Protocol
REMARQUE: éthique Déclaration: Ce protocole a été examiné et approuvé par le Comité de l'Université Simon Fraser de protection des animaux (UACC; numéros de permis 1037K-12 et 1060K-03) et est en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux, le Guide NIH pour la directive du Conseil de la CEE soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, et.
1. Considérations particulières
NOTE: Le busulfan est cytotoxique. Manipuler et éliminer conformément à la fiche de données de sécurité matériel et directives institutionnelles.
- Effectuer toutes les techniques de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire.
- Stériliser les instruments avant de les utiliser en l'enveloppant dans un matériau d'emballage approprié, comme un paquet de pelage, et autoclave.
- Bien que le risque d'infection est plus faible avec conditionné busulfan par rapport à l'irradiation, manipuler les animaux que dans une hotte à flux laminaire pour les 2 premières semaines suivant la transplantation.
2. Conditionnement dessouris receveuses
- Diluer le busulfan à 3 mg / ml avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
NOTE: Il est important de prendre un nouveau dilution de busulfan juste avant d'utiliser chaque jour de l'injection. - Administrer 20 mg / kg de busulfan diluée à souris receveuses par injection IP quotidienne.
- Répéter les injections quotidiennes d'IP de 20 mg / kg busulfan jusqu'à une dose totale de 60 à 100 mg / kg a été livré (ce est à dire, pour / kg une dose totale de 80 mg, administrer 20 mg / kg de busulfan pendant 4 jours consécutifs).
3. Isolation des donateurs cellules de moelle osseuse
NOTE: Ce protocole a été utilisé avec succès pour isoler et préparer des cellules BM de jusqu'à 5 souris donneuses. Typiquement, le rendement en cellules par souris est d'environ 30 à 40.000.000 BMDCs, ce qui est suffisant pour transplanter 12-16 souris receveuses. Si plus de souris donneuses sont nécessaires le protocole peut être nécessaire d'ajuster en conséquence.
- Après le dernier jour de busulfan conditionné euthAnizé une souris GFP des bailleurs de fonds (de un à six mois) à l'aide de CO 2 (ou par une autre procédure d'euthanasie accepté à l'établissement). Pour éviter les complications greffés utilisent donateurs syngéniques qui sont du même sexe que les destinataires.
- Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol. la peau de se soulever à l'abdomen et ciseaux chirurgicaux utilisant faire une incision à travers la peau de la cavité abdominale jusqu'à la jambe vers la cheville. Maintien du pied, tirez fermement sur la peau de la cheville vers le hip exposant le tissu de la jambe.
- Coupez le muscle et le tissu adipeux du fémur pour exposer l'articulation de la hanche.
- Tout en tirant doucement sur le pied d'étendre la jambe, appuyez sur les ciseaux contre l'articulation de la hanche. Coupez juste au-dessus de la tête du fémur en prenant soin de ne pas couper le fémur lui-même.
- Pour aider à maintenir la stérilité, maintenez la jambe par le pied et nettoyer tout tissu restant des os en frottant la surface de l'os avec des tissus autoclave.
- Séparer le fémur et le tibia en coupant à travers l'articulation du genou etplacer le fémur dans une boîte de culture contenant du PBS stérile. Incuber sur de la glace.
- Retirer et jeter le péroné en coupant sur les points où le péroné se connecte au tibia. Placez le tibia dans la boîte de culture avec le fémur et incuber sur de la glace.
- Répétez les étapes 03.02 à 03.07 pour l'autre jambe, et si nécessaire, souris donneuses supplémentaires. Après l'enlèvement des os, stériliser les instruments chirurgicaux avec un stérilisateur à billes chaud ou utiliser un nouvel ensemble d'outils stériles pour les étapes ultérieures.
- Pour les fémurs, maintenez le fémur avec une pince et l'aide de ciseaux chirurgicaux attentivement 'rasage' les extrémités distales de l'os. Retirer aussi peu de l'os nécessaire pour exposer la cavité BM.
- Remplir une seringue avec 3 ml de PBS stérile et fixer une aiguille 23 G. Ennuyer avec précaution l'aiguille dans la cavité BM et rincer la BM dans un plat de culture stérile. Assurez-vous de racler la cavité médullaire avec le point de l'aiguille pour assurer l'élimination de toutes les cellules souhaitées. Après extraction,se assurer que le BM rouge ne est plus visible et l'os blanc apparaît maintenant.
- Répétez les étapes 3.9 à 3.10 pour les fémurs ultérieures, la mise en commun la totalité de la BM dans la même boîte de culture.
- Pour les tibias, maintenez le tibia avec une pince et soigneusement 'rasage' la fin où le tibia a été fixée au genou pour exposer la cavité BM. Faire une deuxième coupe, le long de l'os où le BM rouge visible se termine.
- Remplir une seringue avec 3 ml de PBS stérile et fixer une aiguille G 25. Insérez délicatement l'aiguille dans la cavité BM (à partir de la fin qui a été attaché au genou) et rincer la BM dans la boîte de culture contenant la BM dans le fémur. Racler les parois de la cavité avec l'aiguille BM pour éliminer toutes les cellules. Après l'extraction, se assurer que la BM rouge ne est plus visible et l'os apparaît maintenant blanc.
- Répétez les étapes 3.12 à 3.13 pour les tibias ultérieure, la mise en commun la totalité de la BM dans la même boîte de culture.
- Triturer doucement la BM avec une pointe de pipette de 1 ml de dissocier le caunes.
- Faire passer la suspension de cellules à travers un panier filtre 40 uM dans un tube stérile de 50 mL de la centrifugeuse. Rincer le plat avec du PBS pour obtenir toutes les cellules restantes et transférer cette travers le filtre dans le tube de la centrifugeuse.
- Centrifugeuse pendant 5 min à 450 g à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse érythrocytaire. Incuber sur la glace pendant 8,5 min.
- Ajouter ~ 30 ml de PBS stérile pour étancher le tampon de lyse.
- Centrifugeuse pendant 5 min à 450 g à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile. Garder sur la glace.
- Prendre une petite aliquote de l'homogénat cellulaire et diluer avec du PBS (1: 100 pour une souris, 1: 200 pour 2 souris, etc.) pour quantifier le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Diluer la suspension cellulaire à 8 x 10 6 cellules / ml et on incube sur de la glace jusqu'à ce que l'injection.
4. greffe de moelle osseuse
- Fill une seringue de 0,5 ml (avec une aiguille de 28 G insuline) avec 300 ul de suspension cellulaire diluée pour chaque souris à injecter. Soyez sûr d'enlever les bulles d'air présentes dans la seringue.
- Placez la cage de la souris contenant les souris receveuses conditionnés sur un coussin chauffant et permettent les veines de la queue à se dilater.
- Prenez une souris receveuse et le placer dans le dispositif de retenue. Essuyez la queue avec de la gaze chirurgicale imbibé d'éthanol à 70%.
- Tenez fermement le bout et avec le biseau vers le haut, insérez délicatement l'aiguille dans une des veines de la queue latérales et injecter la suspension cellulaire.
- Maintenir gaze chirurgicale sur le site d'injection jusqu'à ce que le saignement se arrête avant l'introduction de la souris dans une nouvelle cage propre.
5. estimer l'étendue des BM chimérisme
REMARQUE: les niveaux chimérisme sont généralement variable dans le sang périphérique au 1 semaine post-BMT, et que de tels niveaux de chimérisme sont normalement estimés au moins deux semaines post-BMT. Niveaux de chimerism devrait atteindre> 80% cellules GFP + dans le sang périphérique dans les 3-4 semaines après BMT.
- Préparer tampon FACS (mM EDTA + 2% de sérum de veau fœtal 2 dans du PBS).
REMARQUE: tampon de FACS peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines. - Placez la souris dans un tube de retenue et de se raser la fourrure sur la jambe postérieure pour exposer la veine saphène latérale.
- Enduisez légèrement la jambe avec de la vaseline et de percer la veine saphène avec une aiguille 25 G.
- Recueillir environ 50 ul de sang avec un tube capillaire revêtue d'héparine. Ajouter le sang dans un tube de micro-centrifugation contenant 1 ml de tampon FACS. Mélanger le tube par inversion et stocker sur la glace.
- Tenez gaze chirurgicale sur le site d'injection jusqu'à saignement se arrête avant de retourner la souris retour à la cage.
- Centrifuger les échantillons de sang pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot dans 500 pl de tampon de lyse érythrocytaire. Incuber sur la glace pendant 8,5 min.
- Ajouter 1 ml de tampon pour FACS pour étancher le tampon de lyse.
- Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant.
- Effectuer une seconde étape de lyse dans 500 ul de tampon de lyse érythrocytaire. Incuber sur la glace pendant 8,5 min.
- Ajouter 1 ml de tampon pour FACS pour étancher le tampon de lyse.
- Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant. Vérifiez que la pastille est maintenant blanc.
NOTE: Si la pastille apparaît toujours rouge, une étape de lyse supplémentaire peut être nécessaire avant de passer à l'étape suivante. - Re-suspendre le culot dans 1 ml de tampon FACS. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant.
- Re-suspendre le culot dans 300 pi de tampon FACS et quantifier cellules GFP + par cytométrie de flux (NOTE: A ce stade, aucune immunocoloration souhaitée des cellules peut être effectuée en utilisant des techniques standard, avant de se écouler analyse cytométrique).
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Representative Results
L'administration de 60 à 100 mg / kg de busulfan est généralement bien toléré par les souris. Toutefois, les animaux perdent généralement du poids pendant la phase de conditionnement (~ 5-10%) et donc l'alimentation peut être complétée avec des friandises telles que les graines de tournesol irradiés pour encourager manger. Les niveaux de chimérisme de> 80% des cellules GFP + dans le sang périphérique et BM doivent être régulièrement réalisable à l'aide de 60 à 100 mg / kg de busulfan 7. Notre laboratoire a utilisé avec succès ce protocole pour générer plus de 100 souris chimérique avec> 80% cellules GFP + dans le sang périphérique et BM, et la quasi-totalité de nos OGEC sont couronnées de succès lors de l'utilisation donneurs et des receveurs syngéniques. La figure 1 montre les niveaux de chimérisme quantifiés hebdomadaire dans le sang périphérique de souris climatisées avec 100 mg / kg busulfan recevoir un succès syngénique BMT (n = 3) et souris climatisées avec 80 mg / kg busulfan recevant une allogreffe BMT échec (n = 3). niveaux de chimérisme> 80% sont typically établie par 3-4 semaines post-BMT. Figure 2 est FACS données représentatives de sang périphérique montrant une BMT réussite et l'échec. La figure 3 montre que ce chimérisme reste établie pendant au moins un an dans le BM (n = 3), et que le conditionnement, le véhicule ne est pas suffisante pour induire un chimérisme BM (n = 3). Bien qu'il n'y ait pas de différence significative dans les niveaux de chimérisme BM obtenus en utilisant des doses de 60-100 mg / kg de busulfan, les cellules GFP + accumulent dans le système nerveux central d'une manière dépendante de la dose. De plus, cette accumulation est considérablement augmentée dans des maladies neurodégénératives comme la SLA 7. La figure 4 illustre GFP + accumulation de cellules dans la région lombaire de la moelle épinière dans un type sauvage (n> 20) et un modèle de souris ALS (n> 20).
Figure 1. Les souris receveuses conditionnésavec busulfan et transplanté d'un donneur syngénique avec des cellules GFP + de moelle osseuse atteindre un niveau élevé de chimérisme soutenue dans le sang. données de cytométrie en flux hebdomadaires montrant GFP + chimérisme dans le sang périphérique des souris transplantées avec succès conditionné avec 100 mg / kg de busulfan suivie par syngénique greffe de moelle osseuse (noir) et les souris transplantées sans succès conditionnés avec 80 mg / kg de busulfan suivie d'une greffe de moelle osseuse allogénique (gris). Les résultats sont des moyennes de n = 3 souris / groupe, barres d'erreur représentent SEM.
Figure 2. Le représentant de données de cytométrie en flux montrant cellules GFP + dans le sang périphérique 3 semaines après la transplantation de la moelle osseuse chez la souris climatisées avec 100 mg / kg de busulfan. (A) Scatterplot stratégie montrant gating, (B) un échec allogengreffe de moelle osseuse EIC, et (C) une greffe de moelle osseuse syngénique succès. Les résultats sont représentatifs de n> 3 souris. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Le représentant des données de cytométrie en flux montrant cellules GFP + dans la greffe de moelle osseuse 1 an après la moelle osseuse. (A) Scatterplot montrant gating stratégie, (B) souris de véhicules conditionné, et les souris (C) 100 mg / kg busulfan conditionné. Les résultats sont représentatifs de n = 3 souris. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Cellules dérivées Figure 4. moelle osseuse se accumulent dans le système nerveux central de busulfan conditionné souris ayant reçu une greffe de moelle osseuse. L'analyse immunohistochimique de sections de la région lombaire de la moelle épinière isolée à partir (A, C) des souris de type sauvage et (B, D) à la fin souris SLA de stade de la maladie. cellules GFP + sont indiquées en vert. Les résultats sont des images représentatives de n> 20 souris pour chaque modèle. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Busulfan conditionnement permet la génération de haut niveau BM chimérisme chez la souris avec des cellules hématopoïétiques qui sont facilement détectables. Ce conditionnement peut être effectué sans le besoin d'installations d'irradiation. En outre, la myélosuppression avec les doses de busulfan décrite dans le présent protocole est bien toléré, minimisant les effets secondaires toxiques causés par des doses myéloablatives d'irradiation, et donc peut être une technique plus approprié pour générer BM chimérisme chez les souris jeunes, vieux ou malades qui sont plus myéloablatif sensibles à l'irradiation. Certains protocoles RIC utilisent de faibles doses, non myleoablative d'irradiation corporelle totale pour minimiser les effets secondaires indésirables, mais ces protocoles nécessitent encore des installations d'irradiation et, en fonction de la dose d'irradiation, peut entraîner des niveaux de chimérisme qui sont inférieurs à ceux réalisables avec busulfan 13 conditionné. Récemment, tréosulfan a été utilisé pour BM conditionné 8,14. Comme busulfan, conditi tréosulfanoning BMT et est capable de générer des souris avec un degré élevé de chimérisme dans le BM 14. Cependant, tréosulfan ne est pas facilement réalisable en Amérique du Nord, et la dose de tréosulfan nécessaire pour atteindre des niveaux comparables de chimérisme au conditionnement busulfan est significativement plus élevé que le busulfan (~ 5-10 fois) 14. En outre, à ces doses efficaces tréosulfan semble avoir des effets secondaires plus toxiques chez la souris par rapport au busulfan (K. Peake, J. Manning, et C. Krieger, observations non publiées). Chimérisme de sang périphérique peut également être établie par la génération de souris parabiose, qui consiste à relier chirurgicalement la circulation d'une souris bénéficiaire d'une souris des bailleurs de fonds. Contrairement greffes entiers BM, parabiose permet de chimérisme de sang périphérique à établir d'une manière plus physiologique sans l'introduction de cellules progénitrices BM restriction dans la circulation, bien que parabiose est une procédure difficile techniquement que seuls les résultats dans ~ cellules du donneur 50% dans les zones péripheral sang de souris bénéficiaire 15.
Le protocole décrit ici repose sur l'aide de receveurs et donneurs souris qui sont du même sexe, de même que l'utilisation de souches réceptrices et de souris syngéniques de donneur, afin de minimiser la possibilité de rejet de greffe. Bien que de nombreuses souches de donateurs et bénéficiaires appropriés sont disponibles dans le commerce, établir un chimérisme allogénique chez les souris dépareillés (c.-à différer sensiblement de CMH haplotype) peut être problématique. Dans les cas où des souris allogéniques sont les seules souris appropriés disponibles, une étude préliminaire devrait d'abord être effectuée sur un petit groupe de souris pour déterminer si conditionné busulfan est susceptible de conduire à un haut degré de chimérisme stable. Nous avons eu un certain succès la transplantation BMDCs donateurs isolées de souris C57BL / 6-GFP dans C57BL / 6; bénéficiaires SJL, bien que toutes les souris non transplantés établis chimérisme soutenue (~ 30%). L'addition de cyclophosphamide, un agent immunosuppresseur puissant souvent used en conjonction avec busulfan cliniquement 16, peut être utilisé pour améliorer le taux de transplantations allogéniques de succès. Cependant, lorsque les cellules / 6-GFP C57BL ont été transplantées dans un modèle de souris transgénique triple de la maladie d'Alzheimer sur une souris C57BL / 6 mélangé; 129 génétique fond, le busulfan et le cyclophosphamide conditionnement étaient insuffisantes pour générer des chimères BM stables (figure 2b), alors que la prise de greffe stable était possible après irradiation létale. Ainsi, dans les situations où les greffes allogéniques sont nécessaires, l'irradiation peut être un régime de conditionnement plus approprié en raison de la myéloablation complète et une immunosuppression sévère qui se produit.
Plusieurs mesures supplémentaires devraient être prises afin de maximiser le chimérisme et la cohérence de ce protocole. Il est crucial que des dilutions fraîches de busulfan sont préparés pour l'injection, idéalement juste avant l'administration busulfan, que la puissance de busulfan semble être réduite à long termele stockage. En outre, lorsque triturant le BM de dissocier les cellules, il est important de le faire doucement afin de ne pas endommager les cellules BM. Même si cela peut donner lieu à des amas de tissus qui ne sont pas complètement dissocié, et par conséquent un rendement légèrement inférieur, la santé globale et la qualité des cellules dissociées sera mieux. De même, toutes les mesures qui exigent la remise en suspension de la pastille devrait également être fait en douceur.
Des niveaux élevés de chimérisme peuvent toujours être atteints avec 60, 80 et 100 mg / kg de doses busulfan 7 (figures 1-3). En outre, il existe une augmentation dose-dépendante de l'accumulation de cellules GFP + dans le système nerveux central de type sauvage et de souris SLA 8,9 7. Nous et d'autres avons également observé une augmentation du nombre de cellules GFP + accumuler dans le système nerveux central de souris modèles de neurodégénérescence par rapport à des souris de type sauvage 7,8,10. Les résultats d'irradiation mortelle dans un nombre encore plus grand de la GFP + BMDC par rapport à 60 à 100 mg / kg doses de busulfan 7 bien qu'une étude récente suggère qu'une dose de busulfan myélosuppresseur (125 mg / kg) les résultats dans un nombre plus élevé de cellules GFP + dans le cerveau par rapport à une irradiation corporelle totale neuf. Les preuves suggèrent que BMDC entrée dans le SNC de souris irradiées de façon létale peut être dû, au moins en partie, à la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Alors que le busulfan ne semble pas perturber le BBB basée sur l'absence de protéines sériques (albumine) dans le système nerveux central 11, le busulfan est capable de traverser facilement la BHE 17,18 et donc il a été suggéré que le conditionnement busulfan peut ouvrir l'espace de niche au sein de le CNS qui est ensuite rempli par BMDCs 8. Fait intéressant, les résultats de Wilkinson et al., Suggèrent que les cellules GFP + accumulent dans le système nerveux central de souris busulfan conditionné due à un mécanisme de recrutement de chimiokine tandis que l'accumulation de cellules GFP + chez des souris irradiées de façon létale semble être due à inflammatory mécanismes générés par l'irradiation elle-même neuf. Tréosulfan ne apparaît pas pour conditionner le système nerveux central et par conséquent peu de cellules GFP + ont été trouvés dans le SNC de souris tréosulfan conditionné 8. Il reste à déterminer les effets de différentes doses de busulfan peut avoir sur les tissus autres que le SNC, bien busulfan est connu pour cibler le foie, les poumons, les reins et 6. Ce busulfan peut conditionner d'autres tissus doit être pris en considération au moment de choisir une dose de busulfan de nouvelles expériences.
Bien que ce protocole de conditionnement busulfan est relativement simple à réaliser, la génération de souris avec chimérique BM est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les cellules hématopoïétiques. La large gamme de souris transgéniques disponibles dans le commerce, ainsi que la capacité de souris génétiquement mécaniciens et BMDCs, augmente considérablement le potentiel de ce protocole. Par exemple, divers modèles de souris existent où l'expression de GFP est limitée àcertains types de cellules et lignées, tels que des souris CX3CR1-GFP exprimant GFP prédominante dans les cellules de la lignée myélomonocytaire 19. Ces souris peuvent être utilisés en tant que donneurs permettant la recherche de populations spécifiques de cellules hématopoïétiques in vivo. Un certain nombre de différents fluorophores existe également, en plus de la GFP, qui peut être utilisé pour surveiller et BMDCs transplanter à partir de deux (ou plus) donneurs distincts, une technique qui peut être employée pour des essais de compétition 20. En outre, un certain nombre de différents modèles de souris transgéniques de la maladie existent qui peuvent être utilisés en tant que destinataires d'étudier le rôle de BMDCs dans une variété de troubles. Après la transplantation, les cellules du donneur peuvent être analysées par immunohistochimie, ou isolés par FACS et étudiés en utilisant une gamme de techniques biochimiques. En outre, les technologies d'imagerie de pointe telles que la microscopie à deux photons peuvent être mises en œuvre pour vivre dans la détection in vivo des fluorophores tels que la GFP 21. En fin de compte, ilest envisagé que BMDCs pourrait être génétiquement modifiées et utilisées pour délivrer des molécules thérapeutiques pour cibler les tissus tels que le SNC chez les receveurs de busulfan conditionné.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Busulfex | Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. | DIN 02240602 | Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines. |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 |
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