Abstract
Neurogenesi adulta è altamente regolamentato, processo a più stadi, in cui nuovi neuroni sono generati da una cellula staminale neurale attivato via sempre più impegnati sottotipi progenitrici intermedi. Ciascuno di questi sottotipi esprime un insieme di marcatori molecolari specifici, nonché criteri morfologici specifici, possono essere utilizzati per la loro identificazione. In genere, vengono applicate le tecniche di immunofluorescenza coinvolge anticorpi specifici del sottotipo in combinazione con indicatori di proliferazione exo- o endogeni. Siamo qui descriviamo immunomarcatura metodi per il rilevamento e la quantificazione di tutte le fasi di adulti neurogenesi ippocampale. Questi comprendono l'applicazione di analoghi della timidina, perfusione transcardial, lavorazione dei tessuti, calore indotta recupero epitopi, ABC immunoistochimica, multiple immunofluorescenza indiretta, microscopia confocale e quantificazione delle cellule. Inoltre, vi presentiamo un protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo che elude problemi usually derivanti dalla necessità di utilizzare anticorpi primari sollevati nella stessa specie ospite. Esso permette una accurata identificazione di tutti i sottotipi progenitrici ippocampali insieme con un marcatore di proliferazione all'interno di una singola sezione. Queste tecniche sono un potente strumento per studiare la regolazione di diversi sottotipi progenitrici in parallelo, il loro coinvolgimento in patologie cerebrali e il loro ruolo nelle funzioni cerebrali specifiche.
Introduction
Due regioni cerebrali costitutivamente generare nuovi neuroni per tutta la vita, la zona subventricolare dei ventricoli laterali e la zona subgranulare (SGZ) del giro dentato dell'ippocampo (DG). I nuovi neuroni derivano da cellule progenitrici neurali e passare attraverso diverse fasi di sviluppo morfologico e fisiologico, prima di raggiungere la maturità 1,2. Da un glia-come radiale cellule staminali lentamente dividendo (tipo 1) fasi consecutive di transito amplificare cellule progenitrici intermedie sorgono. I sottotipi più indifferenziate (tipo 2a e 2b tipo) hanno una forma irregolare con brevi, processi tangenziali. Essi generano neuroblasti (tipo 3) che uscire gradualmente il ciclo cellulare di diventare neuroni immaturi (con dendriti estese verso lo strato molecolare) e, infine, integrare nella rete ippocampale granuli maturi. Per le loro caratteristiche fisiologiche particolari queste cellule forniscono il circuito con una maggiore plasticità 3 suggeting un ruolo unico in funzione ippocampale. In realtà, gli studi degli ultimi dieci anni hanno generato una sostanziale evidenza che neurogenesi adulta contribuisce alla memoria spaziale, la separazione del modello e comportamento emotivo 4,5.
Neurogenesi adulta può essere studiato con diversi approcci. Analoghi della timidina incorporano nel DNA durante la fase S del ciclo cellulare e permettono la nascita datazione, la quantificazione e il destino l'analisi delle cellule neonato 6-8. Applicazione sequenziale di diversi analoghi della timidina (ad esempio, CldU, EdU o IDU) può essere utilizzato per studiare il turnover cellulare o popolazioni di cellule nate in diversi momenti durante il corso di un esperimento 9. Un'alternativa, marcatore endogeno per la proliferazione cellulare è Ki67. È espressa nelle cellule in divisione durante tutte le fasi del ciclo cellulare (G1, S, G2, M), tranne la fase di riposo (G0) e l'inizio della G1 10,11. Per analizzare il fenotipo di popolazioni cellulari neonati nell'adulto dentate del giro diversi marcatori molecolari specifici stadio possono essere utilizzati come GFAP, nestina, DCX e NeuN 1,6. GFAP è un marker di astrociti maturi, ma si esprime anche in cellule gliali radiali come nel prosencefalo adulti. Nestin è un filamento intermedio specifico per le cellule gliali radiali-like e cellule progenitrici intermedi precoci. DCX è una proteina associata ai microtubuli espresso in progenitori intermedi, neuroblasti e neuroni immaturi. Sulla base del (co) espressione di questi tre marcatori e le caratteristiche morfologiche delle cellule marcate quattro sottotipi di cellule progenitrici distinti possono essere identificati: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), di tipo 2 bis (GFAP -, nestina + , DCX -), di tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) e di tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +) 1. Co-etichettatura dei DCX insieme NeuN, che si esprime nei neuroni postmitotiche, consente la differenziazione di immature (DCX +, NeuN +) e maturo (DCX -, NeuN +) neuroni granulari.
I marcatori di cui sopra sono spesso utilizzati per immunofluorescenza co-etichettatura e la successiva microscopia confocale per analizzare il numero e l'identità delle cellule neonate. Ciò richiede in genere anticorpi di diverse specie ospite per evitare indesiderate anticorpi cross-reattività. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi primari adatti per la ricerca neurogenesi sono sollevate nei conigli o topi (ad esempio, mouse α-BrdU, topo α-NeuN, coniglio α-Ki67, α-GFAP coniglio). Questo porta a gravi limitazioni nel numero e combinazione di antigeni che possono essere valutati in una singola fetta. Questo a sua volta non solo aumenta lo sforzo di colorazione, come più colorazioni devono essere eseguite, ma potrebbe anche compromettere l'affidabilità dei risultati. Inoltre, alcuni antigeni sono suscettibili di formalina epitopo mascheratura fissaggio indotta (ad esempio, Ki67, Nestina). Siamo qui descriviamo modifiche dai protocolli immunomarcatura singola e multipla classici (ad esempio, il recupero degli epitopi, multiple immunostaining sequenziale, uso di nestina-GFP topi transgenici 12) superare molti di questi problemi. In particolare, il protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo permette colorazione contro un massimo di quattro diversi antigeni anche se parte degli anticorpi è derivato dallo stesso host. Questo consente il rilevamento simultaneo di tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo cellule progenitrici tipo 3, nonché la loro attività proliferativa all'interno di una singola sezione.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali viventi sono state effettuate in conformità con la direttiva comunitaria 86/609 / CEE del Consiglio le linee guida sulla cura e l'uso di animali da laboratorio e approvato dal comitato etico locale (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Iniezione intraperitoneale della timidina Analoghi
- Pesare animali il giorno prima dell'iniezione. Calcolare la quantità di timidina analogico richiesto per tutte le iniezioni in programma il giorno successivo, così come i singoli volumi di iniezione ponderati di un / ml di soluzione di 10 mg.
- Preparare timidina soluzione madre di 10 mg / ml. (ATTENZIONE! Analoghi della timidina sono tossici. Seguire le specifiche schede di sicurezza (MSDS) fornite dai fornitori, vale a dire, indossare camice e guanti, usare una cappa).
- Prendere timidina analogico dal freezer e portarlo a RT, circa. 21 ° C. Pesare 10 mg e aggiungeresalina sterile (per BrdU e CldU) o 0,04 N NaOH (in soluzione salina sterile, per IDU), vortice. Posizionare per almeno 10 - 15 minuti in un bagno d'acqua a 50 ° C e agitare ogni 2 - 3 minuti per sciogliere la polvere.
NOTA: utilizzare soluzioni per un massimo di 24 ore se conservato a temperatura ambiente e per diverse settimane a -20 ° C. Proteggere le soluzioni dalla luce (coprire con un foglio di alluminio). Controllare sempre per precipitati e ri-sciogliere, se necessario.
- Prendere timidina analogico dal freezer e portarlo a RT, circa. 21 ° C. Pesare 10 mg e aggiungeresalina sterile (per BrdU e CldU) o 0,04 N NaOH (in soluzione salina sterile, per IDU), vortice. Posizionare per almeno 10 - 15 minuti in un bagno d'acqua a 50 ° C e agitare ogni 2 - 3 minuti per sciogliere la polvere.
- Trattenere il mouse per la collottola e intraperitoneale iniettare una, adattata al peso appropriato volume di soluzione di riserva (a temperatura ambiente) con una siringa di dosaggio fine con un G 30 ago.
NOTA: In caso CldU e Idu devono essere somministrati sequenzialmente all'interno dello stesso animale, ritengono iniettare concentrazioni equimolari (ad esempio, 42,5 mg / kg CldU e 57,5 mg / kg IdU, che corrispondono a 50 mg / kg BrdU). Pertanto, regolare i volumi di iniezione delle soluzioni 10 mg / ml di archivi conseguenza.
2. Preparazione del tessuto
- Prepare 4% di formaldeide in tampone fosfato 0,1 M pH 7,4, il giorno prima della perfusione. Conservare a 4 ° C.
- Transcardially perfusione topi profondamente anestetizzati (3,5% isoflurano) attraverso il ventricolo sinistro con 10 ml PBS freddo, poi con 40 ml ghiacciata formaldeide (portata 5 ml / min). Sezionare il cervello e post-fix nello stesso fissativo per 24 ore a 4 ° C.
- Trasferire il cervello consecutivamente in 10% (24 ore a 4 ° C) e del 30% di saccarosio (fino lavandini cerebrali, ca. 48 ore). Per il congelamento, lentamente immergere il cervello crioprotetti in -25 ° C fino a quando non isopentano bolle emergono dal tessuto. Conservare a -80 ° C.
- Tagliare sezioni coronali di 40 micron di spessore su un microtomo congelatore (temperatura del blocco a -25 a -16 ° C). Trasferimento sequenziale sezioni in soluzione antigelo contenente pozzetti di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti (vedi figura 1). Conservare a -20 ° C.
Figura 1. Schema di trasferire fette microtomo in un 24-pozzetti. Inizia a A1 e mettere le fette successive in riga A, dopo A6 passare alla riga successiva B e così via. Al raggiungimento D6, tornare a A1 e continuare. Questa disposizione consente di fette per la quantificazione di ogni n ° sezione di un intero cervello. Per la quantificazione delle cellule neonate prendere ogni 6 th sezione cervello (equivalente al contenuto di una colonna), per immunofluorescenza fenotipizzazione prendere ogni sezione 12 th (equivalente al contenuto di 2 righe alternate di una colonna).
3. Immunostaining
NOTA: Le sezioni sono lavorate senza flottante, di solito in 6 pozzetti dotati di una piastra di supporto e inserti in mesh. In via eccezionale, il blocco, incubazioni anticorpi e reazioni ABC sono fatto in 12 o 24 e piastre senza inserti in rete (da 0,5 a 1 ml per well è sufficiente, a seconda del numero di fette che devono essere tinto). Durante queste fasi, di trasferire le sezioni con l'aiuto di un pennello sottile (risciacquare con ogni nuova soluzione). Tutte le incubazioni sono fatti con agitazione continua (max 150 rpm).
- Immunoistochimica (metodo ABC)
- Trasferire le sezioni di antigelo in TBS e risciacquare abbondantemente (una volta O / N a 4 ° C, 5 volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno) per rimuovere completamente l'antigelo.
- Incubare per 30 min a 1,5% H 2 O 2 in TBS-T per placare la perossidasi endogena. Prestare attenzione alla frizzante e ri-immergere le sezioni, se necessario. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
- Optional: Nel frattempo preriscaldare un armadio di riscaldamento e 2 N HCl a 37 ° C. Incubare sezioni per 30 min a 37 ° C in 2 N HCl per denaturare il DNA. Delicatamente sezioni separate con l'aiuto di una spazzola.
- Optional: Neutralizzare le sezioni per 10 min a 0,1 M borato a pH8.5, RT. Durante il trasferimento, brevemente tamponare gli inserti in mesh che contengono sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere avanzi HCl. Lavare 2 volte in TBS per 15 min ciascuno.
- Incubare in TBSplus per permeabilize il tessuto e per bloccare legame anticorpo siti non specifici, 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare in anticorpo primario diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
- Incubare in biotinilato anticorpo secondario diluito in TBSplus, 3 ore a temperatura ambiente. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. Nel frattempo ...
- Preparare complesso ABC secondo il protocollo del produttore (1% A + 1% B in TBS-T). Lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. Incubare sezioni AB reagente per 1 ora a RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
- Preparare 50 ml di 0,5 mg / ml DAB in TBS-T per 6 o 12 pozzetti, diviso in due metà e pipette 4 ml o 2 ml per pozzetto rispettivamente. Trasferimento sezioni in DAB soluzione (ATTENZIONE! DAB è tossico. Seguire la specific MSDS fornite dal fornitore, vale a dire, indossare camice e guanti, utilizzano una cappa).
- Aggiungere 0,5 ml di 1% H 2 O 2 al restante soluzione DAB 25 ml, mescolare e volumi pipetta equivalenti come sopra ad ogni pozzetto per iniziare la reazione perossidasi. Incubare per 12 min. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
- Montare le sezioni per diapositive in gelatina, aria secca O / N. Coverslip con mezzo di montaggio permanente.
- Optional: Controcolorare prima di mettere il vetrino (vedi paragrafo 3.5).
NOTA: Se il rapporto segnale-rumore è basso a causa di alta sfondo, ripetere il trattamento H 2 O 2 dopo l'incubazione con il reagente AB (passo 3.1.8).
- Multiple-immunofluorescenza
- Singolo o simultanea immunofluorescenza multipla
- Trasferire le sezioni di antigelo in TBS e risciacquare abbondantemente (una volta O / N a 4 ° C, 5 volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno) per rimuovere completamente unnel sistema di raffreddamento.
- Optional: come passi 3.1.3 - 3.1.4.
- Incubare in TBSplus per permeabilize il tessuto e bloccare vincolante anticorpi siti non specifici, 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare in cocktail anticorpo primario (ad esempio, ratto α-BrdU, cavia α-DCX, α-GFP capra) diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
- Incubare in cocktail di anticorpi secondari coniugati a fluorocromi (ad esempio, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cavia, Alexa-488 α-capra, tutti derivati in asino) diluito in TBSplus, 3 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. D'ora in poi proteggere sezioni dalla luce. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno.
- Montare le sezioni per diapositive in gelatina, aria secca O / N. Coverslip con mezzo di montaggio acquoso.
- Sequenziale immunofluorescenza multipla con anticorpi primari di una stessa specie ospiti
- Come passi 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- Incubare in fiprimo anticorpo primario (ad esempio, α-antigene coniglio A), O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
- Incubare in prima anticorpi coniugati a fluorocromi secondaria (ad esempio, Rhodamine Red-cong. Asino α-coniglio), 3 hr RT. D'ora in poi proteggere sezioni dalla luce. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
- Incubare in 10% di siero normale dalla stesso host gli anticorpi primari (ad esempio siero, coniglio) per 3 ore RT per saturare paratopes aperte sul primo anticorpo secondario. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
- Incubare in TBSplus con 50 mg / ml monovalenti non coniugata Fab frammenti diretti contro l'ospite degli anticorpi primari (ad esempio, IgG α-rabbit (H + L)) per coprire epitopi che potrebbero essere riconosciuti dal secondo anticorpo secondario, O / N a 4 ° C.
- Lavare almeno 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. Durante il trasferimento, brevemente swab agli inserti in mesh che contengono sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere eventuali avanzi Fab.
- Incubare in secondo anticorpo primario (ad esempio, coniglio α-antigene B), O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
- Incubare in secondo anticorpi coniugati a fluorocromi secondaria (ad esempio, Alexa-488-cong. Asino α-coniglio), 3 hr RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra.
NOTA: Per etichettare antigeni con anticorpi da diverse specie ospite aggiungerli al punto 3.2.2.2 e rispettivi anticorpi secondari al punto 3.2.2.3.
- Uno degli anticorpi secondari da specie come uno degli anticorpi primari
NOTA: Questo protocollo è adatto a quadrupla-colorazione contro BrdU o Ki67 insieme GFAP, nestina-GFP e DCX.- Seguire rigorosamente protocollo passi 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Fino a questo punto usare solo siero asino in TBSplus.
- Incubare in TBSplus contenente siero di capra 3% per 1 ora a RT. Questo copre paratopes aperte sul anticorpo secondario α-caprino. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
- Incubare in AMCA-cong. capra α-coniglio diluito in TBSplus, 3 hr RT o O / N 4 ° C. Risciacquare tre volte in TBS per 15 min ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra.
- CldU, Idu co-colorazione
- Sciacquare, denaturare e neutralizzare le sezioni come descritto nella sezione 3.2.1 (punti 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- Incubare con 20 mg / ml non coniugati frammenti Fab α-topo IgG (H + L) in TBSplus, 1 ora a temperatura ambiente. Lavare 4 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuno.
- Incubare in cocktail anticorpo primario contenente ratto α-BrdU (1: 400; purificato IgG2) e α-BrdU del mouse (1: 350) diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
- Incubare in cocktail anticorpo secondario contenente asino biotinilate α-rat (1: 500) e FITC-conj. asino α-topo frammenti Fab (1: 100). Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
- Incubare in Rhodamine Red-cong. Streptavidin, 2 ore a RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra.
- L'amplificazione del segnale di fluorescenza nei topi nestina-GFP
- Aggiungi capra α-GFP per il cocktail anticorpo primario.
- Aggiungi un anticorpo secondario coniugato con fluorocromo proprietà spettrali simili a GFP (come Alexa 488 cong. Asino α-capra) per il cocktail anticorpo secondario.
- Singolo o simultanea immunofluorescenza multipla
- Recupero Epitope
- Effettuare smascheramento dopo risciacquo antigelo. Piroscafo Preriscaldare con 6 o 12 e piastre contenenti 0,1 M citrato a pH 6,0-95 - 99 ° C (circa 25 min).
- Trasferire le sezioni nel tampone citrato calda e vapore per 30 minuti (coprire i piatti con un foglio di alluminio come plastica lID non sono resistenti al calore).
- Posizionare immediatamente le piastre in un bagno di ghiaccio per raffreddare. Questo aiuta a proteggere morfologia tissutale, che è di particolare importanza quando si lavora con sezioni di cervello di animali postnatale.
- Lavare 3 volte in TBS per 10 minuti ciascuno per sciacquare e neutralizzare il citrato e continuare colorazione.
- Mouse anticorpi sul tessuto del mouse
- Aggiungere 20 mg / ml monovalenti frammenti Fab α-topo IgG (H + L; stessa specie ospiti di anticorpo secondario) per la prima fase di blocco (ad esempio, step 3.1.5 o 3.2.1.3).
- Lavare 4 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuno, e procedere con rispettivo protocollo.
- Violetto cresolo di contrasto
- Soluzione Preriscaldare violetto cresolo a 60 ° C (in vaso di vetro). Incubare i vetrini nella soluzione calda per 3 minuti.
- Sciacquare in aq. dest. e disidratare 2 volte per 1 min ogni a 70%, 96% e 100% di isopropanolo. Chiaro per 5-6 min in xilene o sostituto xilene e coprioggetto con un mezzo di montaggio permanente compatibile.
Analisi 4. Dati
- Contare le cellule neonate perossidasi colorate in ogni 6 ° sezione lungo l'intera estensione rostrocaudale del giro dentato. Utilizzare un microscopio ottico con ingrandimento 400X.
- Moltiplicare i numeri di cellule risultanti con l'intervallo di intersezione per ottenere una stima del numero totale di cellule neonato.
- Immagine la fluorescenza etichettato sezioni con un microscopio laser confocale laser dotato di adeguati e sistemi di filtraggio. Prendere pile di immagini in posizioni casuali lungo l'intera estensione del giro dentato a 400X ingrandimenti e analizzare almeno 50 celle selezionate a caso di interesse per emisfero per co-marcatura con altri marcatori.
- Moltiplicare le percentuali risultanti di cellule co-marcati (% / 100), con il numero totale di cellule neonate per calcolare assolutanumero di specifiche popolazioni cellulari neonati.
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Representative Results
Abbiamo applicato i metodi sopra descritti per quantificare e caratterizzare cellule neonate nei postnatale e adulta ippocampo. Pertanto, abbiamo utilizzato di tipo selvatico e neurogenesi-carente ciclina D2 knock out (KO) CCND2 topi alloggiati in condizioni note per influenzare il tasso di neurogenesi (cioè, ambiente arricchito, EE) 13,14. La colorazione immunoistochimica DAB contro uno Ki67, BrdU, CldU o Idu costantemente rivelato differenze di numero di cellule neonati tra tipo selvatico e CCND2 KO topi (Figura 3) 15. Inoltre, con successive iniezioni equimolari di CldU e Idu siamo stati in grado di discriminare popolazioni cellulari nati durante specifici periodi di EE (Figura 3C, D). Sezione 3.2.4 Adottando abbiamo rilevato con successo intensità di segnale uguali e ottima sovrapposizione di CldU e Idu dopo la loro consegna simultanea (Figura 4). BrdU etichettati cellule neonate potrebbero essere phenotyped con stanMetodo Dard immunofluorescenza da una applicazione contemporaneamente BrdU e NeuN, (Figura 5) o BrdU, GFAP, nestina-GFP e anticorpi DCX (Figura 6B). Questa tecnica ha permesso di successo tipo di identificazione 1, 2a, 2b e 3 cellule progenitrici all'interno di un unico esemplare (Figura 6B, D). Co-etichettatura dei Ki67 con marcatori progenitrici richiesto l'applicazione sequenziale di anticorpi come anticorpi primari contro Ki67 e GFAP sono state sollevate nell'ambito di coniglio (si applica la sezione 3.2.2), inoltre una delle anticorpi primari (capra α-GFP) è stato prodotto nella stesso host uno degli anticorpi secondari (AMCA conj. capra α-coniglio). Una combinazione di sezioni 3.2.2 e 3.2.3 ha funzionato perfettamente, se le sezioni sono state incubate prima in Ki67 con anticorpi nestin-GFP, e in secondo luogo in anticorpi GFAP ma non viceversa (Figura 6C). Figura 2B riassume gli schemi applicativi approvati.
Figura 2. sequenziale immunofluorescenza multipla con anticorpi primarie derivate dalla stessa specie ospite. (A) Rappresentazione schematica. (B) le combinazioni di successo di anticorpi e il loro ordine cronologico di immunofluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. immagini microscopia ottica di ABC-immunoistochimica per la quantificazione delle cellule neonate nel giro dentato. Raffigurate sono confronti tra diversi marcatori di proliferazione in WT e neurogenesi topi con deficit CCND2 KO a 100X e 400X ingrandimento. (A) g> Ki67-DAB colorazione mostra gruppi di cellule proliferanti nella zona subgranulare del giro dentato (giorno postnatale 35). Il numero di cellule proliferanti è diminuita nei topi CCND2 KO rispetto ai topi WT. (B), le cellule Newborn a 28 giorni dopo la BrdU somministrazione (schema di iniezione sopra immagini) confermando il tasso di proliferazione ridotta nei topi CCND2 KO. (C) CldU somministrazione durante la 6a settimana di EE (regime di iniezione sopra di immagine) rivelato un aumento del numero di cellule appena nati il giro dentato WT ma non CCND2 topi KO. (D) IdU somministrazione durante la 8a settimana di EE mostrato risultati simili. Bar Scala rappresenta 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. immunofluorescenza co-colorazione di CldU e Idu dopo la consegna simultanea di concentrazioni equimolari. Amplificazione del segnale delle cellule CldU etichettati comportato un eccellente sovrapposizione di CldU e Idu. Bar Scala rappresenta 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. immunofluorescenza co-etichettatura dei NeuN e BrdU. (A) è stato somministrato BrdU 6 volte ogni 8 ore per 2 giorni consecutivi a partire dal giorno postnatale 14. Gli animali sono stati sacrificati 28 giorni. (B) Immunofluorescenza co-etichettatura delle cellule proliferanti con il marcatore neuronale maturo NeuN mostra un numero ridotto di proliferanti cellule CCND2 KO rispetto a WT animali. Bar Scala rappresenta 50 micron. (C) Visualizzazione ingrandita della (B) che mostra le cellule co-marcato in entrambi i genotipi. Bar Scala rappresenta 20 micron. (D) Alto ingrandimento esempio di un / NeuN cellulare co-marcato BrdU nel giro dentato. Bar Scala rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. immunofluorescenza Quadrupla co-etichettatura dei diversi marcatori di proliferazione con GFAP, nestina-GFP e DCX per fenotipo granuli neonati nel giro dentato di topi nestina-GFP. (A) BrdU è stato somministrato 3 volte ogni 2 ore a giorno postnatale 70 . Gli animali sono stati sacrificati due ore più tardi. (B) immagine Rappresentante di una co-colorazione per BrdU, GFAP,nestina-GFP e DCX. (C) immagine Rappresentante di immunofluorescenza quadruple per Ki67, GFAP, nestina-GFP e DCX. (D) Classificazione di tipi di cellule progenitrici in base alla loro etichettatura immunofluorescenza. Sulla base della co-espressione di diversi marcatori e le caratteristiche morfologiche delle cellule marcate quattro sottotipi di cellule progenitrici distinti possono essere identificati: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestina +, DCX - ), tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) e di tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +). Bar Scala rappresenta 20 micron. (E) Schema delle diverse fasi di adulti neurogenesi ippocampale. Essa illustra le tipologie 4 progenitrici di cellule, i neuroni immaturi e cellule granulari mature, la loro caratteristica espressione di marcatori e la loro capacità proliferativa. ML - strato di cellule molecolari, GCL -strato di cellule granulari, SGL -. strato di cellule subgranulare Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Esempio di colorazioni sequenziali di successo e non di successo con due anticorpi primari sollevate nella stessa specie, a seconda della sequenza di anticorpi incubazione. Il microscopio confocale mostrano il risultato di una co-colorazione sequenziale contro Ki67 e GFAP con anticorpi primari sia derivato da coniglio. In (A) immunoistochimica è stato completato per GFAP seguita da colorazione contro Ki67 che ha portato ad una sovrapposizione pronunciato dei due segnali. In particolare, il segnale Ki67 era atipica e assomigliava il segnale della colorazione GFAP. (B) mostra i risultati della retromarciaSequenza colorazione con la colorazione Ki67 completato prima e successiva colorazione contro GFAP. Qui, i segnali per entrambi gli antigeni somigliavano pattern di espressione atteso: Il segnale Ki67 era limitata a nuclei all'interno della zona subgranulare mentre il segnale GFAP stato trovato cytoplasmatically, soprattutto nei processi cellulari derivanti dalla zona subgranulare. Bar Scala rappresenta 20 micron. RHX - Rhodamine X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. specificità degli anticorpi α-BrdU utilizzati per rilevare CldU e Idu. I topi sono stati iniettati sia con CldU o con Idu (applicazione non simultanea). In (A) sezioni di cervello di CldU (A1) o Idu (A2) iniettato topi erano Immunostained utilizzando l'anticorpo purificato ratto α-BrdU che dovrebbe specificamente cross-reagire CldU, ma non IdU. (B) mostra i risultati di colorazione cervelli CldU (B1) o IdU (B2) iniettato topi con il mouse α-BrdU anticorpi che si prevede di cross-reagiscono con Idu, ma non CldU. Bar Scala rappresenta 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Quantificazione e identificazione di sottopopolazioni di cellule neonato è un tema centrale nella ricerca neurogenesi adulta. Combinando i marcatori di proliferazione e di anticorpi contro le proteine espresse durante le fasi specifiche di neurogenesi adulta permette la rilevazione immunoistochimica di queste sottopopolazioni. Alcuni degli anticorpi o combinazioni di anticorpi richiedono condizioni di colorazione specifiche.
Etichettatura di divisione delle cellule con analoghi della timidina sintetici è ancora il gold standard per lo studio degli adulti neurogenesi ippocampale. E 'fondamentale considerare il protocollo di iniezione appropriata prima dell'inizio dell'esperimento. Noi di solito somministriamo 50 mg / kg (peso corporeo, ip) BrdU, ma le concentrazioni può variare a seconda delle esigenze sperimentali (fino a 300 mg / kg per un bolo) 8,16. Se Idu e CldU devono essere iniettati in sequenza per la discriminazione temporale delle popolazioni cellulari è obbligatorio iniettare concentrazioni equimolari (
Per immunostaining, le sezioni sono generalmente trattati libera fluttuazione, di solito in 6 pozzetti dotati di piastra di supporto e di inserti in mesh che semplifica il trasferimento da una soluzione ad un altro. In via eccezionale, il blocco, incubazioni anticorpi e reazioni ABC sono fattoin 12 o 24 pozzetti piastre senza inserti in rete per economizzare soluzioni costose (0,5 a 1 ml per pozzetto è sufficiente, a seconda del numero di fette che devono essere tinto). Durante queste fasi, di trasferire le sezioni con l'aiuto di un pennello che deve essere risciacquato quando si cambia soluzioni. Prevenire le sezioni da essiccazione-out ed eseguire incubazione che prendono> 1 ora in una camera umificata. Tutte le incubazioni devono essere fatte con continuo mescolamento (max 150 rpm). Provare sempre e titolare ciascun nuovo lotto di anticorpi. Più lunghi tempi di incubazione anticorpo (fino a 2 giorni a 4 ° C) può migliorare la colorazione. Nel caso in cui solo gli anticorpi del mouse sono disponibili contro gli antigeni che si desidera visualizzare in tessuti del mouse è consigliabile bloccare immunoglobuline endogene con monovalenti altamente concentrato Fab frammenti α-mouse (punto 3.4). Ogni volta che con questa tecnica di estendere le seguenti operazioni di risciacquo. In caso contrario, non legati frammenti Fab potrebbero legarsi al anticorpo primario del mouse. HCl pretrattamento e boratoneutralizzazione sono necessarie solo per il rilevamento di analoghi della timidina. Risultato La reazione perossidasi 12 min in un rapporto ottimale segnale-rumore con le condizioni e anticorpi applicate nel nostro protocollo. Come con qualsiasi reazione enzimatica, la velocità della reazione perossidasi dipende da molti fattori (ad esempio, temperatura, pH, la concentrazione di enzima e substrato). Di conseguenza, i tempi di reazione devono essere ottimizzate per ogni nuovo set di anticorpi. Per visualizzare le strutture anatomiche in macchie DAB con sfondo molto debole (ad esempio, CldU), fette possono essere contrastate. Il metodo violetto cresolo descritto nel capitolo 3.5 risultati in una molto debole di contrasto che non compromette il segnale specifico DAB.
Per immunofluorescenza multiple, utilizzare gli anticorpi primari che vengono sollevate in diverse specie o di differenti isotipi e seguire la sezione 3.2.1. In caso contrario, eseguire una immunomarcatura sequenziale multiplo che è stato ottimizzato per rilevare anticorpi primari piùdalla stessa specie ospite (ad esempio, mouse o di coniglio, sezione 3.2.2). Il principio di base di questo metodo è stato inventato da Ferguson e colleghi che con successo macchiato diversi marcatori muscolari con due topo anticorpi primari 17. I frammenti Fab utilizzate per bloccare in fase 3.2.2.5 dovrebbero essere ricavati dalle stesse specie ospite come gli anticorpi secondari. Le concentrazioni e tempi di incubazione di cui alla sezione 3.2.2 sono ottimizzati per gli anticorpi specifici qui descritti e devono essere rettificato per qualsiasi combinazione nuovo anticorpo. Si noti che la sequenza di incubazione anticorpo primario può influenzare fortemente il risultato (come indicato in Figura 7A). Laddove applicabile, gli antigeni rilevati dai anticorpi primari che derivano dalla stessa specie dovrebbero mostrare un modello di espressione diversa che semplifica il rilevamento di blocco insufficiente. Per eliminare ogni possibilità di anticorpi cross-reazione o falsi-positivi è Essenziale di includere controlli appropriati (cioè i controlli solo-secondari di anticorpi; immunoistochimica completo per il primo antigene seguita da incubazione con secondo anticorpo primario o seconda solo anticorpo secondario). 18 Figura 2B mostra le combinazioni di anticorpi che hanno funzionato bene nelle nostre mani. Per immunofluorescenza multipla è anche consigliabile utilizzare anticorpi secondari che vengono sollevate nella stessa specie (ad esempio, asino) e hanno il minimo cross-reattività per il tessuto e siero proteine da altre specie (ad esempio, pre-adsorbito). In caso contrario, al punto 3.2.3 può aiutare a prevenire eventuali interspecie inattesi cross-reattività. Selezionare fluorocromi con il minimo spettrale sovrapposizione appropriata al sistema di rilevamento (ad esempio, AMCA, Alexa Fluor 488, Rodamina Rosso, Alexa Fluor 647). Se è necessario un contrasto nucleare, aggiungere DAPI o Hoechst 33342 (10 mg / ml) per il cocktail anticorpo secondario (quindi, nessun vicino UV anticorpo secondario può essere noindr). Questi controcolorazioni nucleari non funzionano se il tessuto è stato pre-trattato con HCl. Analogamente, il trattamento HCl può compromettere la rilevazione di alcuni antigeni e quindi la sua influenza sulle prestazioni anticorpi individuali deve essere testato. Una volta che gli anticorpi secondari coniugati a fluorocromi sono state applicate sezioni riparo dalla luce.
CldU e Idu possono essere visualizzati con l'aiuto di due diversi anticorpi BrdU che cross-reagiscono sia con CldU (ratto α-BrdU) o Idu (il mouse α-BrdU) 9,19. Se entrambi analoghi della timidina sono state iniettate in un animale è assolutamente indispensabile utilizzare l'anticorpo purificato ratto α-BrdU per rilevare CldU perché l'anticorpo non depurati cross-reagisce Idu. Come descritto da Vega et al. 9 il segnale CldU bisogno di essere amplificato per immunofluorescenza co-etichettatura per realizzare il rilevamento equivalente di due analoghi della timidina. Pertanto, invece di un anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo (α-rat) un streptavidina coniugata fluorocromo è aggiunto dopo l'incubazione in un anticorpo secondario biotinilato (α-rat, la sezione 3.2.4). Per escludere qualsiasi anticorpo indesiderato reazioni incrociate includono sezioni di controllo di topi che hanno ricevuto sia Idu o CldU (a parte; vedere Figura 8). Per verificare il rilevamento equivalente di IDU e CldU uso sezioni da animali che sono stati iniettati contemporaneamente con quantità equimolari di CldU e Idu (vedere Figura 4).
Per studiare il tipo 1 e tipo 2 cellule progenitrici preferiamo usare nestina-GFP topi transgenici 12 come anticorpi nestina spesso non hanno fornito risultati soddisfacenti. Topo nestina-GFP hanno il vantaggio di visualizzare in modo affidabile cellule progenitrici nestina-positive e le loro caratteristiche morfologiche in una particolare fase di sviluppo. La GFP-segnale deve essere amplificato attraverso immunofluorescenza indiretta con un anticorpo α-GFP. L'anticorpo secondario deve essere accoppiato ad un fluorochrome con proprietà spettrali simili a GFP. Se necessario, i topi nestina-GFP possono essere incrociati ad altre linee mutanti di topo per studiare il coinvolgimento di particolari geni in neurogenesi. Ormai, anticorpi nestina migliorate sono forniti che corpi cellulari etichetta nonché processi e possono essere utilizzati come alternativa all'approccio transgenico (vedi lista materiali).
E 'fondamentale rispettare la fissazione 24 ore per evitare overfixation. I partner di reazione chimica di formaldeide nei tessuti sono principalmente proteine e formaldeide genera gruppi idrossimetil reattivi sulle catene laterali che portano alla reticolazione di aminoacidi adiacenti (dalla formazione di ponti metilenici). Ciò può causare mascheramento di antigene-epitopi e perdita di immunoreattività (vedi commenti anticorpi specifici nella lista dei materiali). Per recuperare perso immunoreattività, diversi metodi di recupero epitopi esistano pausa proteine formaldeide indotta cross-legami tramite postaXposure al calore 20. In questo protocollo, il metodo tampone citrato funziona superiore agli altri per il rilevamento della neurogenesi nei postnatale e adulta ippocampo (punto 3.3). Si noti che le fette di animali molto giovani (<P21) possono diventare molto fragile o distorto e devono essere trattati con particolare cura. Inoltre, il recupero epitopo può essere dannosa per alcuni epitopi e quindi anticorpi individuali devono essere testati se sono adatti per la colorazione multipli che richiede questo pre-trattamento.
In sintesi, questo protocollo è un insieme di tecniche di base ed elaborati che facilitano l'analisi degli adulti neurogenesi ippocampale. E soprattutto consente l'identificazione univoca di tutte le sottopopolazioni progenitrici dell'ippocampo con una proliferazione o nascita risalente marcatore da una singola sezione. Queste tecniche possono essere adattati a qualsiasi combinazione di anticorpi o altre specie di studiare lo sviluppo e la regolazione di dell'ippocampocellule progenitrici pal in risposta a stimoli specifici e il loro coinvolgimento in particolari funzioni cerebrali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
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