Busulfan som myelosuppressiva Agent för Generera Stabil högnivå Benmärg chimerism hos möss

Protocol

OBS: Etik Statement: Detta protokoll har granskats och godkänts av Animal Care kommittén Simon Fraser University (UACC; tillåta siffror 1037K-12 och 1060K-03) och är i överensstämmelse med den kanadensiska rådet om Djurvård, NIH Guide för vård och användning av försöksdjur, och EEG Rådets direktiv.

1. Särskilda överväganden

OBS: Busulfan är cytotoxiska. Hantera och kassera enligt det material säkerhetsdatablad och institutionens riktlinjer.

1. Utför alla tekniker aseptiskt i en huv med laminärt flöde.
2. Sterilisera instrument före användning genom att linda in ett lämpligt förpackningsmaterial, såsom ett skal paket, och autoklavering.
3. Medan risken för infektion är lägre med busulfan konditione jämfört med bestrålning, hanterar djur endast i ett laminärt flöde huva för de första 2 veckorna efter transplantation.

2. Behandling avMottagande möss

1. Späd busulfan till 3 mg / ml med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
   OBS: Det är viktigt att göra en ny utspädning av busulfan strax före användning varje dag injektion.
2. Administrera 20 mg / kg av utspädda busulfan till recipientmöss via IP injektion dagligen.
3. Upprepa dagliga ip injektioner av 20 mg / kg busulfan tills en total dos av 60 till 100 mg / kg har levererats (dvs, för en 80 mg / kg total dos, administrera 20 mg / kg av busulfan för fyra på varandra följande dagar).

3. Isolering av givarbenmärgsceller

OBS: Detta protokoll har framgångsrikt använts för att isolera och förbereda BM celler från upp till fem donatormöss. Vanligtvis cell avkastningen per mus är cirka 30 till 40.000.000 BMDCs, vilket är tillräckligt för att transplantera 12-16 mottagarmöss. Om fler donatormöss behövs protokollet kan behöva justeras i enlighet därmed.

1. Efter den sista dagen av busulfan konditione euthSKAPA en GFP donator mus (5:59 månader gamla) med _CO2 (eller genom annan dödshjälp förfarande accepteras på institution). För att undvika graft komplikationer använder syngena givare som är samma kön som mottagarna.
2. Spray mus med 70% etanol. Lyft huden på buken och använder kirurgisk sax göra ett snitt genom huden från bukhålan upp benet mot vristen. Håll foten, fast dra huden från vristen mot höften exponera benet vävnaden.
3. Trimma bort muskler och fettvävnad från lårbenet för att exponera höftleden.
4. Medan försiktigt dra på foten för att förlänga benet, tryck saxen mot höftleden. Klipp precis ovanför huvudet av lårbenet till att inte skära lårbenet själv.
5. För att bidra till att upprätthålla sterilitet, håll benet med foten och rengör eventuellt kvar vävnad från benen genom att gnida benet ytan med autoklave vävnader.
6. Separera lårbenet och skenbenet genom att skära genom knäleden ochPlacera lårbenet i en odlingsskål innehållande steril PBS. Inkubera på is.
7. Ta bort och kasta fibula genom att skära på de punkter där vadben ansluter till skenbenet. Placera tibia i kulturen skålen med lårbenet och inkubera på is.
8. Upprepa steg 3,2-3,7 för det andra benet, och vid behov, ytterligare donatormöss. Efter avlägsnande av ben, sterilisera kirurgiska verktyg med en varm pärla autoklav eller använda en ny uppsättning av sterila verktyg för de följande stegen.
9. För lårben, håll lårbenet med pincett och använda kirurgisk sax noggrant "rakning" distala ändarna av ben. Avlägsna så lite av benet som är nödvändigt för att exponera BM kaviteten.
10. Fyll en spruta med 3 ml sterilt PBS och bifoga en 23 G nål. Försiktigt bar nålen i BM hålighet och spola BM i en steril odlingsskål. Var noga med att skrapa märghålan med nålspetsen för att säkerställa avlägsnandet av alla önskade celler. Efter extraktion,se till att den röda BM inte längre syns och benet verkar nu vitt.
11. Upprepa steg från 3,9 till 3,10 för efterföljande lårben, pooling all BM i samma odlingsskål.
12. För tibiae, håll skenbenet med pincett och försiktigt "rakning" slutet där skenbenet var fäst vid knäet för att exponera BM kaviteten. Gör en andra snitt längs benet där det synliga röda BM slutar.
13. Fyll en spruta med 3 ml sterilt PBS och bifoga en 25 G nål. Försiktigt in nålen i BM hålrummet (från slutet som var kopplade till knäet) och spola BM i odlingsskål innehållande BM från lårbenet. Skrapa väggarna i BM kaviteten med nålen för att avlägsna alla celler. Efter utvinning, se till att den röda BM inte längre syns och benet verkar nu vitt.
14. Upprepa steg 3,12-3,13 för efterföljande skenben, pooling all BM i samma odlingsskål.
15. Försiktigt mal sönder BM med en 1 ml pipettspets att dissociera calnar.
16. Passera cellsuspensionen genom en 40 ^ M korg filter ner i en steril 50 ml centrifugrör. Skölj skålen med PBS för att få eventuella återstående celler och överför detta genom filtret i centrifugröret.
17. Centrifugera i 5 min vid 450 xg vid 4 ° C. Avlägsna och kassera supernatanten.
18. Åter avbryta pelleten i 3 ml erytrocyter lyseringsbuffert. Inkubera på is under 8,5 min.
19. Lägg ~ 30 ml sterilt PBS för att släcka den lyseringsbuffert.
20. Centrifugera i 5 min vid 450 xg vid 4 ° C. Avlägsna och kassera supernatanten.
21. Re-avbryta pelleten i 1 ml steril PBS. Håll på is.
22. Ta en liten alikvot av cellhomogenatet och späd med PBS (1: 100 för en mus, en: 200 för två möss, etc.) för att kvantifiera antalet celler med användning av en hemocytometer.
23. Späd cellsuspensionen till 8 x 10 ⁶ celler / ml och inkubera på is tills injektion.

4. benmärgstransplantation

1. Fill en 0,5 ml spruta (med en 28 G insulin nål) med 300 pl utspätt cellsuspensionen för varje mus som ska injiceras. Var noga med att ta bort eventuella luftbubblor i sprutan.
2. Placera musen buren innehållande de konditione mottagarmössen på en värmedyna och tillåta svansvenerna att vidga.
3. Ta en mottagare mus och plats i fasthållningsanordningen. Torka svansen med kirurgisk gasväv indränkt med 70% etanol.
4. Håll fast svansen och med avfasning upp, försiktigt in nålen i en av sido vener svans och injicera cellsuspensionen.
5. Håll kirurgisk gasväv på injektionsstället tills blödningen stannar före införandet musen i en ny ren bur.

5. Att uppskatta omfattning BM chimerism

OBS: chimerism nivåer är typiskt variabel i det perifera blodet vid en veckas efter BMT, och som sådan chimerism nivåer normalt bedöms vara minst 2 veckor post-BMT. Nivåer av chimerism bör nå> 80% GFP + celler i det perifera blodet inom 3-4 veckor efter BMT.

1. Bered FACS buffert (2 mM EDTA + 2% fetalt bovint serum i PBS).
   OBS: FACS buffert kan lagras vid 4 ° C under flera veckor.
2. Placera musen i en återhållande rör och raka pälsen på bakre benet för att exponera den laterala saphenusven.
3. Tunt päls benet med vaselin och pierce vena saphena med en 25 G nål.
4. Samla ca 50 pl blod med en heparinbelagda kapillärrör. Lägg blodet till en mikro-centrifugrör innehållande 1 ml FACS-buffert. Blanda röret genom inversion och förvara på is.
5. Håll kirurgisk gasväv på injektionsstället tills blödningen stannar innan han återvände musen tillbaka till buren.
6. Centrifugera blodprover under 5 min vid 900 x g. Avlägsna och kassera supernatanten.
7. Åter avbryta pelleten i 500 fil erytrocyt lyseringsbuffert. Inkubera på is under 8,5 min.
8. Tillsätt 1 ml FACS-buffert för att släcka lyseringsbuffert.
9. Centrifugera proverna under 5 min vid 900 x g. Avlägsna och kassera supernatanten.
10. Utför en andra lys steg 500 pl erytrocyt lysebuffert. Inkubera på is under 8,5 min.
11. Tillsätt 1 ml FACS-buffert för att släcka lyseringsbuffert.
12. Centrifugera proverna under 5 min vid 900 x g. Avlägsna och kassera supernatanten. Kontrollera att pelleten är nu vitt.
    OBS: Om pellets verkar fortfarande rött, kan en ytterligare lys steg behövas innan man går vidare till nästa steg.
13. Re-avbryta pelleten i 1 ml FACS buffert. Centrifugera proverna under 5 min vid 900 x g. Avlägsna och kassera supernatanten.
14. Återsuspendera pelleten i 300 | il FACS-buffert och kvantifiera GFP + celler med användning av flödescytometri (OBS: Vid denna punkt kan utföras varje önskad immunfärgning av cellerna, med användning av standardtekniker, före flödescytometrisk analys).

Representative Results

Administreringen av 60-100 mg / kg av busulfan tolereras i allmänhet väl av möss. Men djuren förlorar vanligtvis vikt under konditionefasen (~ 5-10%) och därmed dieten kan behöva kompletteras med godsaker såsom bestrålade solrosfrön för att uppmuntra att äta. Nivåer av chimerism av> 80% GFP + celler i det perifera blodet och BM bör vara ständigt kan uppnås med användning av 60 till 100 mg / kg busulfan ^7. Vårt laboratorium har framgångsrikt använt detta protokoll för att generera över 100 chimär möss med> 80% GFP + celler i perifert blod och BM, och praktiskt taget alla våra BMTS är framgångsrika när syngena givare och mottagare. Figur 1 visar halterna av chimerism kvantifierade vecko i perifert blod hos möss rade med 100 mg / kg busulfan emot en lyckad syngen BMT (n = 3) och möss rade med 80 mg / kg busulfan erhåller ett misslyckat allogen BMT (n = 3). Chimerism nivåer> 80% är typically fastställts av 3-4 veckor efter BMT. Figur 2 är representativa FACS data av perifert blod visar en framgångsrik och misslyckad BMT. Figur 3 visar att detta chimerism förblir fastställts för minst ett år i BM (n = 3), och att konditionering med fordonet inte är tillräcklig för att framkalla BM chimerism (n = 3). Det finns inga signifikanta skillnader i nivåerna av BM chimerism uppnås med doser på 60-100 mg / kg busulfan, GFP + celler ansamlas i CNS på ett dosberoende sätt. Dessutom är denna ansamling dramatiskt ökat i neurodegenerativa sjukdomar som ALS ^7. Figur 4 illustrerar GFP + cellackumulering inuti den lumbala regionen av ryggmärgen i en vildtyp (n> 20) och ALS musmodell (n> 20).

Figur 1. Mottagande möss rademed busulfan och transplanteras med GFP + benmärgsceller från en syngent donator uppnå en hög nivå av ihållande chimerism i blodet. Vecko flödescytometriska data som visar GFP + chimerism i perifert blod framgångsrikt transplanterade möss rade med 100 mg / kg av busulfan följt av syngena benmärgstransplantation (svart) och misslyckat transplanterade möss rade med 80 mg / kg av busulfan följt av allogen benmärgstransplantation (grå). Resultaten är medelvärden från n = 3 möss / grupp, felstaplar representerar SEM.

Figur 2. Representativa flödescytometriska data som visar GFP + celler i perifert blod 3 veckor efter benmärgstransplantation i möss konditionerade med 100 mg / kg av busulfan. (A) Scatterplot visande grind strategi, (B) ett misslyckat AllogenEIC benmärgstransplantation, och (C) en framgångsrik syngen benmärgstransplantation. Resultaten är representativa från n> 3 möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Representativa flödescytometriska data som visar GFP + celler i benmärgen ett år efter benmärgstransplantation. (A) Scatterplot visande grind strategi, (B) rade fordons möss, och (C) 100 mg / kg busulfan rade möss. Resultaten är representativa från n = 3 möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Benmärgs härledda celler ansamlas i CNS av busulfan rade möss som fått en benmärgstransplantation. Immunohistokemisk analys av delar av ländryggen i ryggmärgen isolerad från (A, C) vildtypsmöss och (B, D) sen sjukdoms stage ALS-möss. GFP + celler visas i grönt. Resultaten är representativa bilder från n> 20 möss för varje modell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Busulfan konditione möjliggör generering av högnivå BM chimerism i möss med hematopoetiska celler som är lätt kan upptäckas. Denna konditione kan utföras utan behov av strålningsanläggningarna. Dessutom är myelosuppression med doser av busulfan beskrivs i detta protokoll tolererades väl, minimerar toxiska biverkningar orsakade av myeloablativa doser av strålning, och därmed kan vara en mer lämplig teknik för att generera BM chimerism i unga, gamla, eller sjuk möss som är mer mottagliga för myeloablativ bestrålning. Vissa RIC protokoll använda låga, icke-myleoablative doser av helkroppsbestrålning för att minimera de negativa bieffekter, men dessa protokoll kräver fortfarande bestrålningsanläggningar och, beroende på dosen av strålning, kan resultera i chimerism nivåer som är lägre än vad som kan uppnås med busulfan konditionering ^13. Nyligen har treosulfan använts för BM konditione ^8,14. Liksom busulfan, treosulfan conditioning och BMT kan generera möss med en hög grad av chimerism i BM ^14. Dock är treosulfan inte lätt uppnås i Nordamerika, och dosen av treosulfan krävs för att uppnå jämförbara nivåer av chimerism till busulfan konditione är betydligt högre än busulfan (~ 5-10 gånger) ^14. Dessutom vid dessa effektiva doser treosulfan verkar ha mer toxiska biverkningar hos möss jämfört med busulfan (K. Peake, J. Manning, och C. Krieger, opublicerade observationer). Perifert blod chimerism kan också fastställas genom generering av parabiotic möss, vilket innebär kirurgiskt länka cirkulationen av en mottagare mus till en donator mus. Till skillnad från hela BM transplantationer, medger parabiosis för perifert blod chimerism som skall fastställas i ett mer fysiologiskt sätt utan att införa BM-begränsade progenitorceller i cirkulationen, även om parabiosis är en tekniskt utmanande procedur som bara resulterar i ~ 50% donatorceller i peripheral blod mottagarens möss ^15.

Det protokoll som beskrivs här bygger på att använda mottagande och donatormöss som är samma kön, samt att använda syngena mottagare och donator musstammar, för att minimera risken för transplantatavstötning. Även om många lämpliga givar- och mottagarländer stammar är tillgängliga i handeln, upprättande chimerism i inkompatibla allogen möss (dvs skiljer sig avsevärt i MHC haplotyp) kan vara problematiskt. I sådana fall där allogena möss är de enda lämpliga möss tillgängliga, bör en förstudie först utföras på en liten grupp av möss för att avgöra om busulfan konditione kan leda till en hög grad av stabil chimerism. Vi har haft viss framgång transplantera givar BMDCs isolerade från C57BL / 6-GFP möss i C57BL / 6, SJL mottagare, även om inte alla transplanterade möss etablerade ihållande chimerism (~ 30%). Tillsatsen av cyklofosfamid, en stark immunsuppressivt medel ofta used i samband med busulfan kliniskt ^16, kan användas för att förbättra resultaten av de allogena transplantationer. Men när C57BL / 6-GFP-celler transplanterades in i en trippel transgen musmodell av Alzheimers sjukdom på ett blandat C57BL / 6; 129 genetisk bakgrund, busulfan och cyklofosfamid konditione var otillräckliga för att generera stabila BM chimärer (figur 2B), medan stabil engraftment var möjligt efter dödlig bestrålning. Således, i situationer där det krävs allogen transplantation, kan bestrålning vara en lämpligare förberedande behandlingen på grund av den fullständiga myeloablation och svår immunsuppression som uppstår.

Flera ytterligare åtgärder bör vidtas för att maximera chimerism och konsekvens av detta protokoll. Det är avgörande att färska utspädningar av busulfan är förberedda för injektion, helst strax före busulfanadministreringen, eftersom styrkan av busulfan tycks minska med långtidslagring. Dessutom, när triturering av BM att dissociera cellerna, är det viktigt att göra det mjukt för att inte skada BM-celler. Även om detta kan leda till att vissa klumpar av vävnad som inte är fullständigt dissocierade, och följaktligen en något lägre utbyte, den allmänna hälsan och kvaliteten hos de dissocierade cellerna kommer att bli bättre. Likaså bör alla åtgärder som kräver resuspension av pellets också göras försiktigt.

Höga nivåer av chimerism kan konsekvent uppnås med 60, 80 och 100 mg / kg doser av busulfan ⁷ (figur 1 - 3). Det finns dessutom en dosberoende ökning i ackumulering av GFP + celler i CNS av vildtyp ^8,9 och ALS möss ^7. Vi och andra har också observerat en ökning av antalet ackumulera GFP + celler i CNS av musmodeller av neurodegeneration jämfört med vildtypsmöss ^7,8,10. Dödlig bestrålning resulterar i ett ännu större antal av GFP + BMDCs jämfört med 60-100 mg / kg doser av busulfan ⁷ även om en färsk studie visar att en myeloablativa dos busulfan (125 mg / kg) resulterar i ett högre antal GFP + celler i hjärnan jämfört med helkroppsbestrålning ^9. Uppgifter tyder på att BMDC inträde i CNS hos letalt bestrålade möss kan bero, åtminstone delvis, till störning av blod-hjärnbarriären (BBB). Medan busulfan inte verkar störa BBB baserat på frånvaron av serumproteiner (albumin) inom CNS ^11, är i stånd att lätt passera BBB ^17,18 busulfan och därmed har det föreslagits att busulfan konditionering kan öppna upp nisch utrymme inom CNS som därefter fylls av BMDCs ^8. Intressant resultaten av Wilkinson et al. Tyder på att GFP + celler ansamlas i CNS av busulfan rade möss på grund av en kemokin rekryteringsmekanism medan GFP + cellansamling i dödligt bestrålade möss tycks bero på inflammatory mekanismer som genereras av bestrålningen själv ^9. Treosulfan verkar inte konditionera CNS och följaktligen få GFP + celler hittades i CNS av treosulfan rade möss ^8. Det återstår att bestämmas effekt olika doser av busulfan kan ha på andra än CNS vävnader, även busulfan är känd för att rikta lever, lungor och njurar ^6. Att busulfan kan betinga andra vävnader bör tas i beaktande när man väljer en dos busulfan för nya experiment.

Även om detta busulfan konditione protokollet är relativt enkel att utföra, är den generation av möss med chimär BM ett kraftfullt verktyg som kan användas för att undersöka hematopoetiska celler. Det breda utbudet av transgena möss kommersiellt tillgängliga, tillsammans med förmågan att genetiskt ingenjör möss och BMDCs, ökar dramatiskt potentialen i detta protokoll. Till exempel finns olika musmodeller där GFP uttryck är begränsat tillspecifika celltyper och härstamningar, såsom CX3CR1-GFP möss som uttrycker GFP främst myelomonocytiska härstamningsceller ^19. Dessa möss kan användas som donatorer som möjliggör undersökning av specifika hematopoetiska cellpopulationer in vivo. Ett antal olika fluoroforer finns även i tillägg till GFP, som kan användas för att transplantera och övervaka BMDCs från två (eller fler) skilda givare, en teknik som kan användas för konkurrensanalyser ^20. Vidare finns det ett antal olika transgena musmodeller av sjukdomar som kan användas som mottagare för att undersöka rollen av BMDCs i en mängd olika störningar. Efter transplantation, kan donatorceller analyseras med immunohistokemi, eller isoleras genom FACS och undersöktes med hjälp av en rad biokemiska tekniker. Dessutom kan avancerade bildbehandlingsteknik såsom två-foton mikroskopi implementeras för live in vivo upptäcka fluoroforer såsom GFP ^21. Slutligen är detförutses att BMDCs kunde manipuleras genetiskt och användas för att leverera terapeutiska molekyler till målvävnader såsom CNS i busulfan-rade mottagare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Busulfex	Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.	DIN 02240602	Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01	Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020