Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Busulfan как Myelosuppressive агента по приносящей стабильные высокого уровня костного мозга химеризм у мышей

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52553

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этика себе: Этот протокол был рассмотрен и одобрен Care комитета животное Университета Саймона Фрейзера в силу (ОАК; разрешить числа 1037K-12 и 1060K-03) и в соответствии с Канадским советом по Уходу за животными, Руководство NIH для Уход и использование лабораторных животных, и Директива EEC Совета.

1. Специальные Соображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Busulfan цитотоксичен. Аккуратное использование и утилизация в соответствии с паспорте безопасности и институциональных принципов.

  1. Выполните все методы в асептических условиях в ламинарном боксе.
  2. Стерилизацию инструментов перед использованием упаковки в соответствующем упаковочном материале, например, на отрыв пакета, и в автоклаве.
  3. В то время как риск инфицирования ниже бусульфаном кондиционирования сравнению с облучением, ручка животных только в ламинарном боксе в течение первых 2 недель после трансплантации.

2. КондиционированиеПолучатель Мыши

  1. Развести Бусульфан до 3 мг / мл стерильного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы сделать новый разбавление бусульфан непосредственно перед использованием каждый день инъекции.
  2. Администрирование 20 мг / кг, разбавленного бусульфан в мышей-реципиентов с помощью инъекции IP ежедневно.
  3. Повторите ежедневные инъекции IP 20 мг / кг бусульфана до общей дозы 60-100 мг / кг был доставлен (то есть, для 80 мг / кг общей дозы, администрирование 20 мг / кг бусульфана в течение 4 последовательных дней).

3. Выделение доноров клеток костного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был успешно использован для выделения и подготовки ВМ-клетки из до 5 доноров мышей. Обычно выход клеток на мышь составляет около 30-40 млн BMDCs, что достаточно, чтобы пересадить 12-16 мышей-реципиентов. Если больше доноров мышей необходимы протокол, возможно, придется быть соответствующим образом скорректированы.

  1. После последнего дня бусульфан кондиционирования euthanize в GFP мыши-донора, (5:59 месяцев) с помощью CO 2 (или другой процедуры эвтаназии, принятой на учреждение). Чтобы избежать привитые осложнения использовать сингенные доноров, которые же пола, что и получателей.
  2. Спрей мышь с 70% этанола. Подтяжка кожи на животе и с помощью хирургических ножниц сделать надрез через кожу от брюшной полости до ноги по направлению к лодыжке. Проведение ногу, твердо тянуть кожу от лодыжки к бедру подвергая ноги ткани.
  3. Срежьте мышц и жировой ткани из бедра, чтобы выставить тазобедренного сустава.
  4. Аккуратно потянув за ноги, чтобы продлить ногу, нажимайте ножницы против тазобедренного сустава. Вырезать чуть выше головки бедренной кости, стараясь не разрезать сам бедра.
  5. Для поддержания стерильности, держите ногу на ногу и очистить любые оставшиеся ткани от костей, протирая поверхность кости с автоклавного тканей.
  6. Отделите бедра и голени путем перерезания коленного сустава иразместить бедра в культуральной чашке, содержащей стерильную PBS. Инкубировать на льду.
  7. Снимите и выбросьте малоберцовой кости за счет сокращения в точках, где малоберцовой кости соединяется с голенью. Поместите голени в культуральной чашке с бедренной кости и инкубировать на льду.
  8. Повторите шаги 3.2-3.7 для другой ноги, и, если необходимо, дополнительные мышей-доноров. После удаления костей, стерилизации хирургических инструментов с горячей борта стерилизатора или использовать новый набор стерильных инструментов для последующих шагов.
  9. Для бедер, держите бедро с пинцетом и с помощью хирургических ножниц тщательно "бритье" дальние концы от кости. Удалить всего кости при необходимости подвергать полость BM.
  10. Заполните шприц с 3 мл стерильного PBS и приложите 23 г иглу. Тщательно родила иглы в полость Б. и промойте BM в стерильную чашку для культивирования. Будьте уверены, чтобы очистить мозгового полость с точки иглы для обеспечения удаления всех нужных клеток. После экстракции,убедитесь, что красный BM больше не видны и кости теперь появляется белый.
  11. Повторите шаги 3.9-3.10 для последующих бедрах, объединение всех БМ в то же блюдо культуры.
  12. Для голеней, удерживая голень щипцами и осторожно "бритья" конец, где большая берцовая кость была прикреплена к колену, чтобы разоблачить полость BM. Сделайте второй разрез вдоль кости, где видимый красный BM заканчивается.
  13. Заполните шприц с 3 мл стерильного PBS и приложите 25 G иглу. Осторожно введите иглу в полость ВМ (с конца, что был прикреплен к колену) и промойте BM в культуральную чашку, содержащую БМ от бедренных костей. Собрать стенки полости BM с иглой, чтобы удалить все клетки. После экстракции, убедитесь, что красный BM больше не видны и кости теперь появляется белый.
  14. Повторите шаги 3.12-3.13 для последующего голеней, объединение всех БМ в то же блюдо культуры.
  15. Аккуратно растирают BM с наконечником пипетки 1 мл до диссоциации Слоктей.
  16. Проход клеточной суспензии через корзину фильтра 40 мкм в стерильный 50 мл центрифужную пробирку. Промыть блюдо с PBS, чтобы получить любые оставшиеся клетки и передавать это через фильтр в центрифужную пробирку.
  17. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г при 4 ° С. Снимите и выбросьте супернатант.
  18. Повторное приостановить осадок в 3 мл эритроцитов лизирующего буфера. Инкубируют на льду в течение 8,5 мин.
  19. Добавить ~ 30 мл стерильной PBS, чтобы утолить буфер лизиса.
  20. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г при 4 ° С. Снимите и выбросьте супернатант.
  21. Повторное приостановить осадок в 1 мл стерильной PBS. Держите на льду.
  22. Возьмем небольшой аликвоты гомогената клеток и разбавляют PBS (1: 100 в течение 1 мыши; 1: 200 в течение 2 мышей и т.д.), чтобы определить число клеток с помощью гемоцитометра.
  23. Развести клеточной суспензии в 8 × 10 6 клеток / мл, и не инкубировать на льду до инъекции.

4. Трансплантация костного мозга

  1. FiLL 0,5 мл шприц (с 28 г инсулиновую иглу) с 300 мкл разбавленного клеточной суспензии для каждой мыши, чтобы быть введены. Будьте уверены, чтобы удалить воздушные пузыри, имеющиеся в шприце.
  2. Поставьте клетку мыши, содержащий обусловленные мышей-реципиентов на грелку и дайте хвостовой вены расширяются.
  3. Возьмите мышь получатель и место в запретительного устройства. Протрите хвост с хирургической марли, смоченной 70% этанола.
  4. Крепко держите хвост и со скосом вверх, аккуратно вставьте иглу в одной из боковых хвостовых вен и вводят клеточной суспензии.
  5. Удержание хирургического марли на месте инъекции, пока кровотечение не остановится перед введением мыши в новую чистую клетку.

5. Оценка Протяженность BM химеризм

ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни химеризм, как правило, переменная в периферической крови через 1 неделю после пересадки, а также такие уровни химеризм, как правило, оценивается как минимум 2 недели после пересадки. Уровни Чимerism должны достигать> 80% GFP + клеток в периферической крови в течение 3-4 недель после пересадки.

  1. Подготовка FACS буфера (2 мМ ЭДТА + 2% фетальной бычьей сыворотки в PBS).
    Примечание: FACS буфера можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
  2. Наведите в запретительного трубки и брить шерсть на задней ноге, чтобы выставить боковой подкожной вены.
  3. Тонко пальто ножка с вазелином и проткните подкожной вены с помощью иглы 25 G.
  4. Собирают примерно 50 мкл крови с гепарином покрытием капиллярной трубки. Добавить крови к микро-центрифужную пробирку, содержащую 1 мл FACS буфера. Смешайте трубки путем инверсии и хранить на льду.
  5. Удерживайте хирургического марли на месте инъекции, пока не остановится кровотечение до возвращения мышь обратно в клетку.
  6. Центрифуга образцы крови в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант.
  7. Повторное приостановить осадок в 500 мкл эритроцитов лизирующего буфера. Инкубируют на льду в течение 8,5 мин.
  8. Добавить 1 мл FACS буфера, чтобы утолить буфер лизиса.
  9. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант.
  10. Выполните второй шаг лизиса в 500 мкл эритроцитов лизирующего буфера. Инкубируют на льду в течение 8,5 мин.
  11. Добавить 1 мл FACS буфера, чтобы утолить буфер лизиса.
  12. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант. Убедитесь, что шарик сейчас белый.
    Примечание: Если осадок еще появляется красный, дополнительный этап лизиса может быть необходима, прежде чем приступить к следующему шагу.
  13. Повторное приостановить осадок в 1 мл FACS буфера. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант.
  14. Повторное приостановить осадок в 300 мкл FACS буфера, и количественно GFP + клеток с помощью проточной цитометрии (Примечание: В этот момент любое желаемое иммуноокрашивание клеток может быть выполнена, используя стандартные методики, до анализа проточной цитометрии).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Администрация 60-100 мг / кг бусульфана, как правило, хорошо переносится мышами. Однако, животные, как правило, теряют вес во время фазы кондиционирования (~ 5-10%) и, таким образом, диеты, возможно, потребуется дополнить с угощениями, таких как облученных семян подсолнечника по стимулированию еды. Уровни химеризма из> 80% GFP + клеток в периферической крови и BM должны быть достижимы с помощью последовательно 60-100 мг / кг Бусульфан 7. Наша лаборатория успешно использовал этот протокол для создания более 100 химерных мышей с> 80% GFP + клеток в периферической крови и BM, и практически все наши BMTs успешно при использовании сингенные доноров и реципиентов. Рисунок 1 показывает уровни химеризма количественно неделю в периферической крови мышей с кондиционером, 100 мг / кг бусульфана принимающего успешный сингенную ТКМ (N = 3) и мышей с кондиционером, 80 мг / кг бусульфана, получающие неудачную аллогенной трансплантации костного мозга (N = 3). Химеризм уровни> 80% typicallу устанавливаются 3-4 недель после пересадки. Рисунок 2 является представителем FACS данных периферической крови, показывая удачные и неудачные трансплантации костного мозга. Рисунок 3 показывает, что это химеризм остается установленным по крайней мере одного года в БМ (п = 3), и Кондиционирование, что носитель не является достаточным, чтобы вызвать BM химеризм (N = 3). Хотя существует никаких существенных различий в уровне BM химеризма не достигается с помощью дозы 60-100 мг / кг бусульфана, GFP + клетки накапливают в ЦНС в зависимости от дозы. Кроме того, это накопление резко возрастает при нейродегенеративных расстройств, таких как ALS 7. Фиг.4 иллюстрирует GFP + накопление клеток в поясничном отделе позвоночника в дикого типа (п> 20) и мышиной модели ALS (п> 20).

Рисунок 1
Рисунок 1. Получатель мышей кондиционеромбусульфаном и трансплантировали GFP + клеток костного мозга от сингенных донора достичь высокого уровня устойчивого химеризма в крови. Еженедельные данные проточной цитометрии, показывающие GFP + химеризм в периферической крови успешно трансплантированных мышей обусловлено 100 мг / кг бусульфана с последующим сингенных трансплантации костного мозга (черный) и безуспешно мышей с трансплантированными обусловлено 80 мг / кг бусульфана с последующим аллогенной трансплантации костного мозга (серый). Результаты средство от п = 3 мышей / группы, планки погрешностей представляют SEM.

Фиг.2
Рисунок 2. Представитель данных проточной цитометрии, показывающие GFP + клеток в периферической крови через 3 недели после трансплантации костного мозга у мышей с кондиционером, 100 мг / кг бусульфана. () Разброс точек показывает стробирования стратегии, (Б) неудачно allogenТрансплантация EIC костного мозга, и (C) успешно сингенная трансплантация костного мозга. Результаты представитель N> 3 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель данных проточной цитометрии, показывающие GFP + клеток в костном мозге через 1 год после трансплантации костного мозга. (А) показывает разброс точек стробирования стратегию, (б) транспортного средства кондиционером мышей, и (с) 100 мг / кг бусульфана кондиционером мышей. Результаты представитель п = 3 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.


Рисунок 4. костного мозга, полученные клетки накапливаются в центральной нервной системе бусульфана кондиционером мышей, получавших по пересадке костного мозга. Иммуногистохимического анализа срезов поясничного отдела спинного мозга, выделенного из (A, C) мышей дикого типа и (B, D) в конце стадии заболевания ALS мышей. GFP + клетки показаны зеленым цветом. Результаты являются репрезентативными изображения с п> 20 мышей для каждой модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Бусульфан кондиционирования позволяет для генерации высокого уровня BM химеризма у мышей с кроветворных клеток, которые легко обнаружить. Это кондиционирование может быть выполнена без необходимости облучения объектов. Кроме того, миелосупрессии с дозами бусульфана, изложенной в настоящем протоколе хорошо переносится, сводя к минимуму побочные токсические эффекты, вызванные миелоаблативной доз облучения, и, таким образом, может быть более подходящим способом для получения BM химеризм в молодой, старый, или больной мышей, которые являются более восприимчивы к миелоаблативной облучения. Некоторые протоколы используют RIC низкие, без myleoablative дозы общего облучения, чтобы свести к минимуму нежелательные побочные эффекты, но эти протоколы, по которым требуется облучения объектов и, в зависимости от дозы облучения, может привести к уровням химеризма, которые ниже, чем достижимо с бусульфана Кондиционирование 13. Недавно Треосульфан был использован для BM кондиционирования 8,14. Как бусульфан, Треосульфан conditiческими и ВМТ способен генерировать мышей с высокой степенью химеризма в BM 14. Тем не менее, Треосульфан не является легко достижимы в Северной Америке, и доза Треосульфан, необходимых для достижения сопоставимых уровней химеризма к бусульфана кондиционирования значительно выше, чем бусульфана (~ 5-10 раз) 14. Кроме того, в этих эффективных доз Треосульфан по-видимому, более токсичные побочные эффекты у мышей по сравнению с бусульфан (К. Пик, Дж Мэннинг, В и С. Кригер, неопубликованные данные). Периферийное химеризм крови также могут быть установлены через поколения парабиотического мышей, которые включает в себя хирургическое, связывающих циркуляцию мыши-реципиента к донорской мыши. В отличие от целых трансплантации BM, парабиозом позволяет периферийным химеризма крови, которая будет создана в более физиологическом уровне, не вводя BM-ограниченные клеток-предшественников в обращении, хотя парабиозом является технически сложным процедура, которая приводит лишь к ~ 50% донорских клеток в периpheral кровь мышей-реципиентов 15.

Протокол описанный здесь опирается на использовании реципиента и донора мышей, которые того же пола, а также с помощью сингенные реципиента и донора мыши штаммов, для того, чтобы свести к минимуму возможность отторжения трансплантата. Хотя многие подходящих донора и реципиента штаммы являются коммерчески доступными, создание химеризм в несогласованной аллогенной мышей (т.е., существенно различаются по MHC гаплотипа) может быть проблематичным. В таких случаях, когда аллогенные мышей являются единственными подходящими мышей доступны, предварительное исследование первой следует проводить на небольшой группе мышей, чтобы определить, бусульфана кондиционирования, способного привести к высокой степени стабильной химеризма. Мы имели некоторый успех пересадки донорских BMDCs, выделенные из мышей C57BL / 6-GFP в C57BL / 6; получателей Sjl, хотя не все пересаженные мышам создан устойчивый химеризм (~ 30%). Добавление циклофосфамида, сильный иммунодепрессант часто уСЭД в сочетании с бусульфан клинически 16, могут быть использованы для улучшения успеха из аллогенных трансплантаций. Однако, когда C57BL / 6-GFP клетки были пересажены в тройной модели трансгенных мышей болезни Альцгеймера на смешанной C57BL / 6; 129 генетический фон, бусульфан и циклофосфамидом кондиционирования было недостаточно для создания стабильных химеры BM (рис 2б), в то время как стабильного приживления можно было после летального облучения. Таким образом, в ситуациях, когда требуется аллогенных трансплантаций, облучение может быть более подходящим режим кондиционирования из-за полного myeloablation и тяжелой иммуносупрессии, что происходит.

Несколько дополнительные меры должны быть приняты для того, чтобы максимизировать химеризм и согласованности этого протокола. Очень важно, что свежие разведения бусульфан готовы для инъекций, в идеале просто до бусульфан администрации, потенция бусульфан по-видимому, снижается при длительномхранение. Кроме того, при растиранием BM, чтобы отделить клетки, важно, чтобы сделать это аккуратно, чтобы не повредить клетки BM. Хотя это может привести в некоторых глыб ткани, которые не полностью диссоциированных и, следовательно, немного меньшую урожайность, общее состояние здоровья и качество диссоциированных клеток будет лучше. Кроме того, какие-либо шаги, которые требуют повторного приостановления гранулы также должно быть сделано аккуратно.

Высокие уровни химеризма последовательно может быть достигнута с 60, 80 и 100 мг / кг дозы бусульфана 7 (фиг.1 - 3). Кроме того, существует зависимое от дозы увеличение в накоплении GFP + клеток в ЦНС дикого типа 8,9 и ALS мышей 7. Мы и другие, также наблюдалось увеличение количества накопления GFP + клеток в ЦНС из мышиных моделях нейродегенерации по сравнению с мышами дикого типа 7,8,10. Летальные облучение приводит к еще большему числу GFP + BMДК по сравнению с 60-100 мг доз / кг бусульфана 7, хотя одно из последних исследований показывают, что миелоаблативной доза бусульфана (125 мг / кг) приводит к увеличению числа GFP + клеток в головном мозге по сравнению с общей облучении 9. Опыт показывает, что запись BMDC в ЦНС летально облученных мышей может быть обусловлено, по крайней мере частично, к нарушению гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). В то время как бусульфан-видимому, не нарушить BBB основано на отсутствии сывороточных белков (альбумин) в ЦНС 11, бусульфана способен легко проникают через гематоэнцефалический барьер 17,18 и, таким образом, было высказано предположение, что бусульфана кондиционирование может открыть нишу пространство внутри ЦНС, который затем заполняется BMDCs 8. Интересно, что выводы Wilkinson и др., Свидетельствуют о том, что GFP + клетки накапливаются в центральной нервной системе бусульфана кондиционером мышей из-за механизма набора хемокинов, а накопление GFP + клеток у летально облученных мышей по-видимому, из-за inflammatorу механизмов, генерируемые самим облучения 9. Треосульфан, кажется, не состояние ЦНС и, следовательно, несколько GFP + клетки были обнаружены в ЦНС Треосульфан условного мышей 8. Остается определено влияние различных доз бусульфана может иметь на других, чем ЦНС тканях, хотя бусульфан, как известно, нацелены на печень, легкие и почки 6. Это бусульфан может обусловить другие ткани должны быть приняты во внимание при выборе дозы бусульфана для новых экспериментов.

В то время как этот протокол бусульфана кондиционирования является относительно простым для выполнения, поколение мышей с химерного BM является мощным инструментом, который может быть использован для исследования кроветворных клеток. Широкий ассортимент трансгенных мышей коммерчески доступны, наряду со способностью генной инженерии мышей и BMDCs, резко увеличивает потенциал этого протокола. Например, различные модели мыши существуют там, где выражение GFP ограниченоконкретные типы клеток и клоны, такие как мыши CX3CR1-GFP, которые выражают GFP в основном в миеломоноцитарной клона клеток 19. Эти мыши могут быть использованы в качестве доноров, позволяющих для исследования отдельных групп населения гемопоэтических клеток в живом организме. Ряд различных флуорофоров также существовать в дополнение к GFP, который может быть использован для того, чтобы трансплантировать и контролировать BMDCs из двух (или более) различных доноров, метод, который может быть использован для конкурентных анализах 20. Кроме того, число различных трансгенных мышах болезни существуют, которые могут быть использованы в качестве получателей, чтобы исследовать роль BMDCs в различных расстройств. После трансплантации, донорские клетки могут быть проанализированы с помощью иммуногистохимии, или выделены FACS и исследованы с использованием ряда биохимических методов. Кроме того, Advanced Imaging технологии, такие как два фотона микроскопии могут быть реализованы для живых обнаружения естественных флуорофоров, таких как GFP 21. В конечном счете, этоПредполагается, что BMDCs может быть генной инженерии, и используется для доставки терапевтических молекул целевой ткани, такие как ЦНС в бусульфана кондиционером получателей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239 (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8 (4), e60661 (2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8 (3), e58544 (2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77 (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55 (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Tags

Медицина выпуск 98 бусульфан трансплантация костного мозга угнетают кроветворение кондиционер химеризм гемопоэтические стволовые клетки иммунобиологии проточной цитометрии
Busulfan как Myelosuppressive агента по приносящей стабильные высокого уровня костного мозга химеризм у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peake, K., Manning, J., Lewis, C.More

Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter