Protocol
注：伦理学声明：此协议已审查和批准由西蒙·弗雷泽大学的动物护理委员会（UACC;允许数字1037K-12和1060K-03），并符合加拿大议会动物保育，美国国立卫生研究院指南护理和使用实验动物，以及EEC理事会指令。
1.特别注意事项
注：白消安是细胞毒性。处理并根据材料安全数据表和制度规定进行处置。
- 执行所有的技术在无菌层流罩。
- 消毒通过包装在合适的包装材料，诸如剥离封装，并高压灭菌，使用前的仪器。
- 而相比于照射为感染的风险是低带马利兰调节，仅在层流罩的前2周后移植处理的动物。
2.调理受体小鼠
- 稀马利兰至3毫克/毫升，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
注意：为了让新鲜稀释至白消安注射液使用的每一天之前是很重要的。 - 日常管理20毫克/公斤的白消安稀释到受体小鼠通过IP注射。
- 重复的20毫克/千克马利兰每日IP注射，直到60-100毫克总剂量/千克已经交付（ 即，对于一个80毫克/公斤的总剂量，给药白消安，连续4天的20毫克/千克）。
3.隔离供体骨髓细胞的
注：此协议已被成功地用于从最多5供体小鼠中分离和制备BM细胞。通常每只小鼠的细胞产量是约30-40百万DC培养上清，这足以移植12-16受体小鼠。如果需要更多的供体小鼠中的协议可能需要作相应调整。
- 继白消安空调euth的最后一天anize使用的CO 2与GFP供体小鼠（1至6个月大）（或通过在接纳机构其他安乐死过程）。为了避免移植并发症使用同基因供体是同性的收件人。
- 喷小鼠用70％的乙醇。升降机皮肤在腹部，并使用外科剪刀通过从腹腔向上朝向脚踝腿部皮肤做一个切口。握住脚，坚决从拉向臀部露出腿部组织脚踝的皮肤。
- 修剪掉肌肉和脂肪组织从股骨以暴露髋关节。
- 同时轻轻拉动脚伸腿，按压髋关节的剪刀。剪刚股骨，注意不要切股骨本身的头上。
- 为了帮助保持无菌，由脚抱腿和摩擦骨表面灭菌组织清理从骨子里任何剩余的组织。
- 通过在膝关节切削分离股骨和胫骨和放置在含有无菌PBS培养皿股骨。在冰上孵育。
- 取出并削减在那里的腓骨连接到胫骨点丢弃腓骨。将胫骨在培养皿与股骨和在冰上孵育。
- 对于另一条腿重复步骤3.2-3.7，并在必要时，附加的供体小鼠。下面除去的骨头，消毒的外科手术工具用热珠灭菌或使用一组新的无菌工具用于随后的步骤。
- 对于股骨，抱钳股骨，用手术剪刀仔细地'刮'的远端脱骨。去除尽可能少，以暴露骨髓腔必要的骨。
- 填充用3毫升无菌PBS的注射器，并附加一个23政针。仔细孔针插入BM腔冲洗BM到无菌培养皿。一定要凑髓腔用针点，以保证除去所有需要的细胞。以下提取，确保红色BM不再可见和骨现在显示为白色。
- 随后的股骨重复步骤3.9-3.10，汇集所有的BM在同一培养皿。
- 为胫骨，保持胫骨钳，并仔细'剃须'，其中所述胫骨附着到膝盖以暴露骨髓腔的末端。使沿其中可见红色BM结束骨第二晋级。
- 填用3ml无菌PBS的注射器，并附加一个地下25针。轻轻插入针头插入骨髓腔（从附着到膝盖该端），并刷新BM到从股骨含有BM培养皿。刮去骨髓腔的壁与针以除去所有的细胞。以下提取，确保红色BM不再可见和骨现在显示为白色。
- 随后的胫骨，重复步骤3.12-3.13，汇集所有的BM在同一个培养皿。
- 轻轻磨碎的BM与1毫升枪头分离的CELLS。
- 通过40μM过滤器篮的细胞悬浮到无菌50mL离心管中。冲洗用PBS菜获取任何剩余的细胞，并通过过滤器转移到这一点的离心管中。
- 离心5分钟，在450×g离心在4℃下。取出并弃去上清液。
- 重悬在3ml红细胞裂解缓冲液沉淀。在冰上孵育8.5分钟。
- 加约30毫升无菌PBS中以猝灭裂解缓冲液中。
- 离心5分钟，在450×g离心在4℃下。取出并弃去上清液。
- 重新悬浮于1ml无菌PBS的沉淀。保持在冰上。
- 取一小等分试样的细胞匀浆和稀释用PBS（1：100 1小鼠; 1：200为2小鼠等）使用血细胞计数器来量化细胞数。
- 稀释细胞悬液，以8×10 6个细胞/ ml，并在冰上孵育直至注射。
4.骨髓移植
- 网络连接LL 0.5ml注射器（用28克胰岛素针）用300微升稀释的细胞悬浮液对每个小鼠进行注射。一定要消除存在于注射器任何气泡。
- 上放置装有一个加热垫的空调受体小鼠鼠笼并允许尾静脉扩张。
- 就拿收件人鼠标和地方约束装置。擦拭用外科纱布浸透70％乙醇的尾部。
- 牢固地保持在尾部，并与斜面向上，轻轻插入针头插入的侧面尾静脉中的一个，并注入该细胞悬浮液。
- 保持手术纱布在注射部位，直到前引入鼠标到一个新的干净的笼子出血停止。
5.估计BM嵌合体的程度
注：嵌合体的水平是在外周血典型变量1周后的骨髓移植，因此嵌合体的水平，通常估计在至少2周后的骨髓移植。詹水平erism应达到> 80％的GFP +细胞在外周血3-4周内后骨髓移植。
- 制备FACS缓冲液（2mM EDTA的+ 2％胎牛血清的PBS血清）。
注：FACS缓冲液可以储存在4℃几周。 - 鼠标放置在一个约束管刮胡子的皮毛上的小腿后侧暴露侧隐静脉。
- 薄外套凡士林和皮尔斯隐静脉将25g针头的腿。
- 收集大约50微升血液与肝素涂层的毛细管。加血液至含有1ml的FACS缓冲液中的微离心管中。混合管通过倒置并储存在冰上。
- 按住注射部位的手术纱布，直到出血停止返回鼠标回到笼子前。
- 离心血液样品5分钟，在900×g下。取出并弃去上清液。
- 重悬在500μl的红细胞裂解缓冲液沉淀。在冰上孵育8.5分钟。
- 加入1毫升的FACS缓冲液，淬灭裂解缓冲液中。
- 离心样品5分钟，在900×g下。取出并弃去上清液。
- 执行在500μl的红细胞裂解缓冲液的第二裂解步骤。在冰上孵育8.5分钟。
- 加入1毫升的FACS缓冲液，淬灭裂解缓冲液中。
- 离心样品5分钟，在900×g下。取出并弃去上清液。检查球现在是白色的。
注意：如果该粒料仍然出现红色，附加的裂解步骤可能需要在进行下一步骤之前。 - 重新悬浮于1ml FACS缓冲液沉淀。离心样品5分钟，在900×g下。取出并弃去上清液。
- 重悬在300微升FACS缓冲液将沉淀，并使用流式细胞术定量的GFP +细胞（注意：在这一点上可进行该细胞的任何期望的免疫染色，使用标准技术，前流式细胞仪分析）。
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Representative Results
60-100毫克/公斤白消安是普遍受到老鼠的耐受性。然而，动物通常在调节阶段（〜5-10％），因此饮食减肥可能需要与对待诸如照射葵花籽鼓励饮食进行补充。 > 80％的GFP +细胞在外周血嵌合和BM的水平应始终实现使用60-100毫克/公斤马利兰7。我们的实验室已成功地利用这个协议产生超过100嵌合体小鼠> 80％GFP +细胞在外周血和骨髓，几乎我们所有的BMTs使用同基因捐献者和接受者的时候是成功的。 图1显示了嵌合体的水平量化周报在空调用100mg / kg的二甲磺酸丁酯的小鼠的接收成功的同基因骨髓移植的外周血（N = 3）和空调用80毫克/公斤马利兰小鼠接收一个不成功的同种异体骨髓移植（N = 3）。嵌合体水平> 80％的。典型ý3-4周，建立后骨髓移植。 图2是外周血表示成功和不成功的BMT代表性的FACS数据。 图3示出了此嵌合保持在骨髓建立至少一年（N = 3），和该空调用车辆不足以诱导骨髓嵌合体（N = 3）。虽然在骨髓嵌合体的水平没有显著差异使用剂量的60-100毫克/公斤白消安，GFP +细胞积聚在CNS内以剂量依赖的方式来实现。此外，这种积累显着地在神经变性疾病如ALS 7增加。 图4示出了脊髓的腰部区域内的GFP +细胞的积累，以野生型（n> 20）和ALS小鼠模型（N> 20）。
空调图1.受鼠用白消安和移植了GFP +骨髓细胞从同基因供体达到血液中持续嵌合的高水平。每周流式细胞数据表示在空调用100mg / kg的二甲磺酸丁酯的成功移植的小鼠的外周血的GFP +嵌合随后同系骨髓移植（黑色）和不成功移植小鼠空调用80毫克/千克的二甲磺酸丁酯后同种异体骨髓移植（灰色）。结果是，从N = 3只小鼠/组装置，误差棒表示SEM。
图2.代表性流式细胞数据表示的GFP +细胞在外周血骨髓移植3周后在空调用100mg / kg的白消安（A）的散点图示出选通策略，（B）一种不成功allogen 小鼠EIC骨髓移植，和（C）的一个成功的同基因骨髓移植。结果代表来自N> 3只小鼠。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.代表性流式细胞数据表示的GFP +细胞，在1年后的骨髓的骨髓移植。 （A）中示出散点图门控策略，（B）的车辆空调的小鼠，和（C）100毫克/千克马利兰空调小鼠。结果代表来自N = 3只小鼠。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.骨髓来源的细胞积聚在CNS给予骨髓移植马利兰空调只小鼠。脊髓由（A，C）的野生型小鼠和（B，D）的后期隔绝腰部区域的部分的免疫组织化学分析疾病分期ALS小鼠。 GFP +细胞被显示为绿色。结果代表图像从N> 20只为每个模型。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
马利兰调理允许高层骨髓嵌合小鼠造血细胞是容易检测的产生。可以无需照射设施来执行此调节。此外，骨髓抑制与剂量在这个协议中概述马利兰的耐受性良好，最小化毒副作用引起的清髓性剂量的辐射，并因此可能是一个更合适的技术，以产生BM嵌合在年轻的，年老，或患病的小鼠更容易清髓性照射。一些RIC协议使用低的，非myleoablative剂量全身照射，以尽量减少不良副作用，但这些协议仍然需要照射设施，并根据照射的剂量，可能会导致嵌合体的水平，比那些达到的马利兰低级空调13。最近，苏消安已用于BM调理8,14。像白消安，苏消安conditioning和骨髓移植是能够产生小鼠中的BM 14高度嵌合的。但是，苏消安不是北美容易实现的，并实现嵌合到马利兰调理的可比水平所需苏消安的剂量比白消安（〜5-10倍）14显著高。此外，在苏消安似乎有较白消安小鼠更毒副作用（K.皮克，J·曼宁和C.克里格，未发表意见），这些有效剂量。外周血嵌合，也可以通过产生连体小鼠，这涉及到手术接受者小鼠的循环链接到一个供体小鼠的建立。不像全骨髓移植，联体允许外周血嵌合而不引入的BM-限制性祖细胞到血液循环，以建立在一个更符合生理的方式，虽然联体是一个技术挑战过程仅导致约50％的供体细胞在围该受体小鼠15 pheral血。
这里所概述的协议依赖于使用受体和供体小鼠是相同性别，以及使用同基因受体和供体小鼠品系中，为了最大限度地减少移植排斥的可能性。虽然许多合适的供体和受体菌株是市售的，在不匹配的同种异体小鼠建立嵌合（ 即，在MHC单倍型显著不同）可以是有问题的。在这样的情况下，同种异基因小鼠是唯一可用的合适的小鼠，进行初步研究应首先进行在一个小组小鼠，以确定是否马利兰调理能够引起稳定的嵌合状态的程度高。我们已经取得了一些成功移植供体的BMDCs分离C57BL / 6小鼠GFP到C57BL / 6; SJL收件人，但并非所有移植小鼠建立持续的嵌合体（〜30％）。加环磷酰胺，一个强大的免疫抑制剂往往üsed的与马利兰临床16相结合，可以用来改善同种异体移植的成功率。然而，当只C57BL / 6-GFP的细胞移植到阿尔茨海默病的三重转基因小鼠模型上的混合的C57BL / 6; 129遗传背景，白消安和环磷酰胺调理不足以产生稳定的骨髓嵌合体（ 图2B），而稳定植入可能是致命的如下照射。因此，在同种异基因移植的需要的情况下，照射可以是更合适的预处理方案由于发生的完整myeloablation和严重免疫抑制。
应采取以最大限度此协议的嵌合体和一致性一些额外的措施。至关重要的是，白消安的新鲜稀释液注射制备，理想地刚好在给予二甲磺酸丁酯，如白消安的效力似乎减少长期存储。此外，捣碎的BM以解离细胞时，它这样做轻轻以免损坏BM细胞是重要的。虽然这可能会导致组织的一些团块未完全解离，因此稍低收率离解的细胞，整体健康和质量会更好。同样地，需要重新悬浮沉淀的任何步骤也应轻轻完成。
高水平的嵌合体可以一致地获得具有60，80和100毫克/公斤剂量的白消安7（ 图1 - 3）。此外，还有一个剂量依赖性增加的GFP +细胞的野生型8,9和ALS小鼠7的中枢神经系统的积累。我们和其他人也观察到增加累积的神经变性的小鼠模型中的GFP +细胞在CNS内相比野生型小鼠7,8,10的数目。致死辐照导致更大数量的GFP + BM的的DCs相比60-100毫克/公斤的剂量马利兰7虽然最近的一项研究表明，一个清髓性剂量的白消安（125毫克/千克）的结果在许多GFP +细胞的更高的脑相比全身照射9。有证据表明，BMDC进入致死剂量照射小鼠的中枢神经系统可能是由于，至少部分地对血 - 脑屏障（BBB）的中断。而白消安不会出现基于所述无血清蛋白（白蛋白）的中枢神经系统11内的破坏血脑屏障，白消安是能够容易地穿过BBB 17,18，因此它已被提出，马利兰调理可在开放空间利基该随后填充的BMDCs 8中枢神经系统。有趣的是，威尔金森等人的研究结果表明，将GFP +细胞积聚在马利兰空调小鼠的中枢神经系统，由于趋化因子的招聘机构，而在致死剂量照射小鼠的GFP +细胞的积累看来是由于inflammator通过照射本身9生成的y的机制。苏消安不会出现以调节中枢神经系统，因此很少的GFP +细胞，苏消安空调小鼠8的中枢神经系统中发现的。它仍有 待确定的效果不同剂量的白消安可能对组织比其他中枢神经系统，虽然白消安已知靶向肝脏，肺，肾脏和6。那白消安可以调节其它组织应当选择马利兰新实验的剂量来考虑。
虽然这种马利兰调理协议相对简单执行，小鼠骨髓嵌合的产生是可用于研究造血细胞的有力工具。广泛市售的转基因小鼠，随着能力的基因工程小鼠的BMDCs的，显着地提高了该协议的潜力。例如，各种小鼠模型存在，其中GFP表达被限制为这主要是表达GFP在骨髓单核细胞谱系细胞19特定的细胞类型和谱系，如CX3CR1-GFP小鼠。这些小鼠可作为供体，允许在体内特定造血细胞群的调查。许多不同的荧光团也存在于除绿色荧光蛋白，可用于以移植，并从两个（或更多）不同的供体监视DC培养上清，即可用于竞争测定法20的技术。此外，存在许多不同疾病的转基因小鼠模型的，可以用来作为受体来调查DC培养上清中的各种病症的作用。移植后，供体细胞可以通过免疫组织化学进行分析，或通过FACS分离，并使用各种生化技术研究。此外，先进的成像技术，如双光子显微镜可以用于活体内检测的荧光团，如绿色荧光蛋白21的实现。最终，它可以想象到的是DC培养上清可遗传工程和用于递送治疗分子靶向于白消安空调接受者组织如中枢神经系统。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Busulfex | Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. | DIN 02240602 | Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines. |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 |
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