Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Busulfan som myelosuppressive Agent til at generere stabilt højt niveau knoglemarv Kimærisme i mus

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52553

Protocol

BEMÆRK: Etik Erklæring: Denne protokol er blevet revideret og godkendt af Animal Care udvalg af Simon Fraser University (UACC; tillader numre 1037K-12 og 1060K-03), og er i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care, NIH Guide for Pasning og anvendelse af forsøgsdyr, og EØF Rådets direktiv.

1. Særlige overvejelser

BEMÆRK: Busulfan er cytotoksisk. Håndtag og bortskaffes i overensstemmelse med den sikkerhedsdatablad og institutionelle retningslinier.

  1. Udfør alle teknikker aseptisk i en laminar strømning hætte.
  2. Steriliser instrumenter inden brug ved indpakning i en passende emballage, såsom en peel pakke, og autoklavering.
  3. Selvom risikoen for infektion er lavere med busulfan conditioning forhold til bestråling, håndtag kun dyr i en laminar strømningshætte for de første 2 uger efter transplantation.

2. Konditionering afRecipientmus

  1. Fortynd busulfan til 3 mg / ml med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at foretage en ny fortynding af busulfan lige før brug hver dag i injektion.
  2. Administrer 20 mg / kg af fortyndet busulfan til recipientmus via IP injektion dagligt.
  3. Gentag dagligt IP injektioner på 20 mg / kg busulfan indtil en total dosis på 60-100 mg / kg er blevet leveret (dvs. for en 80 mg / kg total dosis administrere 20 mg / kg af busulfan i 4 på hinanden følgende dage).

3. Isolering af donorknoglemarv Cells

BEMÆRK: Denne protokol er med succes blevet brugt til at isolere og forberede BM-celler fra op til 5 donormus. Typisk celle udbytte pr mus er ca. 30 til 40.000.000 BMDCs, hvilket er tilstrækkeligt til at transplantere 12-16 recipientmus. Hvis der er behov flere donormus protokollen skal måske justeres.

  1. Efter den sidste dag i busulfan conditioning euthanize et GFP donor mus (en til seks måneder gamle) ved hjælp af CO 2 (eller af andre dødshjælp procedure accepteres på institution). For at undgå graft komplikationer bruger syngene donorer, der er samme køn som modtagerne.
  2. Spray mus med 70% ethanol. Lift huden på maven og anvendelse af kirurgiske sakse lave et snit gennem huden fra bughulen op benet mod anklen. Hold foden, trække fast huden fra anklen mod hoften udsætte benet væv.
  3. Trim væk muskel og fedtvæv fra lårbenet at blotlægge hofteleddet.
  4. Mens forsigtigt at trække på foden til at forlænge benet trykke saksen mod hofteleddet. Skær lige over hovedet på lårbenet pas på ikke at skære lårbenet selv.
  5. At hjælpe med at opretholde sterilitet, holde benet ved foden og rengør eventuelt resterende væv fra knoglerne ved at gnide knogleoverfladen med autoklaveres væv.
  6. Adskil lårben og skinneben ved at skære gennem knæleddet, ogplacere lårbenet i en kultur skål indeholdende sterilt PBS. Inkuber på is.
  7. Fjern og kassér fibula ved at skære på de punkter, hvor fibula opretter forbindelse til skinnebenet. Placer skinnebenet i dyrkningsskålen med lårbenet og inkuber på is.
  8. Gentag trin 3,2-3,7 for det andet ben, og om nødvendigt yderligere donormus. Efter fjernelse af knoglerne, sterilisere kirurgiske redskaber med et varmt perle sterilisator eller bruge et nyt sæt sterile værktøjer til de efterfølgende trin.
  9. For endnu har lårben, holde lårbenet med pincet og bruge kirurgisk saks omhyggeligt "barbering" distale ender uden ben. Fjern så lidt af knoglen som nødvendigt for at eksponere BM hulrum.
  10. Fyld en sprøjte med 3 ml sterilt PBS og vedhæfte en 23 G nål. Bar forsigtigt kanylen i BM hulrum og skyl BM i en steril kultur skål. Vær sikker på at skrabe benpiben med nålespidsen at sikre fjernelse af alle ønskede celler. Efter ekstraktionsikre, at den røde BM ikke længere er synlig, og knoglen synes nu hvide.
  11. Gentag trin 3,9-3,10 for efterfølgende lårben, samle alle de BM i den samme kultur parabol.
  12. For skinnebenene, holde skinnebenet med pincet og omhyggeligt "barbering" den ende, hvor skinnebenet var knyttet til knæet for at blotlægge BM hulrum. Lav en anden snit langs knoglen hvor den synlige røde BM slutter.
  13. Fyld en sprøjte med 3 ml sterilt PBS og vedhæfte en 25 G nål. Sæt forsigtigt kanylen i BM hulrum (fra slutningen, der var knyttet til knæet) og skyl BM ind i kulturen skål indeholdende BM fra lårben. Skrab siderne af BM hulrum med nålen for at fjerne alle celler. Efter ekstraktion sikre, at den røde BM ikke længere er synlig, og knoglen synes nu hvide.
  14. Gentag trin 3,12-3,13 til efterfølgende skinneben, samle alle BM i den samme kultur skålen.
  15. Forsigtigt udriv BM med en 1 ml pipettespids at dissociere calen.
  16. Pass cellesuspensionen gennem en 40 uM kurv filter over i en steril 50 ml centrifugerør. Skyl fad med PBS for at få de resterende celler, og overføre denne gennem filteret ind i centrifugerør.
  17. Centrifuger i 5 minutter ved 450 xg ved 4 ° C. Fjern og kassér supernatanten.
  18. Resuspender pellet i 3 ml erythrocyt lyseringsbuffer. Inkuber på is i 8,5 min.
  19. Tilføj ~ 30 ml sterilt PBS for at standse lyserende puffer.
  20. Centrifuger i 5 minutter ved 450 xg ved 4 ° C. Fjern og kassér supernatanten.
  21. Re-suspendere pellet i 1 ml sterilt PBS. Hold på is.
  22. Tag en lille portion af cellehomogenatet og fortyndes med PBS (1: 100 til 1 mus, 1: 200 for 2 mus, etc.) for at kvantificere antallet af celler under anvendelse af et hæmocytometer.
  23. Cellesuspensionen til 8 x 10 6 celler / ml fortyndes og inkuberes på is indtil injektion.

4. knoglemarvstransplantation

  1. Fill en 0,5 ml sprøjte (med en 28 G nål insulin) med 300 pi fortyndet cellesuspension for hver mus, der skal injiceres. Sørg for at fjerne eventuelle luftbobler til stede i sprøjten.
  2. Placer musebur indeholdende de konditionerede recipientmus på en varmepude og tillade halevenerne til at spile.
  3. Tag en modtager mus og sted i fastholdelsesanordningen. Tør halen med kirurgisk gaze vædet med 70% ethanol.
  4. Hold fast i halen og med facet op, forsigtigt indsætte nålen i en af ​​de laterale halevenerne og sprøjt celle suspension.
  5. Hold kirurgisk gaze på injektionsstedet, indtil blødningen stopper, før at indføre musen ind i en ny ren bur.

5. en vurdering af omfanget af BM Kimærisme

BEMÆRK: kimærisme niveauer er typisk variabel i perifert blod efter 1 uge post-BMT, og som sådan kimærisme niveauer normalt skønnes mindst 2 uger post-BMT. Niveauer af Chimerism bør nå> 80% GFP + -celler i det perifere blod inden for 3-4 uger efter BMT.

  1. Forbered FACS buffer (2 mM EDTA + 2% føtalt bovint serum i PBS).
    BEMÆRK: FACS buffer kan opbevares ved 4 ° C i adskillige uger.
  2. Placer musen i en fastholdende rør og barbere pelsen på den bageste ben for at blotlægge den laterale saphenusvene.
  3. Tynde pels benet med vaseline og gennembore det saphenavene med en 25 G nål.
  4. Saml ca. 50 pi blod med en heparin overtrukket kapillarrør. Tilføj blodet til et mikro-centrifugerør indeholdende 1 ml FACS buffer. Bland røret ved inversion og opbevares på is.
  5. Hold kirurgisk gaze på injektionsstedet, indtil blødningen stopper før han vendte tilbage musen tilbage til buret.
  6. Centrifuger blodprøver i 5 minutter ved 900 x g. Fjern og kassér supernatanten.
  7. Resuspender pellet i 500 pi erythrocyt lyseringsbuffer. Inkuber på is i 8,5 min.
  8. Der tilsættes 1 ml FACS buffer for at standse lyserende puffer.
  9. Centrifugeres prøverne i 5 minutter ved 900 x g. Fjern og kassér supernatanten.
  10. Udføre en anden lysis trin i 500 pi erythrocyt lyseringsbuffer. Inkuber på is i 8,5 min.
  11. Der tilsættes 1 ml FACS buffer for at standse lyserende puffer.
  12. Centrifugeres prøverne i 5 minutter ved 900 x g. Fjern og kassér supernatanten. Kontroller, at pillen er nu hvid.
    BEMÆRK: Hvis pillen stadig vises rødt, kan et yderligere lysis trin være behov før man går videre til næste trin.
  13. Re-suspendere pellet i 1 ml FACS buffer. Centrifugeres prøverne i 5 minutter ved 900 x g. Fjern og kassér supernatanten.
  14. Resuspender pellet i 300 pi FACS buffer og kvantificere GFP + -celler ved hjælp af flowcytometri (BEMÆRK: På dette tidspunkt som helst ønsket immunfarvning af cellerne kan udføres ved anvendelse af standardteknikker inden flowcytometrisk analyse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Administrationen af ​​60-100 mg / kg af busulfan er generelt godt tolereret af mus. Men dyrene typisk tabe under konditionering fase (~ 5-10%) og dermed kosten kan være nødvendigt at supplere med behandler såsom bestrålede solsikkekerner at tilskynde spise. Niveauer af kimærisme på> 80% GFP + -celler i det perifere blod og BM bør konsekvent opnåeligt ved hjælp af 60-100 mg / kg busulfan 7. Vores laboratorium har med succes brugt denne protokol til at generere over 100 kimære mus med> 80% GFP + celler i det perifere blod og BM, og næsten alle vores BMTs lykkes, når du bruger syngene donorer og modtagere. Figur 1 viser niveauerne af kimærisme kvantificeret ugentligt i det perifere blod hos mus condition med 100 mg / kg busulfan modtager en vellykket syngene BMT (n = 3) og mus med aircondition, 80 mg / kg busulfan som modtager et mislykket allogen BMT (n = 3). Kimærisme niveauer> 80% er typically er oprettet ved 3-4 uger efter BMT. Figur 2 er repræsentative FACS data perifert blod viser en vellykket og mislykket BMT. Figur 3 viser, at dette kimærisme forbliver fastsat for mindst ét år i BM (n = 3), og at condition med køretøjet ikke er tilstrækkelig til at fremkalde BM kimærisme (n = 3). Der er ingen signifikante forskelle i niveauerne af BM kimærisme opnås ved anvendelse af doser på 60-100 mg / kg busulfan, GFP + celler ophobes i CNS i en dosisafhængig måde. Desuden er denne akkumulering forøges dramatisk i neurodegenerative lidelser, såsom ALS 7. Figur 4 illustrerer GFP + celleakkumulering i lænden af rygmarven i et vild-type (n> 20) og ALS musemodel (n> 20).

Figur 1
Figur 1. Recipientmus airconditionmed busulfan og transplanteres med GFP + knoglemarvsceller fra en syngene donor opnå en høj grad af vedvarende kimærisme i blodet. Ugentlige flowcytometriske data, der viser GFP + kimærisme i det perifere blod af held transplanterede mus konditioneret med 100 mg / kg busulfan efterfulgt af syngene knoglemarvstransplantation (sort) og held transplanterede mus condition med 80 mg / kg af busulfan efterfulgt af allogen knoglemarvstransplantation (grå). Resultaterne er midler fra n = 3 mus / gruppe, udgør fejlsøjler SEM.

Figur 2
Figur 2. Repræsentative flow-cytometriske data, der viser GFP + -celler i det perifere blod 3 uger efter knoglemarvstransplantation hos mus konditioneret med 100 mg / kg af busulfan. (A) Scatterplot viser gating strategi, (B) et mislykket allogenEIC knoglemarvstransplantation, og (C) en vellykket syngene knoglemarvstransplantation. Resultaterne er repræsentant fra n> 3 mus. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Repræsentative flow-cytometriske data, der viser GFP + celler i knoglemarven 1 år efter knoglemarvstransplantation. (A) Scatterplot viser gating strategi, (B) Køretøj konditioneret mus, og (C) 100 mg / kg busulfan konditioneret mus. Resultaterne er repræsentant fra n = 3 mus. Klik her for at se en større udgave af dette tal.


Figur 4. knoglemarvsafledte celler akkumuleres i CNS busulfan konditioneret mus givet en knoglemarvstransplantation. Immunhistokemisk analyse af sektioner af lænden af rygmarven isoleret fra (A, C) vildtypemus og (B, D) sent sygdom fase ALS mus. GFP + celler er vist i grøn. Resultaterne er repræsentative billeder fra n> 20 mus for hver model. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Busulfan konditionering muliggør generering af højt niveau BM kimærisme i mus med hæmatopoietiske celler, som er let påviselige. Denne konditionering kan udføres uden behov for bestrålingsanlæg. Desuden er myelosuppression med doser af busulfan er beskrevet i denne protokol veltolereret, minimere toksiske bivirkninger forårsaget af myeloablative doser af bestråling, og kan således være et mere egnet teknik til at generere BM kimærisme i unge, gamle eller syge mus, der er mere modtagelige for myeloablative bestråling. Nogle RIC protokoller bruger lave, ikke-myleoablative doser af kroppens samlede bestråling for at minimere de negative bivirkninger, men disse protokoller stadig kræver bestrålingsanlæg og afhængig af dosis bestråling, kan resultere i kimærisme niveauer, der er lavere end dem, der kan opnås med busulfan conditioning 13. For nylig er treosulfan blevet anvendt til BM conditioning 8,14. Ligesom busulfan, treosulfan conditioning og BMT er i stand til at frembringe mus med en høj grad af kimærisme i BM 14. Men treosulfan er ikke let opnåelige i Nordamerika, og dosis af treosulfan nødvendig for at opnå samme grad af kimærisme til busulfan condition er betydeligt højere end busulfan (~ 5-10 gange) 14. Desuden ved disse effektive doser treosulfan synes at have mere toksiske bivirkninger i mus sammenlignet med busulfan (K. Peake, J. Manning og C. Krieger, upublicerede observationer). Perifert blod kimærisme kan også etableres gennem generering af parabiotic mus, hvilket indebærer kirurgisk forbinder cirkulationen af ​​en modtager mus til en donor mus. I modsætning til hele BM transplantationer, parabiosis tillader perifert blod kimærisme at være etableret i en mere fysiologisk måde uden at indføre BM-begrænsede progenitorceller i kredsløbet, selvom parabiosis er en teknisk udfordrende procedure, som kun resulterer i ~ 50% donor celler i peripheral blod recipientmus 15.

Protokollen beskrevet her afhængig hjælp modtager- og donor mus, som er af samme køn, samt ved hjælp af syngene modtager og donor musestammer, med henblik på at minimere muligheden for transplantatafstødning. Selv om mange egnede donor- og modtager stammer er kommercielt tilgængelige, oprettelse kimærisme i uoverensstemmende allogene mus (dvs. afviger betydeligt i MHC haplotype) kan være problematisk. I sådanne tilfælde, hvor allogene mus er de eneste egnede mus til rådighed, bør en foreløbig undersøgelse først udføres på en lille gruppe af mus at afgøre, om busulfan condition er i stand til at føre til en høj grad af stabil kimærisme. Vi har haft en vis succes transplantere donor BMDCs isoleret fra C57BL / 6-GFP-mus i C57BL / 6, SJL modtagere, selv om ikke alle transplanterede mus etableret vedvarende kimærisme (~ 30%). Tilsætningen af ​​cyclophosphamid, en stærk immunsuppressivt middel ofte used sammenholdt med busulfan klinisk 16, kan anvendes til at forbedre succesraten for de allogene transplantationer. Men når C57BL / 6-GFP-celler blev transplanteret ind i en tredobbelt transgen musemodel for Alzheimers sygdom på en blandet C57BL / 6; 129 genetisk baggrund, busulfan og cyclophosphamid conditioning var utilstrækkelig til at frembringe stabile BM kimærer (figur 2B), hvorimod stabil indpodning var muligt efter letal bestråling. Således, i situationer, hvor der kræves allogene transplantationer, kan bestråling være en mere passende konditionering regime på grund af den fuldstændige myeloablation og svær immunosuppression, der opstår.

Bør træffes en række supplerende foranstaltninger med henblik på at maksimere kimærisme og sammenhæng i denne protokol. Det er afgørende, at friske fortyndinger af busulfan er forberedt til injektion, helst lige før busulfan administration, da styrken af ​​busulfan synes at blive reduceret med langvarigopbevaring. Derudover, når triturering af BM til at dissociere cellerne, er det vigtigt at gøre det forsigtigt for ikke at beskadige BM-celler. Mens dette kan resultere i nogle klumper af væv, der ikke er fuldstændigt adskilt, og dermed en lavere udbytte, den generelle sundhed og kvaliteten af ​​de dissocierede celler vil blive bedre. På samme måde bør ethvert skridt, der kræver resuspension af pillen også gøres forsigtigt.

Høje niveauer af kimærisme kan konsekvent opnås med 60, 80 og 100 mg / kg doser af busulfan 7 (figur 1 - 3). Desuden er der en dosisafhængig stigning i ophobning af GFP + -celler i CNS af vildtype 8,9 og ALS mus 7. Vi og andre har også observeret en stigning i antallet af akkumulere GFP + -celler i CNS af musemodeller for neurodegeneration i forhold til vildtypemus 7,8,10. Letal bestråling resulterer i et endnu større antal af GFP + BMDC'er i forhold til 60-100 mg / kg doser af busulfan 7 selv om en nylig undersøgelse viser, at en myeloablativ dosis busulfan (125 mg / kg) resulterer i et højere antal af GFP + -celler i hjernen i forhold til total legemsbestråling 9. Tyder på, at BMDC indtræden i CNS af letalt bestrålede mus kan skyldes, i det mindste delvis, til afbrydelse af blod-hjerne-barrieren (BBB). Mens busulfan ikke synes at forstyrre BBB baseret på fravær af serumproteiner (albumin) i CNS 11 busulfan er i stand til let at passere BBB 17,18 og dermed er det blevet foreslået, at busulfan konditionering kan åbne niche plads inden CNS, som efterfølgende fyldes af BMDCs 8. Interessant er resultaterne af Wilkinson et al. Tyder på, at GFP + -celler ophobes i CNS busulfan konditioneret mus på grund af en kemokin rekruttering mekanisme, mens GFP + celleakkumulering i letalt bestrålede mus synes at skyldes inflammatory mekanismer genereret af bestråling selv 9. Treosulfan synes ikke at konditionere CNS og dermed få GFP + -celler blev fundet i CNS treosulfan konditioneret mus 8. Det er endnu ikke fastlagt de effekt forskellige doser af busulfan kan få for andre end CNS væv, selvom busulfan er kendt for at målrette lever, lunger og nyrer 6. Denne busulfan kan betinge andre væv bør tages i betragtning, når de vælger en dosis busulfan for nye eksperimenter.

Mens dette busulfan conditioning protokol er relativt enkel at udføre, generering af mus med kimære BM er et kraftfuldt værktøj, der kan anvendes til at undersøge hæmatopoietiske celler. Den brede vifte af transgene mus kommercielt tilgængelige, sammen med evnen til genetisk manipulation mus og BMDCs, øger dramatisk potentialet i denne protokol. For eksempel findes der forskellige musemodeller, hvor GFP-ekspression er begrænset tilspecifikke celletyper og slægter, såsom CX3CR1-GFP-mus, der udtrykker GFP, overvejende myelomonocytiske afstamningsceller 19. Disse mus kan anvendes som donorer giver mulighed for undersøgelse af specifikke hæmatopoietiske cellepopulationer in vivo. Et antal forskellige fluoroforer findes også i tillæg til GFP, der kan anvendes med henblik på at transplantere og overvåge BMDCs fra to (eller flere) forskellige donorer, en teknik, der kan anvendes til kompetitive assays 20. Desuden findes der en række forskellige transgene musemodeller for sygdommen, der kan anvendes som modtagere for at undersøge den rolle, BMDCs i en række lidelser. Efter transplantation kan donorceller analyseres ved anvendelse af immunhistokemi eller isoleres ved FACS og undersøgt ved anvendelse af en række biokemiske teknikker. Desuden kan avanceret billedbehandling teknologier såsom to-foton mikroskopi gennemføres for levende in vivo detektion af fluoroforer såsom GFP 21. I sidste ende, er detforestiller sig, at BMDCs kunne gensplejsede og anvendes til at levere terapeutiske molekyler til målvæv såsom CNS i busulfan-conditioned modtagere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239 (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8 (4), e60661 (2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8 (3), e58544 (2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77 (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55 (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Tags

Medicine busulfan knoglemarvstransplantation myelosuppressivt conditioning kimærisme hæmatopoietiske stamceller immunbiologi flowcytometri
Busulfan som myelosuppressive Agent til at generere stabilt højt niveau knoglemarv Kimærisme i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peake, K., Manning, J., Lewis, C.More

Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter