Abstract
Mange progressive neurologiske sygdomme hos mennesker, såsom epilepsi, kræver prækliniske dyremodeller, der langsomt udvikler sygdommen for at teste interventioner på forskellige stadier af sygdommen proces. Disse dyremodeller er særligt vanskelige at gennemføre i umodne gnavere, en klassisk model organisme til laboratorieundersøgelse af disse lidelser. Optagelse kontinuerlig EEG hos unge dyremodeller af anfald og andre neurologiske lidelser udgør en teknisk udfordring på grund af den lille fysiske størrelse af unge gnavere og deres afhængighed af dæmningen før fravænning. Derfor er der ikke kun et klart behov for at forbedre præklinisk forskning, der bedre vil identificere disse behandlingsformer er egnede til oversættelse til klinikken, men også behov for nye enheder kan optage kontinuerlige EEG i umodne gnavere. Her beskriver vi teknologien bag og demonstrere brugen af en roman miniature telemetri-system, specielt udviklet til brug i umodne rotter or mus, hvilket også er effektive til anvendelse i voksne dyr.
Introduction
Den ældste - og stadig den mest anvendte - teknik til optagelse biopotentialer i hjernen er elektroencefalografi (EEG). Det bruges klinisk til neurologiske abnormiteter, herunder beslaglæggelse afsløring 1, lokalisering af beslaglæggelse foci 2, og diagnosticering af hjernerystelse 3,4. Denne teknik er også almindeligt anvendt til at give grundlæggende information om mekanismerne i søvn og til at diagnosticere søvnforstyrrelser 5,6.
Som i den kliniske diagnose af epilepsi, er EEG blevet uundværlig for translationel forskning i dyremodeller af både genetiske og erhvervede epilepsi. I de nuværende forskningsansøgninger, "wired" eller "tøjrede" optagelser er standard, og rutinemæssigt udføres i voksne gnavere i ugevis ad gangen 7. Men elektrisk støj, bevægelse artefakter, og risikoen for, at tøjret dyr vil skade sig selv ved at trække i kablet har lange kompromised disse eksperimenter. Således at forbedre eksperimentelle betingelser og succesrater, er vi nødt til at udvikle nye teknologier, som vil give mulighed for eliminering af kablede grænseflade mellem dyret og instrumentering. Den mest oplagte udviklingsområde er design og implementering af telemetri-systemer, der giver mulighed for høj kvalitet optagelser, og samtidig opretholde en lang levetid og minimere ubehag for animalske emner. Reduktion den fysiske størrelse af disse enheder vil gøre det muligt translationel forskning i neonatale og unge gnavere modeller af neurologiske lidelser.
Lave kanal-count EEG optagelser i rotter er ansat i udstrakt grad til at udvikle nye behandlingsformer til at undertrykke epileptiske anfald i stand til oversættelse til mennesker. Optagelser fra et eller flere steder i en længere periode åbne mange muligheder for at anvende gnavermodeller for epilepsi i translationel forskning. Meget af den moderne forskning på dette område har til formål at blokere forekomsten af kronisk seizninger eller udvikling af epilepsi (dvs. epileptogenese), og sådanne forskningsindsats kræver omfattende hvis ikke kontinuerlig EEG overvågning for at analysere effektiviteten af den foreslåede terapi 8; en lille, enkel, telemetrisk system, med en, to eller fire kanaler opererer mellem 0,1-100 Hz per kanal vil kraftigt fremme denne form for translationel forskning. Elektrografiske anfald ofte forekomme med minimale adfærd (sikkert uden kramper), hvilket begrænser nytten af assays baseret på adfærdsmæssige anfald. Strategien med at kombinere EEG optagelse og samtidig videoovervågning tillader en mulighed for at indfange hver beslaglæggelse; og desuden kan disse analytiske tilgange tillader kvantitativ vurdering af interictal- pigge, som opstår i den epileptiske hjernen mellem "iktal" (eller beslaglæggelse) begivenheder 9. Endvidere evnen til at opnå kontinuerlig høj kvalitet, lave artefakt EEG optagelser, for hvilke den trådløse teknologi er genereltoverlegen, vil give mulighed for udvikling af brugen af edb-baserede algoritmer til at studere specifikke EEG-kurver (f.eks theta, gamma), såvel som automatisk registrering af anfald, en markant reduktion arbejdsbyrde forsøgslederen.
Den primære prækliniske model til undersøgelse af kronisk epilepsi efter hjerneskade er den voksne rotte eller mus, enten via en kemo-konvulsiv (dvs. kainsyre eller pilocarpin) eller elektrisk induceret status epilepticus (SE), som er efterfulgt af kronisk epilepsi. Under disse betingelser, kan de alvorlige kramper forbundet med SE eller de efterfølgende anfald hos de epileptiske dyr føre til skade fra dyret rive eller trække i tøjret og løsne skruerne, der opretholder fastgørelsen af headcap. I sidste ende, er det dette problem, der normalt ophæver disse eksperimenter, og alligevel er behov for at opnå langsigtede høj opløsning EEG registreringer for eksperimenter der sigter mod at udvikle nye behandlingsmetoder til kroniskeepilepsi er altafgørende. Derudover, bolig, overvågning og analyse af data fra en langsigtet implanterede dyr er en betydelig investering i både direkte omkostninger og investigator tid; Derfor kan for tidlig afslutning af forsøget resultere i betydelige omkostninger for forskerne. Da disse modeller for epilepsi fremskridt, som regel anfaldene bliver hyppigere og mere alvorlige 10-12, hvilket øger sandsynligheden for, at dyrene kommer til skade, ligesom deres anvendelighed til udvikling af nye behandlingsformer bliver størst. Disse dyr kan rutinemæssigt udvikle snesevis af krampeanfald om dagen, ofte forekommer i klynger 13.
Sandsynligvis en af de vigtigste udviklinger i biomedicinsk videnskab har været anvendelsen af gen-targeting i musemodeller. Denne fremgangsmåde har gjort, og vil fortsætte med at gøre det muligt, at udvikle dyremodeller af genetisk epilepsi, der gengiver faktiske menneskelige syndromer 14-16. Genetiske manipulationer kan gennemføres somproof-of-princippet behandlingsformer til at undertrykke epileptiske anfald eller endda blokere for udviklingen af epilepsi efter hjerneskade 17-20. Denne type forskning ville drage fordel dramatisk fra evnen til at udføre high-throughput kontinuerlig registrering af EEG. For tiden er det muligt at optage fra mus med enten tøjrede eller telemetrisystemer; Men udfordringerne for at opnå høj kvalitet, er artefakt-fri optagelser betydeligt vanskeligere end rotter, og ofte kræver forskellige former for rygsække at mus løbende prøve at fjerne. Stress kan øge alvoren af krampeanfald, frekvens og / eller varighed, og dermed i sidste ende ville modificere epilepsi af forsøgsdyr, således confounding undersøgelsen. En lille, letvægts, lav profil miniature telemetri-system vil lette optagelsen af langsigtede EEG fra genetiske musemodeller for human sygdom.
Ud over de ovenfor beskrevne problemer, optagelse EEG i umodne gnavermodels sygdom har sit eget unikke sæt af udfordringer. Umodne dyr kan veje så lidt som 6 g (P8 mus) til 17 g (P6 rotte). Det er næsten umuligt at gøre serielle multi-dages tøjrede EEG optagelser som følge af øget stress fra tøjr og manglende evne til at give naturlig opdræt af hvalpen ved dæmningen. Indtil dyrene er vænnet, skal de forblive i pleje af dæmningen. Dæmningen er tilbøjelig til at ødelægge enhver eksternaliseres stik forsamling på pup, lukke hvalpen, og i nogle tilfælde opsige hele kuldet. Endvidere umodne gnaver kraniet gør det vanskeligt at montere nogen elektrode piedestal til kraniet med mekanisk integritet. Disse udfordringer, unikke for umodne gnavere, kræver en ny løsning for at gøre robust, langsigtede elektrografiske optagelser. Her fokuserer vi på at demonstrere implantation og registrering af EEG ved hjælp af en roman miniature trådløs sender og nuværende tre proof-of-princippet eksperimenter som eksempler for brug af miniature trådløse telemetri-system: 1) immodne rotte pup model af hypoxi-iskæmi, 2) voksne mus behandlet med DFP for at inducere status epilepticus og efterfølgende spontane anfald, og 3) genetisk model af vaskulære kavernøse misdannelser, der resulterer i kramper og dødsfald hos voksne mus.
Den miniature trådløse telemetri-system er designet til at imødekomme fire hovedkrav: (1) minimalt invasiv kirurgisk implantation; (2) kompatibilitet for opstaldning af gnavere hvalpe med dæmningen og søskende; (3) lavt strømforbrug af enheden, hvilket giver mulighed for måneders kontinuerlig overvågning uden kirurgisk re-implantation; og (4) evnen til at optage høj kvalitet EEG-kurver med minimale bevægelse artefakter. Den trådløse sender vejer <0,6, 2,3 og 4 g og er <0,3, 0,8, og 1,4 cm3 afhængig af batteriet med et footprint på 5 x 7, 7 x 9 eller 7 x 12 mm, der let monteres til kraniet af dyret med cyanoacrylat gel. Ingen knogle skrue ankre er nødvendige for sikkert anbringe enheden tilkraniet, hvilket reducerer antallet af huller, der skal bores i kraniet og kirurgi tid. Indretningen er i stand til at amplificere to kanaler af EEG eller lokale feltpotentialer fra dybe hjernens strukturer, såsom hippocampus, i over 2 uger, 2 måneder eller 6 måneder i denne konfiguration. Den lille størrelse af den trådløse sender reducerer risikoen for infektion, øger animalsk mobilitet, og i sidste ende reducerer morbiditet og mortalitet, der ellers øger den tid, penge og antal dyr, der er nødvendige til et eksperiment. Alle elektronik og batteri er pottet i medicinsk-grade epoxy, der gør enheden vandtæt og hård, forhindre dæmningen fra tygge på senderen, der ellers kunne gøre enheden ubrugeligt. Modsætning radio-frekvens sendere, telemetrisystemet anvender kapacitiv kobling mellem sender og en modtager antenne, der sidder under dyret bur, så brugeren kan holde dyr i standard gnavere boliger. Flere kanaler med RECORDIng mulighed for optagelse af multimodale biopotentialer, såsom elektrokardiogram og elektroencefalogram. Dyremodeller for co-morbiditet vil drage fordel ved evnen til at optage biopotentialer under opførsel 21-23. Kombinere adfærd med EEG overvågning vil give forskerne et bedre værktøj til forskning og prækliniske studier.
Protocol
Følg de institutionelle retningslinjer for pasning af dyr til kirurgisk værktøj sterilisering, og ændre som nødvendigt for at overholde de retningslinjer og få godkendelse fra din institutions Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokol.
1. Kirurgisk Forberedelse
- Rens og forberede senderen for at sikre en sikker og steril kirurgi. Fjern senderen fra dets antistatiske emballage og enten spray eller blød i 70% ethanol. Skyl sender med sterilt saltvand og mellem sterile bomuld svampe dyppet i sterilt saltvand eller holde nedsænket i sterilt saltvand.
- Indsamle og sterilisere de nødvendige for kirurgi værktøj; damp autoklave til sterilisering. Se tabel af materialer og reagenser til listen over kirurgiske værktøjer.
2. Kirurgisk implantation
- Bedøve dyr og opretholde anæstesi ifølge IACUC-godkendt protokol. Ved initiering og under surgery kontrollere tå-pinch refleks hver 15 min. Manglen på respons indikerer tilstrækkelig anæstesi.
- For hvalpe, brug anæstesi ved isofluran (4%) med O 2 (100%). For voksne, bruger ketamin (100 mg / kg) med xylazin (10 mg / kg).
- Fix position i stereotaktisk ramme. Placer øret bar tips i øregangen. Må ikke overdrevent stramme øre barer kraniet er meget blød i unge rotteunger. Fastgør anæstesi næse kegle.
- Holde dyret varm under operation ved at placere den på varmepude indstillet til 37 ° C. Hos voksne dyr, anvendelse smørende salve på øjnene af dyret.
- Sterilisere incisionssted og vedligeholde sterile kirurgiske område.
- Svaber hovedbunden med skiftende anvendelser af 70% ethanol og betadin. Starte i midten af hovedbunden og gøre stadigt bredere koncentriske cirkler.
- Dæk dyret med drapering og udføre kirurgi i draperet dyr. Vedligehold Sterile kirurgiske område ved foring det kirurgiske opsætning med sterile forhæng, sprøjteudstyr med 70% ethanol.
- Bær sterile kirurgiske handsker og kjole (eller efter behov af institutionen). At hjælpe med at opretholde sterile område, skal du bruge en kirurgisk assistent.
- Lave et snit på hovedbunden af dyret lidt bag øjnene langs midterlinjen, ca. 2 cm. Vær forsigtig, når du sætter skalpel som skallen er stadig meget blød i unge rotteunger. Lav et enkelt snit, så snittet bløder mindre, og heler hurtigere.
- Eksponere kraniet. Forbered en ren og tør område for at maksimere bindingen mellem sender og knoglerne i kraniet. Brug aneurisme clips til at forstå hovedbund.
- Træk forsigtigt hovedbunden væk fra midterlinjen ved fire hjørner. Kig efter anatomiske landmærker såsom bregma og lambda i kraniet. Husk kranieknogler ikke smeltet hos dyr i denne alder. Brug Paxinos atlas af stereotaksiske koordinater for at finde den rigtige placering til borehul.
- Brug en Dremel-værktøj af typen med en burre-typen bor. Opret to burr huller i ønskede optagelse stillinger med hullerne bliver større end 300 um i diameter. Placer borehul for referenceelektroden over cerebellum bag lambda af kraniet.
- Sørg for, at ledningerne på senderen flugter med burr huller. Hvis elektrodetrådene ikke er justeret, lim kontaminering af elektroderne er sandsynligt, og vil resultere i dårligt signal. Sådan justeres ledninger, kontrollere pasformen af senderen og forsigtigt bøje elektroder at line op over de tilsigtede websteder for burr huller.
- Trim elektrode kundeemner. Anvende kirurgiske saks til at trimme elektroderne til den ønskede længde. Elektroden dybde er vigtig for den type registrering kræves til eksperimentet (dvs. placere elektroderne over dura for EEG optagelser, eller brug stereotaksiske koordinater for definerede hjernens strukturer).
- Smør rigeligt cyanoacrylat på bunden af senderen to dække området og sørg for at undgå belægning elektroderne. Cyanoacrylat lim er en elektrisk isolator, kontaminerende elektroder med lim vil resultere i noget signal.
- Hvis du optager fra dybe hjernens strukturer, montere senderen på kanylen holderen og placere den i stereotaktisk arm for z-aksen kontrol. Sænk senderen ved hjælp af stereotaktisk arm til passende dybde og placere cyanoacrylat gel omkring senderen.
- Grundigt tør kraniet før placere senderen for at sikre en stærk klæbende binding. Påfør transmitter overtrukket med cyanoacrylat til kraniet. Vær omhyggelig med at tilpasse elektroder med tilsvarende burr huller.
- Prøv at undgå skadelige større vaskulære strukturer. Hold senderen på plads med et let tryk i et minut. Bruge et let tryk for at danne en stærk binding mellem sender og kraniet.
- Påfør yderligere cyanoacrylat, nok til helt at forsegle sender / kranium. At sikre agOOD pasform og stærk binding, maksimere overfladearealet af den lim, der er i kontakt med kraniet. Påfør cyanoacrylatklæbestof i en cirkel omkring senderen, hvilket gør at både kraniet og væggen af senderen er dækket.
- Anvende kemisk accelerator (0,1 ml) via en sprøjte omkring cyanoacrylat ved basis af den implanterede senderen. Brug accelerator sparsomt, pas på ikke at gælde for tilstødende væv.
Bemærk: Kemisk acceleration af cyanoacrylat hærdning sikrer, at den stærke binding mellem senderen og kraniet dannes hurtigt. Cyanoacrylat accelerator er nyttig til hurtig hærdning af klæbemiddel, men er ikke nødvendigt. - Fjern acceleratoren ved vask området grundigt med sterilt saltvand. Cyanoacrylat accelerator kan forårsage vævsirritation hvis ikke vasket fra det område af snittet. At vaske området, fylde en 1,0 ml sprøjte med sterilt saltvand og overrisle området gennem en sprøjte nål. Generelt 0,5 ml saltvand er nok til at udvaskespeederen.
- Sutur huden omkring bunden af senderen, men dækker ikke senderen. Toppen af senderen skal være over huden til effektivt at overføre neurale signaler. Hud skal være rimeligt stramt omkring senderen og lim omkring enheden. Brug Vicryl eller silke sutur (blød tråd); hud i umodne dyr er blødt og er let beskadiget, hvis der ikke anvendes bløde suturer. For voksne dyr, bruge nogen suturering materiale.
- Fjern dyret fra stereotaktisk ramme og sted på opvarmet tæppe til nyttiggørelse.
- Sørg dyr er varm (37 ° C) og ambulant (dvs. helt genvundet) før han vendte tilbage til dæmningen. Sikre, at dyret er hydreret ved at klemme huden på dyrets ryg (hvis dyret er dehydreret, vil huden være deformerede). Hvis dyret er dehydreret, administrere subkutan injektion af lactat Ringers puffer. Lad ikke dyret uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholdebrystleje.
- Administrere buprenorphin (0,05 mg / kg) til dyr til postoperativ smertebehandling og en subkutan injektion af 0,1 ml bupivacain omkring injektionsstedet.
Bemærk: Fra start til slut hele proceduren skal være afsluttet i 5-10 min for dyr i denne alder (postnatal dag 6). Kirurgisk tid kan tage længere tid for ældre dyr.
- Administrere buprenorphin (0,05 mg / kg) til dyr til postoperativ smertebehandling og en subkutan injektion af 0,1 ml bupivacain omkring injektionsstedet.
3. Pleje og Boligstyrelsen
Bemærk: Nogle dæmninger kan ikke tolerere unger implanteret med enheden. Kan være nødvendigt at blive udvalgt som er tolerante dæmninger. Det er acceptabelt for dæmningen til at flytte unger rundt i buret ved at samle dem op af senderen.
- Når dyrene er vænnet, enkeltvis-huse dem at undgå fjernelse af enheder fra deres bur mate.
- Aflive dyr ved dødelig dosis af pentobarbital (25 mg / kg) eller isofluran (i en glasklokke), når tegn på lidelse er til stede.
- Bemærk, nogle dyr boliger bure med wire indsatse kan interfere med de implanterede sendere. Sørg for at tjekke højden på wiren indsatsen for at sikre, at dyr ikke kan få senderen fanget mellem de "stænger" af tråden indsatsen. Kontakt din dyrlæge for at få hjælp.
4. Optagelse EEG
- Placer dyret i et bur for sig selv eller co-opstaldet med søskende og dæmningen. Imidlertid sted kun en implanteret dyr i samme bur. Efterlad ikke hvalpe alene i optagelsen kammer i mere end 2 timer. Overvåg dyrene for tegn på angst og dehydrering.
- Tilslut den medfølgende strømforsyning til modtageren base og kontrollere strømindikatoren lyser. Tilslut modtageren basen til et dataopsamlingssystem ved brug (Bajonet Neil-Concelman) BNC kabler.
- Sende dyret bur oven på modtageren base (figur 2). Den "signal" lyset skal belyse indikerer en sender er blevet opdaget. Data kan nu registreres.
- To registrere data, tilslutte receiveren basen til en analog-til-digital konverter og tilslut konverteren til en computer (figur 1).
- Indstil samplinghastighed på optagelsen. Sørg for data samples korrekt. Vælg mindst 250 Hz samplingfrekvens (500 Hz anbefales) til optagelse (båndbredden på senderen er 0,1-100 Hz).
- Spar digitaliserede data og analysere brug af signal-processing softwarepakker såsom Matlab.
5. EEG Analyse - Grund-
- Udføre FFTs (Fast Fourier transformationer) at transformere tidsmæssige EEG data til frekvensdomænet fra 0-100 Hz.
- Udfør et estimat af magt spektrale tætheder (PSDs) fra FFT bruger 256 Hann-vinduet segmenter baseret på Welch metoden og normaliseret med 10 x log 10 (PSD). Power spektre viser de specifikke frekvenser, der dominerer EEG signal over den ønskede periode.
- Gruppe data på tværs dyr ved at tage gennemsnittet af PSD fra hvert dyrTidsforskellen-matchede behandlinger. Oprette 95% konfidensintervaller ved 1,96 x middelværdi (PSD) / kvadratrod (n), hvor n er antallet af dyr (PSD spor). Plot de gennemsnitlige og 95% konfidensintervaller for de data til at generere en kvantitativ rapport af hele frekvens indholdet af EEG tværs kohorter af dyr, såsom at sammenligne behandlede grupper vs. kontrolgrupper.
6. Perinatal Hypoxi-iskæmi (HI) Model Protocol
- Anesthetize P6 - 7 rotteunge hjælp isofluran anæstesi (4% med 100% O2) ved at anbringe dyret i en anæstesi kasse (kasse med input fra anæstesi vaporizer). Ved initiering og under kirurgi kontrollere tå-pinch refleks hver 15 min. Manglen på respons indikerer tilstrækkelig anæstesi.
- Placer hvalpen på ryggen, udsætte hals og krat med vekslende anvendelser af 70% ethanol og 10% betadine. Gentag ethanol / Betadine krat 3 gange.
- Lav en 1 cm incision i huden på halsen med scissors på midterlinjen af halsen. Løft huden med pincet og gøre cut med en saks. Pas på ikke at skære muskelvæv, når de foretager snittet.
- Bruge stump dissektion teknik til at afsløre carotidarterie. For at udføre stump dissektion, bruge to par stumpe-næse tænger. Sæt spidserne ind i vævet og lad fjedervirkning af det kirurgiske instrument sprede vævet. Gentag indtil carotidarterie blotlægges. Identificere halspulsåren med en klar rød farve og tilstedeværelsen af synlige puls.
- Separat carotidarterie fra vagus nerve ved stump pincet. Sæt stumpe spids pincet mellem arterie og nerve. Slip pincet og lade fjedervirkning af værktøjet adskille carotis fra vagus nerve.
- Sted aneurisme klemmer 4-5 mm fra hinanden på halspulsåren. Sørge for at ikke beskadige arterien med klemmerne ved at undgå hurtige bevægelser.
- Ætse halspulsåren mellem aneurisme klemmer. At ætse arterienBerør arterien mellem klemmerne med et varmt cauterizer tip. Efter arterien er skåret, sikre begge ender er korrekt ætset for at undgå blødning.
- Fjern klemmerne, lukke hals snit med 3 suturer. Kun sutur i huden, passe på ikke at suturere muskelvæv.
- Så dyret kan komme sig i 1 time. Overvåge dyrets vejrtrækning og blødning fra halsen. Hvis blødningen er til stede, ikke udsætte dyret til HI (trin 6.10).
- Dyret i et temperaturstyret kammer ved 37 ° C og kontinuerligt indføre 8% O 2/92% N 2-blanding ind i kammeret i 2 timer.
Representative Results
Vi udviklet og implementeret konceptet med at optage EEG fra en enkelt voksen gnaver, skematiseret i figur 1 For IACUC godkendelsesprocessen skal design integreres godt i de eksisterende institutionelle dyrefaciliteter.; Derfor blev systemet designet til at blive nemt installeres i en standard dyr anlæg uden brug af ekstra plads: dyret har til huse i en regulær "dyr facilitet-problem" boliger bur, der er placeret inde i en modtager med en integreret Faraday bur for at reducere elektrisk støj. Signalet fra hver modtager basen udføres med ledninger til en digitizer, der er tilsluttet en computer (figur 1). En enkelt computer er nødvendig for at indsamle data fra op til 32 dyr, der konstateres samtidigt, afhængigt af evnen til brugerens datafangst system. Denne type opsætning forbruger lidt strøm og producerer lidt varme, en funktion kompatibel med klima-kontrollerede dyrefaciliteter. Data kan værevises i realtid på skærmen, så eksperimenterende overvågning, og lagret på lang sigt på eksterne harddiske (10 TB lagerenhed).
For at minimere skader ved kuld-hjælpere og hvalp kannibalisering af dæmningen, vi testede forskellige transmitter formfaktorer. Den endelige udformning var en afrundet cylinder; en form vanskeligt for rotter at bide og beskadigelse. En individuel sender på kraniet af en voksen rotte er vist i figur 2A og en tidlig version af high-density (32 dyr) modtager baser og optagelse rigge, hvor standard gnavere hus er placeret, er vist i figur 2B. Strømeffektivitet var en yderst vigtig overvejelse; vi valgte kapacitive kobling som datatransmissionsprotokol. Følgende design giver mulighed for at optage kontinuerlige EEG i over 6 måneder, afhængigt af batteriets kapacitet (figur 2A). Mus som unge som postnatal dag 12 (P12, figur 3A) og rotter så unge som P6 (Figure 3B) tolerere senderen ganske godt. Fastholdelsen senderen til kraniet med cyanoacrylat giver dyrene til at vokse med senderen ind i voksenalderen (figur 3C), og samtidig opretholde kontinuerlig erhvervelse af EEG data.
Den unikke miniaturiserede formfaktor af senderen og trådløse interface egner sig til arbejde med dyremodeller for neo og perinatale forhold. Dataene i figur 4 viser to kanaler af EEG registrering af subakut beslaglæggelse aktivitet, der følger hypoxisk-iskæmisk (HI) infarkt (halspulsåren ligering efterfulgt af 2 timers hypoksi med 8% O2-blanding) i en P7 Sprague-Dawley rotte hvalp 13. HI behandling forårsager en stor læsion i halvkugle ipsilaterale til den ligerede carotis. Her optagelserne viser en klynge af to anfald generaliserede over begge halvdele af den skadede hjerne. Den sorte spor afbilder EEG aktivitet i halvkugle kontralaterale til læsionen, denblå spor viser EEG i ipsilaterale halvkugler (dvs. i det område af læsionen). Mens beslaglæggelse aktivitet er til stede i begge halvkugler af hjernen, den ispilateral halvkugle viser EEG baggrundsafblænding, hvilket er tegn på igangværende hjerneskade 21.
Status epilepticus kan induceres i voksne rotter ved at injicere dyrene med organophosphat, DFP 22,23. Dataene i figur 5 viser gentagne udledning EEG, der er indikatorer for status epilepticus (se tidsmæssige udvidelser Figur 5A, B). Nedenfor prøven spor, har tidsforløbet for status epilepticus over 12 timer blevet analyseret med en ikke-lineær blandede effekter model, der kvantificerer intensiteten af anfald over tid. Sværhedsgraden af status epilepticus defineres af EEG magt i gamma-båndet (20-60 Hz). Her blev den ovenfor beskrevne effekt gennemsnit på 12 dyr og plottet over 12 timer med 95% konfidensintervaller. Th e data viser en markant stigning i gamma magt inden for den første time af DFP behandling, som varer mere end 12 timer i løbet af hvilken dyrene løbende overvåges. Den følgende analysemetode muliggør en kvantitativ måling af omfanget af akut status epilepticus, et fænomen, der tidligere primært analyseret med adfærdsmæssige tiltag. Vi inkluderer denne analyseteknik som eksempel, fordi den udnytter power beregning i klassiske EEG bands og har været udbredt anvendt i prækliniske undersøgelser til afprøvning af effektiviteten af krampestillende medikamenter i vores laboratorium 24-26. Muligvis den mest værdifulde aspekt af at gøre kontinuerlige, uafbrudte trådløse optagelser med det trådløse telemetri er evnen til at optage unormale spontane hændelser, der forekommer med lav hyppighed. Disse typer af data demonstrerer den brede anvendelighed af den trådløse sender systemet.
554fig1.jpg "/>
Figur 1:. Skematisk af Epoch registreringssystem Det trådløse registreringssystem består af to komponenter: 1) et trådløst kranium monteret transmitter, der forstærker biosignal, og 2) en modtager plade anbragt under standard gnaver boliger. Udgangssignalet fra modtageren base er et analogt signal, der består af det demodulerede biosignal forstærkes til et maksimum på 4 V spids-til-spids. Dette signal kan så tilføres en datafangst system til registrering.
Figur 2:. Sender og modtager Denne særlige trådløs sender (A) vejer 4 g og fortrænger <1,4 cm3 i volumen og med et fodaftryk på 7 x 12 mm monteres let til kraniet af rotter og mus. Senderen kan forstærke 2 kanaler af biopotentialer i op til 6 måneder, hvorefter batteriet er drænetred. Større batterier kan anvendes til længere optagelsestid. Dyrene anbringes i standard gnavere anbringelse i bur oven på Epoch modtager (B). Vist til højre er et tidligt eksempel på to separate optagelse rigge hver kan optage fra 16 dyr samtidigt påvise relativt lille fodaftryk (2 'x 4', ca. 60 cm x 120 cm) af hver af optagelsen rigge.
Figur 3:. Implantation af trådløse sender i rotter og mus Senderen muliggør kontinuerlige EEG optagelser i op til 6 måneder i mus helt ned til postnatal dag 12 (P12, øverst). Den midterste fotografi er af en P7 rotte hvalp implanteret med miniature sender. Senderen forbliver solidt fastgjort til kraniet, da dyret modnes. Dyret ved bunden er P280 og blev implanteret med en fingeret transmitter i en alder P7. Systemet gør det muligt simultagene og kontinuerlige EEG optagelser fra flere dyr på P7 gennem fravænning, at reducere antallet af kuld der er nødvendige for præklinisk, langsigtet, EEG overvågning studier.
Figur 4: Dual-kanals optager hypoxi-iskæmi inducerede anfald med telemetrisystemet Dual-kanal optagelser af unormal EEG med trådløs telemetri i en P7 rotte hvalp efter carotis ligatur (iskæmi) i løbet af 8% O 2 behandling (hypoxi).. (A) og (B), ekspanderet visninger af bølgeformer. Beslaglæggelse aktivitet er til stede i begge halvkugler (sort, blå) med betydelig EEG undertrykkelse stede i halvkugle med iskæmisk infarkt (blå).
Figur 5: Optagelse status epilepticus i voksne rotter. Surface EEG optagelser (dvs. dural) med miniature trådløs telemetri-system som reaktion på diisopropylfluorphosphat (DFP) behandling i en voksen rotte. De skraverede perioder i øverste spor (A og B) ekspanderes visninger af bølgeformer i sporene nedenfor. Data, der er optaget med den trådløse sender kan derefter analyseres i frekvensdomænet giver statistiske sammenligninger i en kohorte af dyr. (C) Data er de gennemsnitlige og 95% konfidensintervaller for gamma band effekt (20-60 Hz) Følgende DFP-induceret status epilepticus (N = 12) i løbet af 12 timer efter administration af DFP.
Figur 6:. Registrering af beslaglæggelser og ændringer i EEG i en transgen musemodel af vaskulære bundløs misdannelser Her registrerer vi fra en transgen mus (A) thved undergår beslaglæggelse aktivitet. Ved første, normal EEG mønster er til stede (1); umiddelbart før beslaglæggelsen er der en periode af præ-iktal depression (2), som efterfølges af en klynge af fem anfald (3). Efter anfald, unormal iktal afladning i signalet (4). Kontrol dyr har ingen anfald og ingen unormale EEG funktioner (B).
Discussion
Det kan være meget dyrt at foretage langsigtede elektrografiske optagelser i små dyremodeller for sygdomme. Ved at satse på simple elektriske kredsløb og understreger lavt strømforbrug, har vi været i stand til at skabe en sender-system (figur 1 og 2), der reducerer omkostningerne ved overvågning eksperimenter langsigtede. De samlede omkostninger til en 6 måneders overvågning eksperiment kunne være så lavt som $ 470 plus udgifterne til dyret (~ $ 1,5 dyr dagpenge, $ 200 sender). Den lille størrelse af senderen tillader kontinuerlig uafbrudt elektrografiske optagelser i små dyr, prækliniske modeller for human sygdom, som er meget vanskeligt at opnå med tøjret eller radio-frekvens-baserede trådløse registreringssystemer (Figur 4). Endelig kraniet monterede karakter af senderen reducerer kirurgi tid og stress på dyret, som ellers kan kompromittere et eksperiment. Her viser vi proof-of-princippet eksperimenter fra tre different forsøgsmodeller anfald: perinatal hypoxi-iskæmi 13, 27, 28 i en rotteunge (figur 4), DFP-induceret status epilepticus (figur 5) og anfald i en genetisk-induceret model af kavernøse vaskulære malformationer (figur 6).
Muligvis det mest kritiske aspekt for at opnå artefakt-fri, langsigtede elektrografiske optagelser er at kontrollere uhæmmet elektrode adgang til kortikale region af interesse (Figur 4-6). Dette omfatter den fælles reference / jordelektrode. Særligt kritisk er fastgørelse af senderen til kraniet for epidural EEG applikationer. Under denne proces er det muligt at uforvarende belægge spidsen af elektroderne med cyanoacrylat betragtning af den meget korte længde af elektroderne. Coating elektroderne i cyanoacrylat kan dæmpe EEG signaler eller helt at isolere dem i det værst tænkelige scenario. Tilsvarende mangel på god elektrisk forbindelse Between den fælles reference / jord og dyrets hjerne vil forhindre korrekt drift af differentialforstærkeren i senderen, hvilket resulterer i en elektrisk "støjende" signaludgang. Ofte, efter operation, god kvalitet signaler kan kompromitteres i op til 48 timer på grund af ødem omgiver burr huller i kraniet. Som ødem aftager, signaler generelt forbedre. Dette kan undgås ved at placere elektroderne på overfladen af kraniet uden at burr huller. Konsekvenserne af denne proces er øget potentiale til pels elektroderne med cyanoacrylat, nedsat højfrekvente aktivitet på grund af low-pass elektriske egenskaber kraniet, og potentialet for elektrisk isolere fælles reference / jord rendering støj i signalerne. Øve korrekt placering af elektroder kan gøres med et tyndt stykke træ eller finér, der efterligner tykkelsen af mus eller rotte kraniet. Resultaterne i dette manuskript illustrerer quaheden af optagelser, der kan opnås ved hjælp af trådløs telemetri-teknologi.
Kirurgisk implantation ved hjælp af den heri beskrevne fremgangsmåde kan tage så lidt som 10 minutter, afhængigt af kompleksiteten af kirurgien. Til kirurgisk adgang til dybe hjernens strukturer, såsom CA1-regionen af hippocampus, er det bedst at fastgøre senderen til en mikromanipulator monteret på en stereotaktisk ramme. Den mikromanipulator vil give kirurgen med nøjagtighed at implantere senderen i henhold til offentliggjorte stereotaksiske koordinater i atlas af mus 29 og rotter 30 hjerner. Dette kan gøres ved blot at krydse et stykke kanyle slangen til senderen med cyanoacrylat og derefter montere den hypodermiske nål i mikromanipulator. Mikromanipulator styring af x, y og z-koordinaterne vil give yderligere stabilitet ved montering senderen til kraniet før suturering huden lukket. Tilsætningen af knogleskruer omkring perimeter af senderen kan hjælpe forankre senderen til kraniet, selv om de ikke er nødvendige. Knogleskruer kunne dog være effektiv, i visse dyremodeller af anfald og epilepsi, såsom lithium-pilocarpin-behandlede voksne rotte. Disse dyr har en tendens til at have spontane krampeanfald med intens motorisk aktivitet, der kan skade senderen under anfaldet. Yderligere kompleksitet kunne føjes til disse eksperimenter. For eksempel senderen er kompatibel med mange forskellige modeller af traumatisk hjerneskade, såsom kontrolleret kortikal indvirkning 31. Holdbarheden af senderen indretning blev testet ved at implantere dyr med sendere ved P7, og derefter huser dem i dyret facilitet. Efter 12 måneder fleste af implantaterne forblev intakt på kraniet. Når dyr blev aflivet, kranierne syntes at være normal og senderen var indlejret i kraniet, hvilket kræver betydelig kraft til at pakke den ud. Vær forsigtig, når dybe hjernens strukturerer undersøgt; som hjernen vokser, og elektroderne forblive stationære, vil den endelige position af elektroderne forventes at ændre sig. For de teknikker der er beskrevet her, blev elektroderne typisk placeret over dura, som tillod både hjernen og kraniet at vokse og til elektroder til at forblive i deres oprindelige positioner. Den begrænsende faktor for, hvor længe senderen kan bruges, er batteriets størrelse (dvs. indtil batteriet løber ud).
En selvstændig monolitisk design (dvs. senderen er indlejret i hårdt epoxy) på senderens hus egner sig til brug med umodne unger opstaldet med dæmningen og deres søskende. Ofte bofællesskab implanterede dyr med ledningsforbundne bindsler resulterer i ødelæggelse af den implanterede hardware eller cannibalization af hvalpene ved dæmningen. Den glatvæggede form af senderen muliggør implantation med næsten ingen fejl eller tab af unger grund kannibalisering hardware.
Disclosures
Drs. Lehmkuhle og Dudek har en økonomisk interesse i Epitel, Inc., designerne af Epoch trådløse biopotentiale registreringssystem.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret gennem Statens Institut for Neurologiske og Stroke R43 / R44 NS064661.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Powder Free Sterile Latex Surgical Glove |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
| Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
| Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
| Fine burr | FST | 19007-07 | |
| Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
| Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
| Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
| Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
| Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
| Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
| Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
| Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
| Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
| Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
| Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
| PC-compatible computer |
References
- Boylan, G. B., Stevenson, N. J., Vanhatalo, S. Monitoring neonatal seizures. Semin. Fetal Neonatal Med. 18 (4), 208-208 (2013).
- Panzica, F., Varotto, G., Rotondi, F., Spreafico, R., Franceschetti, S. Identification of the Epileptogenic Zone from Stereo-EEG Signals: A Connectivity-Graph Theory Approach. Front Neurol. 6 (4), 175 (2013).
- Arciniegas, D. B. Clinical electrophysiologic assessments and mild traumatic brain injury: state-of-the-science and implications for clinical practice. Int J Psychophysiol. 82 (1), 41-52 (2011).
- Mizrahi, E. M., Kellaway, P. Cerebral concussion in children: assessment of injury by electroencephalography. Pediatrics. 73 (4), 419-425 (1984).
- Pisarenco, I., Caporro, M., Prosperetti, C., Manconi, M. High-density electroencephalography as an innovative tool to explore sleep physiology and sleep related disorders. Int J Psychophysiol. S0167-8760 (14), 3-8 (2014).
- Konadhode, R. R., et al. Stimulation of MCH neurons increases sleep. J. Neurosci. 33 (25), 10257-10263 (2013).
- Bertram, E. H., Williamson, J. M., Cornett, J. F., Spradlin, S., Chen, Z. F. Design and construction of a long-term continuous video-EEG monitoring unit for simultaneous recording of multiple small animals. Brain Res. Protoc. 1-2 (1), 85-97 (1997).
- Stables, J. P., et al. Therapy discovery for pharmacoresistant epilepsy and for disease-modifying therapeutics: Summary of the NIH/NINDS/AES Models II Workshop. Epilepsia. 44 (12), 1472-1478 (2003).
- White, A. M., et al. Efficient unsupervised algorithms for the detection of seizures in continuous EEG recordings from rats after brain injury. J. Neurosci. Methods. 152 (1-2), 255-266 (2006).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The ontogeny of seizures in a rat model of limbic epilepsy: evidence for a kindling process in the development of chronic spontaneous seizures. Brain Res. 625 (2), 295-300 (1993).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The evolution of a rat model of chronic spontaneous limbic seizures. Brain Res. 661 (1-2), 157-162 (1994).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. J. Neurosci. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous electroencephalographic monitoring with radio-telemetry in a rat model of perinatal hypoxia-ischemia reveals progressive post-stroke epilepsy. J. Neurosci. 30 (1), 404-415 (2010).
- Galanopoulou, A. S. Basic mechanisms of catastrophic epilepsy -- overview from animal models. Brain Dev. 35 (8), 748-756 (2013).
- Lerche, H., et al. Ion channels in genetic and acquired forms of epilepsy. J Physiol. 591 (Pt 4), 753-764 (2013).
- Rossignol, E., et al. WONOEP appraisal: new genetic approaches to study epilepsy). Epilepsia. 55 (8), 1170-1186 (2014).
- Westmark, C. J., et al. Reversal of fragile X phenotypes by manipulation of AβPP/Aβ levels in Fmr1KO mice. PLoS One. 6 (10), e26549 (2011).
- Sukhotinsky, I., et al. Optogenetic delay of status epilepticus onset in an in vivo rodent epilepsy model. PLoS One. 8 (4), e62013 (2013).
- Krook-Magnuson, E., Armstrong, C., Oijala, M., Soltesz, I. On-demand optogenetic control of spontaneous seizures in temporal lobe epilepsy. Nat Commun. 4, 1376 (2013).
- Paz, J. T., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nat Neurosci. 16 (1), 64-70 (2013).
- Monod, N., Pajot, N., Guidasci, S. The neonatal EEG: statistical studies and prognostic value in full-term and pre-term babies. Electroecephalogr Clin Neurophysiol. 32 (5), 529-544 (1972).
- Deshpande, L. S., Carter, D. S., Blair, R. E., DeLorenzo, R. J. Development of a Prolonged Calcium Plateau in Hippocampal Neurons in Rats surviving Status Epilepticus Induced by the Organophosphate Diisopropylfluorophosphate. Toxicol Sci. 116 (2), 623-631 (2010).
- Todorovic, M. S., Cowan, M. L., Balint, C. A., Sun, C., Kapur, J. Characterization of status epilepticus induced by two organophosphates in rats. Epilpsy Res. 101 (3), 268-276 (2012).
- Lehmkuhle, M. J., et al. A simple quantitative method for analyzing electrographic status epilepticus in rats. J. Neurophysiol. 101 (3), 1660-1670 (2009).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J. Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Pouliot, W., et al. A comparative electrographic analysis of the effect of sec-butyl-propylacetamide on pharmacoresistant status epilepticus. Neuroscience. 12 (231), 145-156 (2012).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Vannucci, R. C., Vaccucci, S. J. A model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Ann N Y Acad Sci. 835, 234-249 (1997).
- Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2013).
- Bolkvadze, T., Pitkanen, A. Development of post-traumatic epilepsy after controlled cortical impact and lateral fluid-percussion-induced brain injury in the mouse. J. Neurotrauma. 29 (5), 789-812 (2012).
