre proliferative Aktivität innerhalb einer einzelnen Seite.
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Protocol
HINWEIS: Alle Verfahren, die lebende Tiere wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 86/609 / EWG des Rates Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Ethikkommission (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) zugelassen wurde.
1. intraperitoneale Injektion von Thymidinanaloga
- Wiegen Tiere am Tag vor der Injektion. Berechnen Sie die Menge an Thymidin-Analogon für alle am nächsten Tag sowie individuelle Gewicht angepassten Injektionsvolumina einer 10 mg / ml Stammlösung geplant Injektionen erforderlich.
- Bereiten Sie 10 mg / ml Thymidin-Stammlösung. (VORSICHT! Thymidin-Analoga sind giftig. Folgen Sie den spezifischen Sicherheitsdatenblätter (MSDS) von den Lieferanten zur Verfügung gestellt, also tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug).
- Nehmen Thymidin-Analogon aus dem Gefrierschrank und bringen es auf RT, ca. 21 ° C. Wiegen Sie 10 mg und fügensteriler Kochsalzlösung (für BrdU und CldU) oder 0,04 N NaOH (in steriler Kochsalzlösung, für IDU), Wirbel. Platz für mindestens 10 bis 15 Minuten lang in einem 50 ° C Wasserbad und Wirbel alle 2 - 3 Minuten, um das Pulver aufzulösen.
HINWEIS: Lösungen für bis zu 24 Stunden, wenn sie bei Raumtemperatur und für mehrere Wochen bei -20 ° C gelagert. Schützen Lösungen von Licht (Abdeckung mit Aluminiumfolie). Kontrollieren Sie immer die Niederschläge und wieder auflösen, wenn nötig.
- Nehmen Thymidin-Analogon aus dem Gefrierschrank und bringen es auf RT, ca. 21 ° C. Wiegen Sie 10 mg und fügensteriler Kochsalzlösung (für BrdU und CldU) oder 0,04 N NaOH (in steriler Kochsalzlösung, für IDU), Wirbel. Platz für mindestens 10 bis 15 Minuten lang in einem 50 ° C Wasserbad und Wirbel alle 2 - 3 Minuten, um das Pulver aufzulösen.
- Restrain die Maus durch das Genick und intraperitoneale Injektion eines geeigneten, dem Gewicht angepassten Volumen der Stammlösung (bei Raumtemperatur) mit einer feinen Dosierung Spritze mit einer 30 G-Nadel.
HINWEIS: Bei CldU und IdU müssen nacheinander im gleichen Tier verabreicht werden, zu prüfen, um äquimolare Konzentrationen injiziert (zB 42,5 mg / kg CldU und 57,5 mg / kg IdU, die 50 mg / kg BrdU entsprechen). Deshalb passen Sie die Injektionsvolumina der 10 mg / ml-Stammlösungen.
2. Gewebepräparation
- PrepaWieder 4% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 am Tag vor Perfusion. Lagerung bei 4 ° C.
- Transkardial perfuse die tief narkotisierten Mäusen (3,5% Isofluran) über der linken Herzkammer mit 10 ml eiskaltem PBS, dann mit 40 ml eiskaltem Formaldehyd (Durchflussrate von 5 ml / min). Präparieren des Gehirns und post-fix im gleichen Fixativ für 24 h bei 4 ° C.
- Übertragen Sie die Gehirne nacheinander in 10% (24 Stunden bei 4 ° C) und 30% Saccharose (bis das Gehirn sinkt, ca. 48 h). Zum Einfrieren langsam tauchen die kryogeschützt Gehirn in -25 ° C Isopentan bis keine Luftblasen entstehen aus dem Gewebe. Bei -80 ° C.
- Geschnitten Koronalschnitte von 40 um Dicke auf einem Gefriermikrotom (Blocktemperatur bei -25 bis -16 ° C). Sequenziell Übertragungsabschnitten in Frostschutzlösung, die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte (siehe Abbildung 1). Lagerung bei -20 ° C.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Übertragung von Mikrotom Scheiben in eine 24-Well-Platte. Bei A1 starten und legen nachfolgende Scheiben in Reihe A nach A6 gehen in die nächste Zeile B und so weiter. Bei Erreichen D6, gehen Sie zurück zu A1 und fortfahren. Diese Anordnung von Scheiben ermöglicht die Quantifizierung von jedem n-ten Abschnitt eines gesamten Gehirns. Zur Quantifizierung von neugeborenen Zellen nehmen jeden 6. Hirnschnitt (entsprechend dem Inhalt einer Spalte), Immunfluoreszenz Phänotypisierung nehmen jeden 12-ten Abschnitt (entspricht dem Gehalt von 2 alternierende Reihen von einer Spalte).
3. Immunfärbung
HINWEIS: Abschnitte verarbeitet frei schwebenden, in der Regel in 6-Well-Platten mit einer Trägerplatte ausgestattet und Mesh-Einsätzen. Ausnahmsweise Blockieren, Antikörperinkubationen und ABC-Reaktion sind in 12- oder 24-Well-Platten durchgeführt, ohne Mesh-Einsätze (0,5 bis 1 ml pro well reicht, abhängig von der Anzahl der Schichten, die gefärbt werden müssen). Während dieser Schritte Übertragungsabschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste (Spülen mit jeder neuen Lösung). Alle Inkubationen werden unter ständigem Rühren (max 150 rpm) durchgeführt.
- Immunhistochemie (ABC-Methode)
- Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 Minuten jede) zu Frostschutzmittel vollständig zu entfernen.
- Inkubieren für 30 min in 1,5% H 2 O 2 in TBS-T, um endogene Peroxidase-Aktivität zu quenchen. Achten Sie auf die Blasenbildung und wieder tauchen Abschnitte, wenn nötig. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
- Optional: Inzwischen vorzuwärmen Heizschrank und 2 N HCl auf 37 ° C. Abschnitte Inkubation 30 min bei 37 ° C in 2 N HCl, um DNA zu denaturieren. Sanft getrennte Abschnitte mit Hilfe eines Pinsels.
- Optional: Neutralisieren Sektionen für 10 min in 0,1 M Boratpuffer pH8,5, RT. Während der Übertragung, kurz Tupfer die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um HCl leavings entfernen. Spülen Sie 2 mal in TBS 15 min je.
- Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT zu blockieren.
- Inkubieren in primären Antikörper in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
- Inkubiere in biotinylierten sekundären Antikörper in TBSplus, 3 h bei RT verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. In der Zwischenzeit ...
- Bereiten ABC-Komplex gemäß dem Protokoll des Herstellers (1% A + 1% B in TBS-T). Man lässt 30 min bei RT stehengelassen, bevor Gebrauch. Abschnitte AB Reagenz Inkubation für 1 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
- Bereiten Sie 50 ml 0,5 mg / ml DAB in TBS-T pro 6- oder 12-Well-Platte, aufgeteilt in zwei Hälften und Pipette 4 ml oder 2 ml pro Vertiefung auf. Übertragungsabschnitten in DAB-Lösung (VORSICHT! DAB ist giftig. Folgen Sie der spezific Sicherheitsdatenblatt des Lieferanten, dh tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug).
- 0,5 ml 1% H 2 O 2 zu den verbleibenden 25 ml DAB-Lösung, zu mischen und Pipetten äquivalente Volumina wie oben in jede Vertiefung Peroxidase-Reaktion gestartet werden. Inkubieren für 12 min. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
- Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit permanentes Fixiermittel.
- Optional: bevor Sie das Deckglas Gegenfärbung (siehe Abschnitt 3.5).
HINWEIS: Wenn das Signal-zu-Rausch-Verhältnis niedrig ist, da der hohe Hinter Wiederholen H 2 O 2 -Behandlung nach der Inkubation mit AB-Reagenz (Schritt 3.1.8).
- Multiple-Immunfluoreszenz
- Einzelne oder gleichzeitig mehrere Immunfluoreszenz
- Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 min jeweils) vollständig zu entfernen eintifreeze.
- Optional: wie Sie die Schritte 3.1.3 - 3.1.4.
- Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und blockieren unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT.
- Inkubieren in primären Antikörper-Cocktail (zB Ratten α-BrdU, Meerschweinchen α-DCX, Ziegen α-GFP) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
- Inkubieren in Cocktail aus einem Fluorochrom konjugierte Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red α-rat, Alexa-647 α-Meerschweinchen, Alexa-488 α-Ziege, alle in Esel abgeleitet) in TBSplus verdünnt, 3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je.
- Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit wässrigem Eindeckmedium.
- Sequential mehrere Immunfluoreszenz mit primären Antikörpern aus derselben Wirtsspezies
- Da die Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- Inkubieren in fiersten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen A), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubieren im ersten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubieren in 10% Normalserum von demselben Host wie die primären Antikörper (zB Kaninchenserum) für 3 h RT offen Paratope am ersten sekundären Antikörpers sättigen. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubiere in TBSplus mit 50 ug / ml unkonjugierter einwertige Fab-Fragmente gegenüber dem Gastgeber der primären Antikörper gerichtet (zB α-Kaninchen-IgG (H + L)) an Epitope, die von dem zweiten sekundären Antikörper, O / N erfasst werden kann abzudecken 4 ° C.
- Mindestens 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. Während der Übertragung, kurz swab die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um alle Fab leavings entfernen.
- Inkubieren im zweiten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen B), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubieren im zweiten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Alexa-488-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben.
HINWEIS: Um die Antigene mit Antikörpern beschriften aus verschiedenen Wirtsarten fügen Sie sie in Schritt 3.2.2.2 und den entsprechenden Sekundärantikörper zu Schritt 3.2.2.3.
- Eine der sekundären Antikörper aus derselben Spezies wie eine der primären Antikörper
Hinweis: Dieses Protokoll ist zusammen mit GFAP, Nestin-GFP und DCX geeignet für Vierfachfärbung gegen BrdU oder Ki67.- Befolgen Sie streng Protokoll Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Bis zu diesem Zeitpunkt ausschließlich Eselserum in TBSplus.
- Inkubiere in TBSplus enthaltend 3% Ziegenserum, 1 h bei RT. Dies umfasst offene Paratope auf der α-Ziege sekundären Antikörper. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubieren in AMCA-Konj. Ziegen α-Kaninchen in TBSplus, 3 Stunden RT oder O / N 4 ° C verdünnt. Dreimal in TBS Spülen für 15 Minuten jeweils, montieren und Deckglas oben.
- CldU, IdU Co-Färbung
- Spülen, denaturieren und zu neutralisieren Abschnitte, wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben (Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- Inkubieren mit 20 ug / ml unkonjugierter Fab Fragmente α-Maus-IgG (H + L) in TBSplus, 1 h bei RT. Spülen 4 mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubieren in primären Antikörper-Cocktails Ratte α-BrdU (1: 400; gereinigt IgG2) und Maus-α-BrdU (1: 350) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubation in sekundärem Antikörper-Cocktail enthält biotinylierten Esel α-Ratte (1: 500) und FITC-conj. Esel α-Maus-Fab-Fragmente (1: 100). 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min.
- Inkubieren in Rhodamin Red-Konj. Streptavidin, 2 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben.
- Die Amplifikation von Fluoreszenzsignal in Nestin-GFP-Mäuse
- Hinzufügen Ziege α-GFP an den primären Antikörper-Cocktail.
- Hinzufügen eines Fluorochrom konjugierten sekundären Antikörpers mit spektralen Eigenschaften ähnlich GFP (wie Alexa 488 conj. Esel α-Ziege) an den sekundären Antikörper-Cocktail.
- Einzelne oder gleichzeitig mehrere Immunfluoreszenz
- Epitopdemaskierung
- Führen Sie Epitopdemaskierung nach dem Ausspülen Frostschutzmittel. Vorheizen Dämpfer mit 6- oder 12-Well-Platten mit 0,1 M Citratpuffer pH 6,0 bis 95 bis 99 ° C (etwa 25 min).
- Übertragen Sie die Abschnitte in die heiße Citratpuffer und Dampf für 30 Minuten (die Platten abdecken mit Aluminiumfolie als Kunststoff lIDs sind nicht hitzebeständig).
- Unmittelbar danach die Platten in einem Eisbad abkühlen. Dies hilft, um Gewebemorphologie, die von besonderer Bedeutung ist bei der Arbeit mit Hirnschnitten der postnatalen Tieren zu schützen.
- Spülen Sie 3 mal in TBS für jeweils 10 min zu spülen und zu neutralisieren, das Citrat und weiterhin Färbung.
- Maus-Antikörper auf Mausgewebe
- Mit 20 & mgr; g / ml einwertige Fab-Fragmente α-Maus-IgG (H + L; gleichen Wirtsart als sekundärer Antikörper) zu der ersten Sperrstufe (zB Schritt 3.1.5 oder 3.2.1.3).
- Spülen Sie 4-mal in TBS und einmal in TBS-T für 10 Minuten jeweils, und fahren Sie mit entsprechenden Protokoll.
- Kresylviolett Gegenfärbung
- Vorheizen Kresylviolett Lösung auf 60 ° C (im Glas). Die Objektträger in der heißen Lösung für 3 min.
- Spülen Sie in aq. dest. und dehydratisieren 2 Mal für jeweils 1 min in 70%, 96% und 100% Isopropanol ist. Klar für 5-6 min in Xylol oder Xylol-Ersatzstoff und Deckglas mit einem kompatiblen permanentes Fixiermittel.
4. Datenanalyse
- Graf Peroxidase gefärbt neugeborenen Zellen in jedem 6-ten Abschnitt entlang der gesamten rostrokaudalen Umfang des Gyrus dentatus. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung.
- Multiplizieren die resultierende Zellzahlen mit dem Schnittpunkt-Intervall, um eine Schätzung der Gesamtzahl der Neugeborenen-Zellen zu erhalten.
- Bild der Fluoreszenz mit einem konfokalen Lasermikroskops mit geeigneten Laser und Filtersystemen ausgestattet beschriftet Abschnitte. Nehmen Bildstapeln an zufälligen Positionen entlang der gesamten Ausdehnung des Gyrus dentatus bei 400-facher Vergrößerung und mindestens 50 zufällig ausgewählten interessierenden Zellen pro Hemisphäre für die Co-Markierung mit anderen Markern analysiert.
- Multiplizieren die resultierende Prozentsatz der co-markierten Zellen (% / 100) mit der Gesamtzahl der neugeborenen Zellen zu berechnen absoluteNummern bestimmter neugeborenen Zellpopulationen.
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Representative Results
Wir verwendeten die vorstehend beschriebenen zu quantifizieren und zu charakterisieren neugeborenen Zellen in den postnatalen und Hippocampus Methoden. Daher haben wir Wildtyp und Neurogenese-defizienten Cyclin D2 Knock-out (CCND2 KO) Mäuse unter Bedingungen bekannt, die Rate der Neurogenese (dh angereicherten Umgebung, EE) 13,14 beeinflussen gebracht. Immunhistochemische Färbung DAB entweder gegen Ki67, BrdU CldU oder IdU konsistent zeigten unterschiedliche neugeborenen Zellzahlen zwischen Wildtyp- und CCND2 KO-Mäusen (Figur 3) 15. Außerdem mit fort äquimolaren Injektionen CldU und IdU konnten wir Zellpopulationen zu bestimmten Zeiten EE (3C, D) geboren diskriminieren. Die Annahme Abschnitt 3.2.4 konnten wir erfolgreich gleiche Signalintensitäten und ausgezeichnete Überlappung CldU und IdU nach ihrer gleichzeitigen Lieferung (Abbildung 4) zu erkennen. BrdU markiert neugeborenen Zellen könnte mit einem stan phänotypisiert werdendard Immunfluoreszenzverfahren entweder durch gleichzeitiges Anlegen von BrdU und NeuN, (Figur 5) oder BrdU, GFAP, Nestin-GFP und DCX Antikörper (Abbildung 6B). Diese Technik erlaubt eine erfolgreiche Identifizierung Typ 1, 2a, 2b und 3 Vorläuferzellen innerhalb einer einzelnen Probe (6B, D). Co-Kennzeichnung von Ki67 mit Vorläufermarker benötigt die sequentielle Anwendung von Antikörpern als primäre Antikörper gegen Ki67 und GFAP wurden bei Kaninchen erhöht (gilt für Abschnitt 3.2.2) ist zudem eine der primären Antikörpern (Ziege α-GFP) in die erzeugte demselben Host wie eine der Sekundärantikörper (AMCA conj. Ziegen α-Kaninchen). Eine Kombination der Abschnitte 3.2.2 und 3.2.3 perfekt funktioniert, wenn Teile wurden erstmals im Ki67 zusammen mit Nestin-GFP-Antikörper, zum anderen in GFAP-Antikörper aber nicht umgekehrt (6C). 2B einen Überblick über die genehmigten Anwendungssysteme.
Abbildung 2. Sequenzielle mehrere Immunfluoreszenz mit primären Antikörpern aus den gleichen Wirtsspezies stammen. (A) Schematische Darstellung. (B) Die erfolgreiche Kombination von Antikörpern und deren Reihenfolge in der Immunfluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Lichtmikroskopische Bilder von ABC-Immunhistochemie zur Quantifizierung der neugeborenen Zellen im Gyrus dentatus. Dargestellt sind Vergleiche verschiedener Proliferationsmarker in WT und Neurogenese-defizienten CCND2 KO-Mäusen bei 100-facher und 400-facher Vergrößerung. (A) g> Ki67-DAB-Färbung zeigt Cluster von proliferierenden Zellen in der Subgranularzone des Gyrus dentatus (postnatalen Tag 35). Die Anzahl der wuchernden Zellen in CCND2 KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen vermindert. (B) Newborn Zellen 28 Tage nach BrdU-Verwaltung (Injektionsschema oben Bilder) Bestätigung der reduzierten Proliferationsrate in CCND2 KO-Mäusen. (C) CldU-Verwaltung während der 6. Woche der EE (Injektionsschema Bild oben) zeigte eine Erhöhung der Anzahl von neugeborenen Zellen im Gyrus dentatus des WT aber nicht CCND2 KO-Mäusen. (D) IdU-Verwaltung während der 8. Woche EE zeigten ähnliche Ergebnisse. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 4. Immun Co-Färbung von CldU und IdU nach gleichzeitiger Lieferung von äquimolaren Konzentrationen. Signalverstärkung von CldU markierten Zellen führte zu einer ausgezeichneten Überlappung CldU und IdU. Maßstabsbalken entspricht 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Immun Co-Kennzeichnung NeuN und BrdU. (A) BrdU wurde 6 mal pro 8 h für 2 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am postnatalen Tag 14. Die Tiere wurden 28 Tage später getötet, verabreicht. (B) Immunfluoreszenz co-Markierung von proliferierenden Zellen mit dem reifen neuronalen Marker NeuN zeigt eine reduzierte Anzahl von proliferierenden Zellen in CCND2 KO im Vergleich zu WT Tieren. Maßstabsbalken entspricht 50 um. (C) Vergrößerte Ansicht (B), die Co-markierten Zellen in beiden Genotypen. Maßstabsbalken entspricht 20 & mgr; m. (D) Hohe Vergrößerung Beispiel eines BrdU / NeuN co-markierten Zellen im Gyrus dentatus. Maßstabsbalken entspricht 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Vierbettimmun Co-Kennzeichnung verschiedener Proliferationsmarker mit GFAP, Nestin-GFP und DCX zur Phänotypisierung neugeborenen Körnerzellen im Gyrus dentatus von Nestin-GFP-Mäusen. (A) BrdU wurde am postnatalen Tag 70 3 mal alle 2 Stunden verabreicht . Die Tiere wurden 2 Stunden später getötet. (B) repräsentative Bild von einem Co-Färbung für BrdU, GFAP,Nestin-GFP und DCX. (C) Repräsentatives Bild vervierfachen Immunfluoreszenz für Ki67, GFAP, Nestin-GFP und DCX. (D) Klassifizierung der Vorläuferzelltypen nach ihrer Immunfluoreszenzmarkierung. Basierend auf der Co-Expression verschiedener Marker und die morphologischen Merkmale der markierten Zellen vier verschiedene Vorläuferzelltypen zu unterscheiden: Typ 1 (GFAP +, Nestin +, DCX -), Typ 2a (GFAP - Nestin +, DCX - ) Typ 2b (GFAP - Nestin +, DCX +) und Typ 3 (GFAP - Nestin -, DCX +). Maßstabsbalken entspricht 20 um. (E) Schematischer Überblick über die verschiedenen Phasen des Erwachsenenneurogenese. Es veranschaulicht die 4 Vorläuferzelltypen, unreife Nervenzellen und reifen Körnerzellen, deren charakteristische Expression von Markern und ihrer Vermehrungsfähigkeit. ML - molekulare Zellschicht, GCL -körnige Zellschicht, SGL -. subgranulären Zellschicht Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 7. Beispiel von erfolgreichen und nicht erfolgreichen sequentiellen Färbungen mit zwei primären Antikörper in derselben Art erhöht, abhängig von der Sequenz der Antikörper-Inkubation. Die konfokalen Mikrophotographien zeigen die Ergebnisse einer sequentiellen Co-Färbung gegen Ki67 und GFAP mit primären Antikörpern sowohl aus Kaninchen abgeleitet. In (A) Immunhistochemie wurde zuerst für GFAP, gefolgt von einer Färbung gegen Ki67, die zu einer starken Überlappung der beiden Signale geführt abgeschlossen. Insbesondere war die Ki67 Signal atypischen und ähnelte dem Signal des GFAP-Färbung. (B) zeigt die Ergebnisse aus der UmkehrFärbung Sequenz mit dem Ki67 Färbung abgeschlossen ersten und nachfolgenden Färbung gegen GFAP. Hier werden die Signale für beide Antigene glich der erwarteten Expressionsmuster: Die Ki67 Signal an Kernen innerhalb des Subgranularzone eingeschränkt, solange die GFAP Signal zytoplasmatisch hauptsächlich in den zellulären Prozessen, die aus der Subgranularzone gefunden. Maßstabsbalken entspricht 20 um. RhX - Rhodamin X. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 8. Die Spezifität der verwendeten CldU und IdU. Mäuse detektieren α-BrdU-Antikörper wurden entweder mit CldU oder IdU (zeitversetzter Applikation) injiziert. In (A) Hirnschnitte CldU (A1) oder IdU (A2) injizierten Mäuse immunostained Verwendung des gereinigten Ratten-α-BrdU-Antikörper, die spezifisch an CldU Kreuzreaktion sollte, aber nicht an die IDU. (B) zeigt die Ergebnisse der Färbung Gehirne CldU (B1) oder IdU (B2) injizierten Mäuse mit der Maus α-BrdU Antikörper, der zu erwarten ist, kreuzreagieren mit IdU, aber nicht CldU. Maßstabsbalken entspricht 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Quantifizierung und Identifizierung von Subpopulationen von neugeborenen Zellen ist ein zentrales Thema in der adulten Neurogenese Forschung. Die Kombination von Proliferationsmarker und Antikörper gegen Proteine in bestimmten Phasen der adulten Neurogenese ausgedrückt ermöglicht immunhistochemischen Nachweis dieser Subpopulationen. Einige der Antikörper oder Antikörperkombinationen erfordern spezifische Färbung Bedingungen.
Kennzeichnung von sich teilenden Zellen mit synthetischen Thymidinanaloga ist immer noch der Goldstandard für die Untersuchung Erwachsenen Neurogenese. Es ist entscheidend, um die geeignete Injektionsprotokoll vor der Test gestartet berücksichtigen. Wir verwalten Regel 50 mg / kg (Körpergewicht, ip) BrdU aber Konzentrationen können je nach Versuchsanforderungen unterscheiden (bis zu 300 mg / kg für eine Bolus-Injektion) 8,16. Wenn IdU und CldU haben, um der Reihe nach für zeitliche Diskriminierung von Zellpopulationen injiziert werden ist es zwingend erforderlich, um äquimolaren Konzentrationen zu injizieren (
Für die Immunfärbung, sind Abschnitte der Regel verarbeitet frei schwebenden, in der Regel in 6-Well-Platten mit einer Trägerplatte ausgestattet und Mesh-Einsätzen, die ihren Übergang von einer Lösung zur anderen erleichtert. Als Ausnahme, Sperrung, Antikörperinkubationen und ABC Reaktion durchgeführt werdenin 12- oder 24-Well-Platten, ohne Mesh-Einsätze, teure Lösungen sparen (0,5 bis 1 ml pro Vertiefung reicht, abhängig von der Anzahl der Schichten, die gefärbt werden müssen). Während dieser Schritte über Abschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste, die abgespült werden beim Wechsel Lösungen braucht. Verhindern, dass Abschnitte von Austrocknung und führen Inkubationen, die> 1 Stunde in einem befeuchteten Kammer nehmen. Alle Inkubationen müssen mit kontinuierlichem Rühren (max 150 rpm) durchgeführt werden. Testen Sie immer und titriert jede neue Antikörper viel. Mehr Antikörper Inkubationszeiten (bis 2 Tage bei 4 ° C) kann Färbung verbessern. Falls nur Maus-Antikörper sind gegen Antigene, die Sie in Mausgewebe visualisieren möchten ratsam, endogene Immunglobuline mit hochkonzentrierter monovalente Fab-Fragmente α-Maus (Kapitel 3.4) zu blockieren ist. Immer, wenn mit dieser Technik zu verlängern die folgenden Spülschritte. Andernfalls könnten ungebundenen Fab-Fragmente, um Ihre primäre Maus-Antikörper zu binden. HCl Vorbehandlung und BoratNeutralisation nur zum Nachweis von Thymidin-Analoga erforderlich. Die 12 min Peroxidasereaktion ergeben ein optimales Signal-zu-Rausch-Verhältnis unter den Bedingungen und Antikörpern in unserem Protokoll angewendet. Wie bei jeder enzymatischen Reaktion, die Rate der Peroxidase-Reaktion hängt von vielen Faktoren (zB Temperatur, pH, Konzentration von Enzym und Substrat). Folglich müssen die Reaktionszeiten, um für jede neue Antikörpersatz optimiert werden. Anatomische Strukturen in DAB Flecken mit sehr schwachen Hintergrund (zB CldU) sichtbar zu machen, können Scheiben gegengefärbt werden. Die Kresylviolett Verfahren im Schnitt in einer sehr schwachen Gegenfärbung, die die spezifische DAB-Signal nicht beeinträchtigt beschrieben 3.5 Ergebnisse.
Bei mehreren Immunfluoreszenz, verwenden primären Antikörper, die in verschiedenen Arten oder von verschiedenen Isotypen angehoben werden, und folgen Sie Abschnitt 3.2.1. Andernfalls führen Sie eine fortlaufende Mehrfachimmunmarkierung, die optimiert wurde, um mehrere primäre Antikörper nachzuweisenaus den gleichen Wirtsarten (zB Maus oder Kaninchen, Abschnitt 3.2.2). Das Grundprinzip dieser Methode wurde von Ferguson und Kollegen, die verschiedenen Muskelmarkierungen erfolgreich gefärbt mit zwei Maus Primärantikörper 17 erfunden. Die für die Blockierung in Schritt 3.2.2.5 verwendet Fab-Fragmente ab denselben Wirtsspezies wie die Sekundärantikörper abgeleitet werden. Die in Abschnitt 3.2.2 beschriebenen Konzentrationen und Inkubationszeiten sind für die hierin beschriebenen spezifischen Antikörpern optimiert und müssen für jede neue Antikörperkombination eingestellt werden. Beachten Sie, dass die Reihenfolge der primäre Antikörper Inkubation könnte einen starken Einfluss auf das Ergebnis (wie in 7A dargestellt). Wo immer anwendbar werden, die durch die primären Antikörper, die aus der gleichen Spezies abgeleitet werden detektiert Antigene unterschiedliche Expressionsmuster, das den Nachweis der unzureichenden Sperr vereinfacht zeigen. Um jede Möglichkeit einer Antikörper-Kreuzreaktion oder falsch-positive beseitigen essen istlichen, geeignete Kontrollen (dh nur der Sekundarstufe-Antikörper-Kontrollen; komplette Immunhistochemie für erste Antigen gefolgt von einer Inkubation mit dem zweiten primären Antikörper oder zweiten sekundären Antikörper allein) enthalten. 18 2B zeigt Antikörper-Kombinationen, die gut in der Hand gearbeitet. Bei mehreren Immunfluoreszenz ist es auch ratsam, um Sekundärantikörper, die in der gleichen Art erhoben werden (zB Esel) verwenden und nur minimale Kreuzreaktivität mit Ihrem Gewebe und Proteine aus anderen Spezies (dh präadsorbiertem) gebunden. Ansonsten Abschnitt 3.2.3 kann helfen, alle unerwarteten Inter verhindern Kreuzreaktivität. Wählen Fluorochrome mit minimaler spektraler Überlappung entsprechend Ihrer Erfassungssystem (zB AMCA, Alexa Fluor 488, Rhodamine Red, Alexa Fluor 647). Wenn ein Kerngegenfärbung erforderlich ist, hinzuzufügen oder DAPI Hoechst 33342 (10 ug / ml) an den sekundären Antikörper-Cocktail (also kein nahes UV sekundäre Antikörper kann unsed). Diese Kern Gegenfärbemittel funktionieren nicht, wenn Gewebe wurde mit HCl vorbehandelt. Ähnlich kann HCl-Behandlung der Nachweis einiger Antigene eindringen und daher dessen Einfluss auf einzelne Antikörperleistung getestet werden muss. Sobald die Fluorochrom konjugierte Sekundärantikörper angewendet wurden Schutz Abschnitten von Licht.
CldU und IdU kann mit Hilfe von zwei verschiedenen BrdU-Antikörper, die eine Kreuzreaktion sichtbar gemacht werden, entweder mit CldU (Ratte α-BrdU) oder IdU (Maus α-BrdU) 9,19. Wenn beide Thymidinanaloga wurden in ein Tier injiziert worden ist es unbedingt erforderlich, um die gereinigte Ratten α-BrdU-Antikörper verwenden, um CldU erkennen, weil der nicht gereinigten Antikörper kreuzreagiert zu IdU. Wie von Vega et al. 9 die CldU Signal für Immunfluoreszenz-co-Kennzeichnung verstärkt, um äquivalente Nachweis beider Thymidinanaloga erzielen. Daher kann anstelle einer Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörpers (α-) Abschnitt 3.2.4; Ratte) ein Fluorochrom konjugierten Streptavidin nach Inkubation in einem biotinylierten sekundären Antikörper (α-rat zugegeben. Um eine unerwünschte Antikörper Kreuzreaktionen sind Steuerabschnitte von Mäusen, die entweder IdU oder CldU erhalten auszuschließen sind (getrennt; siehe Abbildung 8). Um gleichwertige Erkennung von IdU und CldU Verwendung Abschnitte von Tieren, die gleichzeitig mit äquimolaren Mengen CldU und IdU injiziert wurden zu überprüfen (siehe Abbildung 4).
Für Typ 1 und Typ-2-Studie Vorläuferzellen bevorzugen wir die Nestin-GFP transgenen Mäusen 12 verwenden, wie Nestin Antikörper häufig nicht zufriedenstellenden Ergebnisse. Nestin-GFP-Mäuse haben den Vorteil, zuverlässig visualisieren Nestin-positiven Vorläuferzellen und deren morphologische Merkmale zu einem bestimmten Entwicklungsstadium. Das GFP-Signal benötigt, um durch indirekte Immunfluoreszenz mit einem α-GFP-Antikörper verstärkt wird. Der sekundäre Antikörper ist an einen fluorochr gekoppelt werdenome mit spektraler Eigenschaften ähnlich GFP. Bei Bedarf können Nestin-GFP-Mäuse zu anderen mutierten Mauslinien gekreuzt werden, um die Beteiligung bestimmter Gene in der Neurogenese zu untersuchen. Mittlerweile sind verbesserte Nestin Antikörper, die Label Zellkörper sowie Verfahren geliefert und kann als Alternative zu transgenen Ansatz verwendet werden (siehe Materialliste).
Es ist kritisch, mit der 24-Stunden-Fixierung genügen zu overfixation verhindern. Die chemischen Reaktionspartner von Formaldehyd im Gewebe sind in erster Linie Proteine und Formaldehyd erzeugt reaktive Hydroxymethylgruppen an ihren Seitenketten, die zu Vernetzung benachbarter Aminosäuren (durch die Bildung von Methylenbrücken). Dies kann Maskierung von Antigen-Epitopen und den Verlust der Immunreaktivität führen (siehe Bemerkungen zu spezifischen Antikörpern in der Materialliste). Um verlorene Immunreaktivität erholen, mehrere Epitopdemaskierung Methoden existieren, dass die Pause Formaldehyd-induzierten Proteinquervernetzungen durch exposure Hitze 20. In diesem Protokoll arbeitet das Citrat-Puffer-Methode besser als andere für den Nachweis von Neurogenese im postnatalen und adulten Hippocampus (Abschnitt 3.3). Beachten Sie, dass Scheiben von sehr jungen Tieren (<P21) kann sehr zerbrechlich oder verzerrt werden und müssen mit besonderer Vorsicht behandelt werden. Ferner kann Epitopdemaskierungslösung schädlich für einige Epitope und damit individuellen Antikörper getestet werden, ob sie für Mehrfachfärbung, die diese Vorbehandlung benötigt werden können.
Zusammenfassend ist dieses Protokoll eine Sammlung von Grundtechniken und ausgearbeitet, die die Analyse der Erwachsenenneurogenese zu erleichtern. Sie erlaubt insbesondere eine eindeutige Identifizierung aller Hippocampus-Vorläuferpopulationen zusammen mit einer Proliferation oder Geburt-Dating-Marker aus einem einzigen Abschnitt. Diese Techniken können auf eine beliebige Kombination von Antikörpern oder anderen Spezies geeignet ist, die Entwicklung und die Regulierung der hippocam studierenpal Vorläuferzellen als Reaktion auf bestimmte Reize und ihre Beteiligung an bestimmten Gehirnfunktionen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
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