Protocol
MERK: Etikk Uttalelse: Denne protokollen er gjennomgått og godkjent av Animal Care komité Simon Fraser University (UACC; tillate tall 1037K-12 og 1060K-03) og er i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care, NIH guide for Stell og bruk av forsøksdyr, og EEC direktiv.
1. Spesielle hensyn
MERK: Busulfan er cytotoksiske. Håndter og kast i henhold til sikkerhetsdatablad og institusjonelle retningslinjer.
- Utføre alle teknikker aseptisk i en laminær hette.
- Steril instrumenter før bruk ved å pakke i en egnet pakkemateriale, slik som et skall pakke, og autoklavering.
- Mens risikoen for smitte er lavere med busulfan condition i forhold til bestråling, håndtere dyr bare i en laminær hette for de 2 første ukene etter transplantasjonen.
2. Conditioning avResipientmus
- Fortynn busulfan til 3 mg / ml med steril fosfatbufret saltløsning (PBS).
MERK: Det er viktig å lage en frisk fortynning av busulfan like før bruk hver dag av injeksjon. - Administrer 20 mg / kg fortynnet busulfan til resipientmus via IP injeksjon daglig.
- Gjenta daglige IP injeksjoner på 20 mg / kg busulfan inntil en total dose på 60-100 mg / kg er blitt levert (dvs. for en 80 mg / kg total dose, 20 mg / kg av busulfan i 4 etterfølgende dager).
3. Isolering av Donor benmargceller
MERK: Denne protokollen har blitt brukt for å isolere og forbereder BM celler fra opp til fem giver mus. Typisk celleproduksjonen per mus er ca 30-40 mill BMDCs, som er tilstrekkelig til å transplantere 12-16 resipientmus. Hvis flere donor mus er nødvendig protokollen må kanskje justeres tilsvarende.
- Etter den siste dagen av busulfan condition euthanize en GFP donor mus (05:59 måneder gammel) ved hjelp av CO 2 (eller ved annen aktiv dødshjelp prosedyre akseptert på institusjon). For å unngå pode komplikasjoner bruke syngene givere som er samme kjønn som mottakerne.
- Spray mus med 70% etanol. Løft huden på magen og bruke kirurgisk saks gjør et snitt gjennom huden fra bukhulen opp på leggen mot ankelen. Holder foten, dra i huden fra ankelen mot hip utsette beinet vev.
- Trimme vekk muskler og fettvev fra femur å utsette hofteleddet.
- Mens trekke forsiktig på foten for å forlenge beinet, trykker saksen mot hofteleddet. Skjær like over hodet på femur ta vare ikke å kutte femur selv.
- For å bidra til å opprettholde sterilitet, holder benet med foten og rense eventuelle gjenværende vev fra skjelettet ved å gni overflaten med benet autoklaveres vev.
- Separer femur og tibia ved å kutte gjennom kneleddet ogplassere femur i en kulturskål inneholdende sterilt PBS. Inkuber på is.
- Fjern og kast fibula ved å kutte på de punktene hvor fibula kobles til tibia. Plasser tibia i dyrkningsskål med lårbenet og inkuber på is.
- Gjenta trinn 03.02 til 03.07 for det andre benet, og om nødvendig ekstra giver mus. Etter fjerning av bein, sterilisere kirurgiske verktøy med en varm perle sterilisator eller bruk et nytt sett av sterile verktøy for de etterfølgende trinn.
- For de lårben, hold femur med pinsett og bruke kirurgisk saks nøye 'barbering "den fjerne endene av bein. Fjern så lite av bein som er nødvendig for å avdekke BM hulrom.
- Fyll en sprøyte med 3 ml steril PBS og legge ved en 23 G nål. Fødte nøye nålen inn i BM hulen og skyll BM i en steril kultur parabolen. Pass på å skrape marghulen med nålen punkt for å sikre fjerning av alle ønskede celler. Etter ekstraksjon,sikre at den røde BM er ikke lenger synlig og bein vises nå hvitt.
- Gjenta trinn 03.09 til 03.10 for påfølgende lårben, pooling alt av BM i den samme kulturen fatet.
- For tibia, hold tibia med pinsett og nøye 'barbering' slutten der tibia var festet til kneet for å avdekke BM hulrom. Foreta et nytt kutt langs benet hvor synlig rød BM slutter.
- Fyll en sprøyte med 3 ml steril PBS og fest en 25 G nål. Forsiktig stikk nålen inn i BM hulrom (fra den enden som var festet til kneet) og skyll BM i kulturen fatet inneholder BM fra lårben. Skrap veggene i BM hulrom med nålen for å fjerne alle celler. Etter ekstraksjon, sørge for at den røde BM er ikke lenger synlig og bein vises nå hvitt.
- Gjenta trinn 03.12 til 03.13 for påfølgende skinneben, pooling alt av BM i den samme kulturen fatet.
- Forsiktig finfordel BM med en 1 ml pipette for å distansere den calen.
- Passere cellesuspensjonen gjennom et 40 um filter kurv i et sterilt 50 mL sentrifugerør. Skyll formen med PBS for å få eventuelt gjenværende celler og overfører dette gjennom filteret inn i sentrifugerør.
- Sentrifuger i 5 min ved 450 x g ved 4 ° C. Fjern og kast supernatanten.
- Re-suspendere pellet i 3 ml erytrocytt lysebuffer. Inkuber på is i 8,5 min.
- Legg ~ 30 ml steril PBS for å slukke det lyserende buffer.
- Sentrifuger i 5 min ved 450 x g ved 4 ° C. Fjern og kast supernatanten.
- Re-suspendere pellet i 1 ml steril PBS. Hold på is.
- Ta en liten porsjon av cellehomogenat og fortynnet med PBS (1: 100 for en mus, 1: 200 i 2 mus, etc.) for å kvantifisere celletallet ved hjelp av et hemocytometer.
- Fortynn cellesuspensjonen til 8 x 10 6 celler / ml og inkuberes på is inntil injeksjon.
4. benmargstransplantasjon
- Fill en 0,5 ml sprøyte (med en 28 G nål insulin) med 300 ul fortynnet cellesuspensjon for hver mus som skal injiseres. Sørg for å fjerne eventuelle luftbobler i sprøyten.
- Plasser museburet inneholder klimaanlegg resipientmus på en varmepute og la halevenene å strekke.
- Ta en mottaker mus og plass i holdeanordning. Tørk halen med kirurgisk gasbind dynket med 70% etanol.
- Hold fast halen og med skrå opp, forsiktig stikk nålen inn i en av sidehale årer og injisere cellesuspensjonen.
- Hold kirurgisk kompress på injeksjonsstedet inntil blødningen stopper før innføring av mus i et nytt rent bur.
5. Beregning av Omfang av BM kimerisme
MERK: kimerisme nivåene er vanligvis variabel i perifert blod på en uke etter BMT, og som sådan kimerisme nivåer er normalt beregnet til minst to uker etter BMT. Nivåer av Chimerism bør nå> 80% GFP + celler i perifert blod innen 3-4 uker etter BMT.
- Forbered FACS-buffer (2 mM EDTA + 2% føtalt bovint serum i PBS).
MERK: FACS-buffer kan lagres ved 4 ° C i flere uker. - Plasser musen i en begrensende rør og barbere pelsen på bakre bein å utsette den laterale saphenavene.
- Tynt strøk beinet med vaselin og pierce saphenavene med en 25 G nål.
- Samle omtrent 50 pl blod med heparin belagte kapillarrør. Legg blodet til et mikro-sentrifugerør inneholdende 1 ml FACS-buffer. Bland røret ved inversjon og lagre på is.
- Hold kirurgisk gasbind på injeksjonsstedet inntil blødningen stopper før retur musen tilbake til buret.
- Sentrifuger blodprøver i 5 min ved 900 x g. Fjern og kast supernatanten.
- Re-suspendere pellet i 500 mL av erytrocytt lysebuffer. Inkuber på is i 8,5 min.
- Tilsett 1 ml FACS-buffer for å slukke det lyserende buffer.
- Sentrifuger prøvene i 5 min ved 900 x g. Fjern og kast supernatanten.
- Utfør et sekund lyse skritt i 500 mL av erytrocytt Lysing buffer. Inkuber på is i 8,5 min.
- Tilsett 1 ml FACS-buffer for å slukke det lyserende buffer.
- Sentrifuger prøvene i 5 min ved 900 x g. Fjern og kast supernatanten. Sjekk at pelleten er nå hvit.
MERK: Hvis pellet fortsatt vises rødt, kan en ekstra lysetrinn være nødvendig før du fortsetter til neste trinn. - Re-suspendere pellet i en ml FACS buffer. Sentrifuger prøvene i 5 min ved 900 x g. Fjern og kast supernatanten.
- Re-suspendere pelleten i 300 ul FACS-buffer og kvantifisere GFP + -celler ved hjelp av strømningscytometri (NB: Ved dette punkt enhver ønsket farging av cellene kan utføres ved hjelp av standardteknikker, forut for flowcytometrisk analyse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Administrasjon av 60-100 mg / kg av busulfan er generelt godt tolerert av mus. Men dyrene vanligvis gå ned i vekt i løpet av kondisjoneringsfasen (~ 5-10%) og dermed dietten kan trenge å bli supplert med godbiter som bestråles solsikkefrø for å oppmuntre spise. Nivåer av kimerisme på> 80% GFP + celler i perifert blod og BM bør være gjennomgående oppnåelig ved bruk av 60 til 100 mg / kg busulfan 7. Vårt laboratorium har med hell brukt denne protokollen for å generere over 100 kimære mus med> 80% GFP + celler i perifert blod og BM, og nesten alle våre BMTS er vellykket når du bruker syngene givere og mottakere. Figur 1 viser nivåene av kimerisme kvantifisert ukentlig i perifert blod hos mus kondisjonert med 100 mg / kg busulfan mottar en vellykket syngenisk BMT (n = 3) og mus kondisjonert med 80 mg / kg busulfan mottar en mislykket allogen BMT (n = 3). Kimerisme nivåer> 80% er typically etablert av 3-4 uker etter BMT. Figur 2 er representative FACS data fra perifert blod viser en vellykkede og mislykkede BMT. Figur 3 viser at denne kimerisme forblir etablert i minst ett år i BM (n = 3), og at condition med bilen er ikke tilstrekkelig til å indusere BM kimerisme (n = 3). Mens det ikke er noen signifikant forskjell i nivåene av BM kimerisme oppnås ved hjelp av doser på 60-100 mg / kg busulfan, GFP + celler akkumulerer innen CNS på en doseavhengig måte. Dessuten er denne akkumulering dramatisk økt i neurodegenerative sykdommer slik som ALS 7. Figur 4 illustrerer GFP + celle akkumulering i korsryggen av ryggmargen i en villtype (n> 20) og ALS musemodell (n> 20).
Figur 1. Mottaker mus kondisjonertemed busulfan og transplantert med GFP + benmargceller fra en syngenisk donor oppnå et høyt nivå av vedvarende kimerisme i blodet. Ukentlige strømningscytometriske data som viser GFP + kimerisme i det perifere blod med hell transplanterte mus kondisjonert med 100 mg / kg av busulfan, etterfulgt av syngene benmargstransplantasjon (svart) og hell transplantert mus betinget med 80 mg / kg av busulfan fulgt av allogen benmargstransplantasjon (grå). Resultatene er midler fra n = 3 mus / gruppe, feilfelt representerer SEM.
Figur 2. Representative strømningscytometriske data som viser GFP + celler i perifert blod 3 uker etter benmargstransplantasjon hos mus kondisjonert med 100 mg / kg av busulfan. (A) spredningsplott som viser gating strategi, (B) et mislykket allogenEIC benmargstransplantasjon, og (C) en vellykket syngent benmargstransplantasjon. Resultatene er representative fra n> 3 mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative strømningscytometriske data som viser GFP + celler i benmargen ett år etter benmargstransplantasjon. (A) spredningsplott som viser gating strategi, (B) kjøretøykondisjone mus, og (C) 100 mg / kg Busulfan avkjølte mus. Resultatene er representative fra n = 3 mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Benmarg-celler avledet akkumuleres i CNS busulfan avkjølte mus som var gitt en benmargstransplantasjon. Immunhistokjemisk analyse av seksjoner av korsryggen i ryggmargen isolert fra (A, C) villtype mus og (B, D) sent sykdom stadium ALS mus. GFP + celler er vist i grønt. Resultatene er representative bilder fra n> 20 mus for hver modell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Busulfan kondisjone muliggjør generering av høyt nivå BM kimerisme i mus med hematopoetiske celler som er lett detekterbart. Denne kondisjonering kan utføres uten behov for bestrålingsanlegg. Videre er myelosuppresjon med de doser av busulfan skissert i denne protokollen godt tolerert, minimaliserer toksiske bivirkninger forårsaket av myeloablative doser av bestråling, og kan således være en mer egnet teknikk for å generere BM kimerisme i unge, gamle eller syke mus som er mer utsatt for myeloablativ bestråling. Noen RIC protokoller bruker lave, ikke-myleoablative doser av total kroppsbestråling for å minimalisere uønskede bivirkninger, men fremdeles krever disse protokollene bestrålings anlegg og, avhengig av dosen av bestråling, kan resultere i kimerisme nivåer som er lavere enn de som oppnås med busulfan conditioning 13. Nylig har treosulfan blitt brukt for BM condition 8,14. Som busulfan, treosulfan conditioning og BMT er i stand til å generere mus med en høy grad av kimerisme i BM 14. Imidlertid er treosulfan ikke lett oppnåelige i Nord-Amerika, og dosen av treosulfan som kreves for å oppnå sammenlignbare nivåer av kimerisme til busulfan kondisjone er betydelig høyere enn busulfan (~ 5 til 10 ganger) 14. Videre på disse effektive doser treosulfan ser ut til å ha mer giftige bivirkninger hos mus sammenlignet med busulfan (K. Peake, J. Manning, og C. Krieger, upubliserte observasjoner). Perifert blod kimerisme kan også etableres gjennom generasjon parabiotic mus, som innebærer kirurgisk knytte sirkulasjonen av en mottaker mus til en donor mus. I motsetning til hele BM transplantasjoner, tillater parabiosis for perifert blod kimerisme skal etableres i en mer fysiologisk måte uten å innføre BM-bundne stamceller inn i sirkulasjon, selv om parabiosis er en teknisk krevende prosedyre som bare resulterer i ~ 50% donorceller i peripheral blod mottaker mus 15.
Protokollen skissert her er avhengig av å bruke mottaker og giver mus som er samme kjønn, samt bruke syngene mottaker og giver musestammer, for å minimere muligheten for transplantasjon avvisning. Selv om mange egnede giver- og mottaker stammer er tilgjengelig kommersielt, etablere kimerisme i feilaktige allogen mus (dvs. signifikant forskjellig i MHC haplotype) kan være problematisk. I slike tilfeller hvor allogene mus er de eneste egnede mus tilgjengelig, bør en forstudie først utføres på en liten gruppe mus for å finne ut om busulfan condition er i stand til å føre til en høy grad av stabil kimerisme. Vi har hatt en viss suksess transplantere donor BMDCs isolert fra C57BL / 6-GFP mus inn C57BL / 6, SJL mottakere, selv om ikke alle transplanterte mus etablert vedvarende kimerisme (~ 30%). Tilsetningen av cyklofosfamid, et sterkt immunundertrykkende middel ofte used i forbindelse med busulfan klinisk 16, kan benyttes for å øke treffsikkerheten av de allogene transplantasjoner. Imidlertid, når C57BL / 6-GFP-celler ble transplantert inn i en trippel transgen musemodell for Alzheimers sykdom i en blandet C57BL / 6; 129 genetisk bakgrunn, busulfan og cyklofosfamid kondisjone var utilstrekkelig for å generere stabile BM kimærer (figur 2B), mens stabile innpoding var mulig etter dødelig bestråling. Således i situasjoner hvor allogene transplantasjoner er nødvendig, kan bestrålingen være en mer hensiktsmessig kondisjoneregime på grunn av den fullstendige myeloablasjon og alvorlig immunsuppresjon som oppstår.
Flere andre tiltak bør iverksettes for å maksimere kimerisme og konsistensen av denne protokollen. Det er avgjørende at ferske fortynninger av busulfan er forberedt for injeksjon, ideelt sett like før busulfan administrasjon, som styrken av busulfan ser ut til å bli redusert med langsiktiglagring. I tillegg, når triturering av BM til å dissosiere i cellene, er det viktig å gjøre det forsiktig for ikke å skade BM-celler. Selv om dette kan resultere i noen klumper av vev som ikke er fullstendig dissosiert, og dermed en noe lavere yield, den generelle helse og kvaliteten på de dissosierte cellene vil bli bedre. Likeledes bør eventuelle tiltak som krever re-suspensjon av pellet også gjøres forsiktig.
Høye nivåer av kimerisme konsekvent kan oppnås med 60, 80 og 100 mg / kg doser av busulfan 7 (figurene 1 - 3). Videre er det en dose-avhengig økning i akkumuleringen av GFP + celler i CNS av vill-type 8,9 og ALS mus 7. Vi og andre har også observert en økning i antall akkumulerende GFP + celler i CNS av musemodeller for nevrodegenerasjon, sammenlignet med villtype-mus 7,8,10. Dødelige strålings resulterer i et enda større antall GFP + BMDCs sammenlignet med 60-100 mg / kg doser av busulfan 7 selv om en fersk studie antyder at en myeloablativ dose busulfan (125 mg / kg) resultater i et høyere antall GFP + celler i hjernen i forhold til helkroppsbestråling 9. Bevis tyder på at BMDC inntreden i CNS til letalt bestrålte mus kan skyldes, i det minste delvis, til forstyrrelse av blod-hjerne-barrieren (BBB). Mens busulfan synes ikke å forstyrre BBB basert på fravær av serum proteiner (albumin) i CNS 11, busulfan er i stand til lett å krysse BBB 17,18, og således har det vært foreslått at busulfan kondisjone kan åpne opp nisje plass innenfor CNS som senere blir fylt av BMDCs 8. Interessant, resultatene av Wilkinson et al., Tyder på at de GFP + celler akkumulerer i CNS busulfan betinget mus på grunn av en kjemokin rekruttering mekanisme, mens GFP + celle-akkumulering i letalt bestrålte mus, synes å skyldes inflammatory mekanismer som genereres av bestråling i seg selv til 9. Treosulfan ser ikke ut til tilstanden CNS og dermed få GFP + celler ble funnet i CNS av treosulfan betinget mus 8. Det gjenstår å bli bestemt effekt forskjellige doser av busulfan kan ha på andre enn CNS vev, selv om busulfan er kjent for å målrette leveren, lunger og nyrer 6. Som busulfan kan betinge andre vev bør tas i betraktning når du velger en dose busulfan for nye eksperimenter.
Mens dette busulfan kondisjone protokollen er relativt enkel å utføre, er genereringen av mus med chimerisk BM et kraftig verktøy som kan brukes til å undersøke hematopoetiske celler. Den rekke av transgene mus som er kommersielt tilgjengelig, sammen med evnen til genetisk å bygge mus og BMDCs, øker dramatisk potensialet til denne protokollen. For eksempel ulike musemodeller eksisterer der GFP uttrykk er begrenset tilspesifikke celletyper og slektsnavn, som for eksempel CX3CR1-GFP mus som uttrykker GFP hovedsakelig i myelomonocytisk avstamning celler 19. Disse musene kan anvendes som donorer som muliggjør undersøkelse av spesifikke hematopoetiske cellepopulasjoner in vivo. En rekke forskjellige fluoroforer eksisterer også i tillegg til GFP, som kan brukes for å transplantere og overvåke BMDCs fra to (eller flere) forskjellige donorer, en teknikk som kan benyttes for konkurranseanalyser 20. Videre har en rekke forskjellige transgene musemodeller av sykdom eksisterer som kan bli anvendt som mottakere for å undersøke rollen til BMDCs i en rekke sykdommer. Etter transplantasjon, kan donorceller bli analysert ved hjelp av immunhistokjemi, eller isoleres ved hjelp av FACS, og undersøkt ved hjelp av en rekke biokjemiske teknikker. Videre kan avanserte bildeteknologier som to-foton mikros implementeres for live in vivo påvisning av fluoroforene som GFP 21. Til syvende og sist, deter tenkt at BMDCs kan bli genetisk konstruert og anvendt for å levere terapeutiske molekyler for å målrette vev så som CNS i Busulfan kondisjone mottakere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Busulfex | Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. | DIN 02240602 | Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines. |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239 (4837), 290-292 (1988).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).
- Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).
- Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).
- Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).
- Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8 (4), e60661 (2013).
- Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).
- Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).
- Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).
- Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8 (3), e58544 (2013).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77 (3), 661-669 (1991).
- Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).
- Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).
- Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).
- Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55 (1), 77-81 (1980).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).
