Abstract
Veel progressieve neurologische ziekten bij mensen, zoals epilepsie, vereisen preklinische diermodellen die langzaam de ziekte ontwikkelen teneinde interventies in verschillende stadia van het ziekteproces testen. Deze diermodellen zijn bijzonder moeilijk te implementeren in onvolwassen knaagdieren, een klassiek modelorganisme voor laboratoriumonderzoek van deze aandoeningen. Opname continue EEG in jong dier modellen van toevallen en andere neurologische aandoeningen een technisch probleem, vanwege de kleine fysieke afmetingen van jonge knaagdieren en hun afhankelijkheid van de dam tot het spenen. Daarom is er niet alleen een duidelijke behoefte aan verbetering van preklinisch onderzoek dat therapieën die beter geschikt zijn voor vertaling naar de kliniek, maar ook behoefte aan nieuwe apparaten kan opnemen continue EEG bij onvolgroeide knaagdieren identificeert. Hier beschrijven we de techniek achter en demonstreren het gebruik van een nieuw mini telemetriesysteem, speciaal ontworpen voor gebruik bij onvolwassen ratten or muizen, die ook werkzaam is bij volwassen dieren.
Introduction
De oudste - en nog steeds de meest gebruikte - techniek voor het opnemen biopotentialen in de hersenen het elektro-encefalogram (EEG). Het is klinisch gebruikt voor neurologische afwijkingen, met inbegrip van inbeslagneming detectie 1, lokalisatie van inbeslagneming brandpunten 2, en diagnose van een hersenschudding 3,4. Deze techniek wordt ook veel gebruikt om fundamentele informatie over de mechanismen van de slaap en om slaapstoornissen 5,6 diagnosticeren.
Zoals in de klinische diagnose van epilepsie, heeft de EEG onontbeerlijk voor translationeel onderzoek in diermodellen van zowel genetische en verworven epilepsie worden. In het huidige onderzoek toepassingen, "bedraad" of "tethered 'opnamen zijn standaard, en worden routinematig uitgevoerd bij volwassen knaagdieren wekenlang in een tijd 7. Echter, elektrische ruis, bewegingsartefacten, en het risico dat dieren zich verwonden door aan de kabel vastgemaakt lang compromised deze experimenten. Dus, om het verbeteren van de experimentele condities en slagingspercentages, moeten we nieuwe technologieën die het mogelijk maken voor de eliminatie van de bedrade interface tussen het dier en instrumentatie te ontwikkelen. De meest voor de hand liggende gebied van ontwikkeling is het ontwerp en de implementatie van telemetrie systemen die het mogelijk maakt voor hoge-kwaliteit opnames, met behoud van een lange levensduur en het minimaliseren van ongemak voor dierlijke onderwerpen. Het verminderen van de fysieke grootte van deze apparaten translationeel onderzoek bij neonatale en juveniele knaagdiermodellen van neurologische aandoeningen mogelijk maken.
Lage channel-count EEG-registraties bij ratten worden uitgebreid gebruikt om nieuwe therapieën te ontwikkelen om epileptische aanvallen staat vertaling naar de mens te onderdrukken. Opnamen van de ene of meer plaatsen langdurig opent vele mogelijkheden voor het gebruik knaagdiermodellen van epilepsie bij translationeel onderzoek. Veel van het moderne onderzoek op dit gebied is bedoeld om het optreden van chronische Seiz blokkerengelen of ontwikkeling van epilepsie (bijv epileptogenese) en dergelijke onderzoeksinspanningen dat uitgebreide of niet continu EEG monitoring om de doeltreffendheid van de voorgestelde therapie 8 assay; een kleine, eenvoudige, telemetrische systeem met één, twee of vier kanalen die tussen 0,1-100 Hz per kanaal sterk zal bevorderen dit type van translationeel onderzoek. Elektrografische aanvallen komen vaak met minimale gedrag (zeker zonder convulsies), die de waarde voor assays op basis van gedrags- aanvallen beperkt. De strategie van het combineren van EEG-opname en gelijktijdige video-monitoring maakt het mogelijk de mogelijkheid van het vastleggen van elke beslaglegging; en bovendien kunnen deze benaderingen kwantitatieve beoordeling van de interictale pieken die zich voordoen in de epileptische hersenen tussen "ictal" (of inbeslagneming) evenementen 9 mogelijk te maken. Bovendien is de mogelijkheid voor een constante hoge kwaliteit tegen lage artefact EEG op te kunnen nemen, waarbij de draadloze technologie algemeensuperior, zal voor de ontwikkeling van het gebruik van computer-gebaseerde algoritmen voor het bestuderen van specifieke EEG-golfvormen (bijvoorbeeld theta, gamma), evenals automatische detectie van aanvallen, de werklast van de experimentator aanzienlijk verminderen.
De primaire preklinisch model voor de studie van chronische epilepsie na hersenletsel is de volwassen rat of de muis, hetzij via een chemo convulsieve (bijv kainzuur of pilocarpine) of elektrisch geïnduceerde status epilepticus (SE), gevolgd door een chronische epilepsie. Onder deze omstandigheden kan de ernstige convulsies in verband met SE of de daaropvolgende aanvallen bij de epileptische dieren leiden tot letsel door het dier scheuren of trekken aan de ketting en het losdraaien van de schroeven waarmee de bevestiging van de headcap behouden. Uiteindelijk is dit probleem dat gewoonlijk beëindigt deze experimenten, en toch de noodzaak van langdurige hoge-resolutie EEG records voor experimenten gericht op het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor chronische vindenepilepsie staat voorop. Bovendien, huisvesting, monitoring, en analyseren van de gegevens van de lange-termijn geïmplanteerde dieren is een aanzienlijke investering in zowel de directe kosten en onderzoeker tijd; Daarom, voortijdige beëindiging van het experiment leidt tot hoge kosten voor de onderzoekers. Aangezien deze modellen van epilepsie vooruitgang, de aanvallen meestal vaker en ernstiger 10-12 geworden, waardoor de kans dat de dieren gewond, net als hun nut voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën wordt grootst. Deze dieren kunnen routinematig ontwikkelen tientallen convulsieve aanvallen per dag, vaak voorkomen in clusters 13.
Waarschijnlijk een van de belangrijkste ontwikkelingen biomedische wetenschap is het gebruik van gen targeting in muismodellen. Deze benadering is toegestaan, en zal blijven toestaan, de ontwikkeling van dierlijke modellen van genetische epilepsie dat de werkelijke menselijke syndromen 14-16 reproduceren. Genetische manipulatie kan worden uitgevoerd alsproof-of-principle therapieën om epileptische aanvallen te onderdrukken of zelfs blokkeren van de ontwikkeling van epilepsie na hersenletsel 17-20. Dit onderzoek zal sterk profiteren van de mogelijkheid om high-throughput continue registratie van de EEG voeren. Momenteel is het mogelijk om op te nemen van muizen met hetzij vastgemaakt en telemetriesystemen; De problemen van het verkrijgen van hoge kwaliteit, artefactvrij opnamen aanzienlijk moeilijker dan ratten, en dit vergt vaak verschillende vormen van rugzakken die muizen continu proberen te verwijderen. Stress kan aanvallen ernst, de frequentie en / of duur te verhogen, en dus zou uiteindelijk epilepsie van de proefdieren te wijzigen, waardoor de verstorende studie. Een kleine, lichtgewicht, low-profile miniatuur telemetriesysteem zal de opname van de lange termijn EEG van genetische muismodellen van de ziekte bij de mens te vergemakkelijken.
Behalve de hierboven beschreven problemen, opname EEG bij onvolgroeide knaagdiermodels van de ziekte heeft zijn eigen unieke reeks van uitdagingen. Onvolwassen dieren kunnen zo weinig als 6 g (P8 muis) wegen tot 17 g (P6 rat). Het is vrijwel onmogelijk om seriële meerdaags tethered EEG-registraties als gevolg van verhoogde belasting van tether en onvermogen leveren aan natuurlijke kweken van de pup door de dam mogelijk. Tot dieren worden gespeend, moeten ze in de zorg van de dam blijven. De dam is gevoelig voor elke geëxternaliseerd connector montage te vernietigen op de pup, de pup te beëindigen, en in sommige gevallen het hele nest te beëindigen. Bovendien is de onrijpe knaagdier schedel is het moeilijk om een electrode voetstuk bevestigen aan de schedel met mechanische integriteit. Deze uitdagingen, die uniek zijn voor onvolwassen knaagdieren, vereisen een nieuwe oplossing voor het maken van robuuste, langdurige electrografische opnames. Hier richten we ons op het aantonen van de implantatie en registratie van EEG het gebruik van een nieuw miniatuur draadloze zender en de huidige drie proof-of-principle experimenten als voorbeelden voor het gebruik van de miniatuur draadloze telemetriesysteem: 1) de imvolwassen rat pup model van hypoxie-ischemie, 2) volwassen muizen behandeld met DFP status epilepticus en daaropvolgende spontane attaques en 3) genetisch model van vasculaire caverneuze afwijkingen die leiden tot convulsies en dood in volwassen muizen te induceren.
De mini draadloze telemetriesysteem werden vier belangrijke vereisten: (1) minimaal invasieve chirurgische implantatie; (2) de compatibiliteit voor de huisvesting van knaagdieren pups met de dam en nestgenoten; (3) een laag stroomverbruik van het toestel, hetgeen aldus maanden continue bewaking zonder chirurgische re-implantatie; en (4) het vermogen om hoge kwaliteit EEG golfvormen nemen met minimale beweging artefacten. De draadloze zender weegt <0,6, 2,3 en 4 g en is <0,3, 0,8, en 1,4 cm 3, afhankelijk van de batterij met een voetafdruk van 5 x 7, 7 x 9, of 7 x 12 mm die gemakkelijk mounts aan de schedel van het dier met cyanoacrylaat gel. Geen bot pluggen zijn nodig om veilig te brengen van het apparaat naarde schedel, waardoor het aantal gaten te boren in de schedel en de operatieduur. Het apparaat kan amplificeren twee kanalen van EEG of lokale veldpotentialen diep hersenstructuren zoals de hippocampus, meer dan 2 weken, 2 maanden of 6 maanden in deze configuratie. Het kleine formaat van de draadloze zender vermindert het risico van infectie, vergroot de mobiliteit dieren en vermindert uiteindelijk morbiditeit en mortaliteit die anders verhoogt de tijd, geld, en het aantal dieren dat nodig is voor een experiment. Alle van de elektronica en de accu zijn opgepot in medische kwaliteit epoxy, dat maakt het toestel waterdicht en taai, het voorkomen van de dam van het kauwen op de zender die anders het apparaat onbruikbaar kan maken. Unlike radiofrequente zenders, het telemetriesysteem gebruikt capacitieve koppeling tussen de zender en ontvanger een antenne die ligt onder het dier kooi, zodat de gebruiker de dieren in standaard knaagdieren behuizing houden. Meerdere kanalen van recording zorgen voor de opname van multi-modale biopotentialen, zoals elektrocardiogram en elektro. Dierlijke modellen van co-morbiditeit zullen profiteren van de mogelijkheid om biopotentialen opnemen tijdens het gedrag van 21-23. De combinatie van gedrag met EEG-monitoring zal de onderzoekers een beter instrument voor onderzoek en pre-klinische studies.
Protocol
Volg de institutionele richtlijnen voor de verzorging van dieren voor chirurgische instrument sterilisatie, en het protocol als nodig is om te voldoen aan de richtlijnen en goedkeuring door Institutional Animal Care en gebruik Comite van uw instelling (IACUC) te verkrijgen aan te passen.
1. Chirurgische Voorbereiding
- Reinig en voor te bereiden de zender aan een veilige en steriele operatie te waarborgen. Haal de zender van zijn anti-statische verpakking en ofwel spuiten of genieten in 70% ethanol. Spoel de zender met een steriele zoutoplossing en plaats tussen steriele katoen sponzen gedrenkt in een steriele zoutoplossing of blijven ondergedompeld in steriele zoutoplossing.
- Verzamelen en steriliseren van de instrumenten die nodig zijn voor de operatie; stoomautoclaaf voor sterilisatie. Zie tabel van materialen en reagentia voor de lijst van chirurgische instrumenten.
2. Chirurgische Implantatie
- Verdoven dier en anesthesie te onderhouden volgens IACUC-goedgekeurde protocol. Bij aanvang en tijdens surgery check de teen-snuifje reflex om de 15 min. Het gebrek aan respons geeft voldoende anesthesie.
- Voor pups Gebruik verdoofd door isofluraan (4%) met O 2 (100%). Voor volwassenen, gebruik ketamine (100 mg / kg) met xylazine (10 mg / kg).
- Fix positie in stereotaxisch frame. Plaats het oor bar tips in de gehoorgang. Niet overdreven vast oor bars als de schedel is zeer zacht bij jonge rat pups. Bevestig de anesthesie neuskegel.
- Houd het dier warm tijdens de operatie door het op de verwarming pad ingesteld op 37 ° C. Bij volwassen dieren, gelden smerende zalf voor de ogen van het dier.
- Steriliseren incisie site en steriele chirurgische veld te behouden.
- Wattenstaafje de hoofdhuid met afwisselende toepassing van 70% ethanol en betadine. Start in het midden van de hoofdhuid en stellen steeds breder concentrische cirkels.
- Bedek het dier met een laken en het gedrag van de operatie meer dan gedrapeerd dier. Handhaving van de sterile chirurgische veld door de voering van de chirurgische set-up met steriele doeken, spuitapparatuur met 70% ethanol.
- Draag steriele chirurgische handschoenen en toga (of zoals vereist door de instelling). Om u te helpen steriele veld te behouden, gebruik dan een chirurgische assistent.
- Een incisie op de hoofdhuid van het dier iets achter de ogen over de middellijn ongeveer 2 cm. Wees voorzichtig bij het plaatsen van de scalpel als de schedel is nog steeds zeer zacht bij jonge rat pups. Maak een enkele snede zodat de incisie bloedt minder, en geneest sneller.
- Expose de schedel. Bereid een schoon en droog vlak voor de verbinding tussen de zender en de botten van de schedel te maximaliseren. Gebruik aneurysma clips om scalp te begrijpen.
- Trek hoofdhuid afstand van middellijn op vier hoeken. Kijk voor anatomische oriëntatiepunten zoals bregma en lambda in de schedel. Vergeet niet schedelbeenderen zijn niet bij dieren gesmolten op deze leeftijd. Gebruik de Paxinos atlas van stereotaxische coördinaten om de juiste locatie voor de braam gat te vinden.
- Gebruik een Dremel-type tool met een braam-type boor. Maak twee braam gaten in de gewenste opname posities met de gaten die groter zijn dan 300 micrometer in diameter. Plaats de braam gat voor de referentie electrode via cerebellum achter de lambda van de schedel.
- Zorg ervoor dat de draden op de zender zijn uitgelijnd met de braam gaten. Indien de elektrodedraden niet zijn uitgelijnd, lijm vervuiling van de elektroden waarschijnlijk, en resulteren in een slechte signaal. Om de draden uit te lijnen, controleer de pasvorm van de zender en buigt elektroden om line-up op de beoogde locaties voor braam gaten.
- Trim elektrode leads. Gebruik chirurgische schaar om de elektroden trimmen op de gewenste lengte. De diepte electrode is van belang voor het type opname nodig voor het experiment (dwz zet de elektroden bovenstaande dura voor EEG-registraties of gebruik stereotaxische coördinaten gedefinieerd hersenstructuren).
- Rijkelijk van toepassing cyanoacrylaat op basis van de transmitter to bestrijken het gebied en zorg ervoor om te voorkomen dat het coaten van de elektroden. Cyanoacrylaatlijm is een elektrische isolator, verontreinigende elektroden lijm waardoor er geen signaal.
- Als de opname van diepe hersenstructuren, monteren de zender van de canule houder en plaats het in de stereotaxische arm voor z-as controle. Laat de zender met behulp van de stereotaxische arm om diepte eigenen en plaats cyanoacrylaat gel rond de zender.
- Grondig droog schedel alvorens zender om sterke hechting te garanderen. Breng zender bedekt met cyanoacrylaat aan de schedel. Zorg ervoor dat de elektroden af te stemmen met bijbehorende braam gaten.
- Probeer schadelijke belangrijke vasculaire structuren te vermijden. Houd de zender plaats met lichte druk gedurende een minuut. Gebruik lichte druk om een sterke binding tussen de zender en de schedel vormen.
- Breng extra cyanoacrylaat, genoeg om volledig te dichten zender / schedel interface. Om ervoor te zorgen agood fit en sterke hechting maximaliseren de oppervlakte van de lijm die contact maakt met de schedel. Breng het cyanoacrylaat kleefmiddel in een cirkel rond de transmitter en let zowel schedel en de wand van de zender vallen.
- Worden chemische katalysator (0,1 ml) via een spuit rondom de cyanoacrylaat aan de basis van de geïmplanteerde zender. Gebruik versneller spaarzaam, zorg niet toe te passen op aangrenzende weefsel.
Opmerking: Chemische versnelling van het cyanoacrylaat uitharding zorgt dat de sterke binding tussen de zender en de schedel snel gevormd. Cyanoacrylaat katalysator is nuttig om snel uitharden van lijm, maar is niet noodzakelijk. - Verwijder de versneller door het wassen van het gebied grondig met steriele zoutoplossing. Cyanoacrylaat accelerator kan weefsel irritatie veroorzaken als niet gewassen uit het gebied van de incisie. Om het gebied te wassen, vult een 1,0 ml spuit met steriele zoutoplossing en irrigeren het gebied door middel van een injectienaald. In het algemeen 0,5 ml zoutoplossing voldoende uitwasbaarhet gaspedaal.
- Hechtdraad de huid rond de basis van de zender, maar hebben geen betrekking op de zender. Top van de zender moet boven de huid om efficiënt te verzenden neurale signalen. Huid moet redelijk strak om de zender en de lijm rond de eenheid. Gebruik Vicryl of zijde hechtdraad (zacht draad); huid in onvolgroeide dieren is zacht en is gemakkelijk beschadigd als soft hechtingen niet worden gebruikt. Voor volwassen dieren, gebruik geen hechtmateriaal.
- Verwijder dier uit stereotaxische frame en op warme deken voor herstel.
- Zorg voor dieren zijn warm (37 ° C) en ambulante (dwz, volledig hersteld) alvorens terug te keren naar de dam. Zorg ervoor dat het dier wordt gehydrateerd door knijpen de huid op de rug van het dier (als het dier is uitgedroogd, zal de huid vervormd blijven). Als dier is uitgedroogd, beheren subcutane injectie van Ringer's buffer. Laat het dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende weer bij bewustzijn is te handhavenborstligging.
- Dien buprenorfine (0,05 mg / kg) van de dieren postoperatieve pijn en een subcutane injectie van 0,1 ml bupivacaïne rond de injectieplaats.
Opmerking: Van start tot finish de hele procedure moet 5-10 min voor dieren van deze leeftijd (postnatale dag 6) worden ingevuld. Chirurgische kan langer duren voor oudere dieren.
- Dien buprenorfine (0,05 mg / kg) van de dieren postoperatieve pijn en een subcutane injectie van 0,1 ml bupivacaïne rond de injectieplaats.
3. Zorg en Wonen
Opmerking: sommige dammen mogelijk niet pups geïmplanteerd met het apparaat te tolereren. Dams moet mogelijk worden gekozen die tolerant. Het is aanvaardbaar dat de dam pups rond de kooi verplaatsen door ze op te pakken door de zender.
- Zodra de dieren worden gespeend, afzonderlijk-huisvesten ze aan de verwijdering van de apparaten uit hun kooi mate voorkomen.
- Euthanaseren dieren door letale dosis van pentobarbital (25 mg / kg) of isofluraan (in a bell jar) voor tekenen van nood aanwezig zijn.
- Let op, sommige dierverblijven kooien met draad inserts kan interFERE met de geïmplanteerde zenders. Zorg ervoor dat de hoogte van de draad insert controleren om ervoor te zorgen dat de dieren de zender gevangen tussen de 'bars' van de draad insert niet kunt krijgen. Raadpleeg uw dierenarts voor hulp.
4. Opname EEG
- Plaats het dier in een kooi op zichzelf of co-gehuisvest met nestgenoten en de dam. Echter, slechts één plaats geïmplanteerd dier in één kooi. Laat pups niet alleen laten in de opname kamer voor meer dan 2 uur. Monitor de dieren tekenen van nood en uitdroging.
- Sluit de bijgeleverde voeding aan op de ontvanger basis en controleer het lampje brandt. Sluit de ontvanger basis om een data-acquisitie systeem met behulp van (Bajonet Neil-Concelman) BNC-kabels.
- Plaats het dierenkooi bovenop de ontvanger base (figuur 2). De "signaal" moet gaan branden wijst op een zender is gedetecteerd. Gegevens kunnen nu worden opgenomen.
- To registreren gegevens, sluit de ontvanger base om een analoog-naar-digitaalomzetter en sluit de converter aan een computer (Figuur 1).
- Stel de sampling rate van de opname. Zorg ervoor dat de data goed is bemonsterd. Kies ten minste 250 Hz sampling rate (500 Hz is aanbevolen) voor het opnemen van (bandbreedte van de zender is 0,1-100 Hz).
- Sla gedigitaliseerde gegevens en te analyseren met behulp van signaalbewerkingseenheden softwarepakketten zoals Matlab.
5. EEG Analyse - General
- Voer FFT (fast Fourier transformaties) temporele EEG data te transformeren naar het frequentiedomein van 0-100 Hz.
- Voer een schatting van spectrale dichtheden (PSD) van de FFT met 256 Hann-venster segmenten op basis van de Welch methode en genormaliseerd met 10 x log 10 (PSD). Vermogen spectra tonen de specifieke frequenties die het EEG-signaal in de gewenste periode domineren.
- Groepsgegevens tussen dieren door middel van het gemiddelde van de PSD van elk dierover-tijd geëvenaard behandelingen. Maak 95% betrouwbaarheidsinterval van 1,96 x gemiddeld (PSD) / vierkantswortel (n) waarbij n is het aantal dieren (PSD sporen). Teken de gemiddelde en 95% betrouwbaarheidsintervallen van de gegevens naar een kwantitatieve verslag van de gehele frequentie inhoud van het EEG over cohorten dieren te genereren zoals vergelijken behandelde groepen versus controle groepen.
6. Perinatale hypoxie-ischemie (HI) Model Protocol
- Verdoven van de P6 - 7 rat pup met isofluraananesthesie (4% met 100% O 2) door het plaatsen van het dier in een anesthesie doos (doos met inbreng van verdoving vaporizer). Bij aanvang en tijdens de operatie controleer de teen-snuifje reflex om de 15 min. Het gebrek aan respons geeft voldoende anesthesie.
- Plaats de pup op zijn rug, de nek en scrub bloot met afwisselende toepassing van 70% ethanol en 10% betadine. Herhaal de ethanol / betadine scrub 3 keer.
- Maak een 1 cm incisie in de huid van de hals met scissors op de middenlijn van de nek. Til de huid met een tang en maken het knippen met een schaar. Verzorgen het spierweefsel bij het maken van de incisie niet te snijden.
- Gebruik stompe dissectie techniek om halsslagader bloot te leggen. Om stompe dissectie uit te voeren, gebruik van twee paren van stompe neus tang. Steek de uiteinden in het weefsel en laat de veerwerking van het chirurgische instrument het weefsel verspreid. Herhaal dit totdat halsslagader wordt blootgesteld. Identificeer de halsslagader door een heldere rode kleur en de aanwezigheid van zichtbare puls.
- Aparte halsslagader van de nervus vagus met stompe tang. Steek de stompe getipt tang tussen de slagader en de zenuw. Laat de tang en laat voorjaar werking van het gereedschap scheiden de halsslagader van de nervus vagus.
- Plaats aneurysma klemmen 4-5 mm uit elkaar op de halsslagader. Zorg ervoor dat de slagader met de klemmen niet beschadigd door het vermijden van snelle bewegingen.
- Cauterize de halsslagader tussen het aneurysma klemmen. Om de slagader cauterize, Raakt de slagader tussen de klemmen met een warme cauterizer tip. Nadat de slagader wordt gesneden, zorgen beide einden goed zijn dichtgeschroeid om bloeding te voorkomen.
- Verwijder de klemmen, sluit de nek incisie met 3 hechtingen. Alleen hechtdraad de huid, verzorgen het spierweefsel niet te hechten.
- Laat het dier herstellen gedurende 1 uur. Houd ademhaling van het dier en bloeden uit de hals. Als bloeden aanwezig is, hoeft het dier HI (stap 6.10) niet bloot.
- Plaats het dier in een temperatuur geregelde kamer bij 37 ° C en continu introduceren 8% O 2/92% N2 mengsel in de kamer voor 2 uur.
Representative Results
We ontwikkeld en geïmplementeerd het concept van opname EEG van een enkele volwassene knaagdieren, schematisch in figuur 1 Voor de goedkeuring IACUC proces, moet het ontwerp ook in bestaande institutionele dier faciliteiten te integreren.; Daarom is het systeem ontworpen om gemakkelijk in een standaard dierverblijf worden geïnstalleerd zonder het gebruik van extra ruimte: het dier zich in een normale "animal facility-afgifte" -behuizing kooi die binnenzijde is geplaatst van een ontvanger met geïntegreerde Faraday kooi te verminderen elektrische ruis. Het signaal van elke ontvanger base wordt uitgevoerd door draden van een digitizer die is aangesloten op een computer (figuur 1). Een enkele computer nodig om gegevens van maximaal 32 dieren gelijktijdig opgenomen afhankelijk van de mogelijkheden van de gebruiker data-acquisitiesysteem verzamelen. Dit type installatie verbruikt weinig energie en produceert weinig hitte, een kenmerk compatibel met geconditioneerde dier faciliteiten. Gegevens kunnen wordenweergegeven in real-time op het scherm, waardoor experimentele monitoring, en opgeslagen op lange termijn op externe harde schijven (10 TB opslag eenheid).
Om beschadiging door zwerfvuil-mates en pup kannibalisatie door de dam te minimaliseren, testten we diverse zender vormfactoren. Het uiteindelijke ontwerp was een overkoepelde cilinder; een vorm moeilijk voor ratten te bijten en beschadiging. Een individu zender op de schedel van een volwassen rat wordt getoond in Figuur 2A en een vroege versie van high-density (32 dieren) ontvanger basen en opnemen rigs waarbij standaard knaagdier behuizing geplaatst is getoond in figuur 2B. Energiezuinigheid was een zeer belangrijke overweging; kozen we capacitieve koppeling als datatransmissie protocol. De volgende ontwerp kan opnemen continue EEG langer dan 6 maanden, afhankelijk accucapaciteit (Figuur 2A). Muizen zo jong als postnatale dag 12 (P12, figuur 3A) en ratten zo jong als P6 (Figure 3B) tolereren de zender heel goed. Hechten van de zender naar de schedel met cyanoacrylaat stelt dieren groeien met de zender in de volwassenheid (figuur 3C), met behoud van continue verkrijgen van EEG data.
De unieke geminiaturiseerde vorm factor van de zender en draadloze interface leent zich voor het werken met dierlijke modellen van neo- en perinatale omstandigheden. De gegevens in Figuur 4 toont twee kanalen van EEG registratie van sub-acute aanval activiteit die hypoxische-ischemie (HI) infarct (halsslagader ligatie gevolgd door 2 uur van hypoxia met 8% O2 mengsel) in een P7 Sprague-Dawley volgt rat pup 13. De HI behandeling veroorzaakt een grote laesie in de hemisfeer ipsilateraal aan de geligeerde halsslagader. Hier, de opnames tonen een cluster van twee aanvallen gegeneraliseerd over beide hemisferen van de benadeelde hersenen. De zwarte trace toont EEG-activiteit in het halfrond contralaterale aan de laesie, deblue trace toont EEG in de ipsilaterale hemisferen (dwz op het gebied van de laesie). Terwijl convulsies in beide hersenhelften is het ispilateral hemisfeer toont EEG achtergrondonderdrukking, wat duidt op lopende hersenschade 21.
Status epilepticus kan bij volwassen ratten worden geïnduceerd door het injecteren van de dieren met de organofosfaat, DFP 22,23. De gegevens in figuur 5 tonen repetitieve EEG ontladingen, die indicatief zijn status epilepticus zijn (zie tijdelijke uitbreidingen figuur 5A, B). Onder het monster sporen, is het tijdsverloop van status epilepticus dan 12 uur geanalyseerd met niet-lineaire mixed effect model dat de intensiteit van de aanvallen kwantificeert tijd. De ernst van de status epilepticus wordt gedefinieerd door EEG macht in de gamma band (20-60 Hz). Hier werd de bovenbeschreven macht in 12 dieren gemiddeld en uitgezet in 12 uur met 95% betrouwbaarheidsintervallen. Th e gegevens blijkt een duidelijke toename van gamma macht binnen het eerste uur van de DFP behandeling, die blijft meer dan 12 uur gedurende welke de dieren continu werden gecontroleerd. De volgende analysemethode maakt een kwantitatieve maat voor de ernst van acute status epilepticus, een verschijnsel eerder geanalyseerd primair bij gedragsmetingen. Wij omvatten deze analysetechniek als voorbeeld, omdat het gebruik macht berekening in klassieke EEG bands en wordt veelvuldig gebruikt in preklinische studies voor het testen van de werkzaamheid van anticonvulsieve geneesmiddelen in ons laboratorium 24-26. Wellicht het meest waardevolle aspect van het maken van continue, ononderbroken draadloos opnamen met de draadloze telemetrie de mogelijkheid om te registreren abnormale spontane gebeurtenissen die zich voordoen bij lage incidentie. Dit soort gegevens tonen de brede toepasbaarheid van het draadloze transmitter.
554fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Schema van de Epoch opnamesysteem Het draadloze registratie systeem bestaat uit twee onderdelen: 1) een draadloos-schedel gemonteerde zender die versterkt de biosignaal, en 2) een ontvanger plaat geplaatst onder standaard knaagdieren behuizing. De uitgang van de ontvanger base een analoog signaal dat bestaat uit de gedemoduleerde biosignaal versterkt tot een maximum van 4 V piek-piek. Dit signaal kan vervolgens worden toegevoerd aan een data acquisitie systeem voor opname.
Figuur 2:. De zender en de ontvanger van dit specifieke draadloze zender (A) weegt 4 g en verdringt <1,4 cm3 volume en met een oppervlakte van 7 x 12 mm wordt gemakkelijk bevestigd aan de schedel van ratten en muizen. De zender kan 2 kanalen biopotentialen amplificeren tot 6 maanden, waarna de batterij drained. Grotere accu's kunnen worden gebruikt voor een langere opnametijd. Dieren worden in standaard knaagdier kooien bovenop de Epoch ontvanger (B). Getoond rechts is een vroeg voorbeeld van twee afzonderlijke opname tuig elk geschikt voor het opnemen van 16 dieren tegelijkertijd tonen dat relatief weinig ruimte (2 "x 4", ca. 60 cm x 120 cm) van elk van de opname installaties.
Figuur 3:. Implantatie van de draadloze zender in ratten en muizen De zender maakt continue EEG-registraties gedurende maximaal 6 maanden bij muizen zo jong als postnatale dag 12 (P12, boven). De middelste foto is van een P7 rat pup geïmplanteerd met de miniatuur zender. De zender blijft stevig aan de schedel als volwassen dier. Het dier aan de onderkant is P280 en werd geïmplanteerd met een schijnvertoning zender op de leeftijd van P7. Het systeem maakt het mogelijk simultatane en continue EEG-opnamen van meerdere dieren die ouder P7 door de spenen, het verminderen van het aantal nesten die nodig is voor pre-klinische, op lange termijn, EEG-monitoring studies.
Figuur 4: Dual-channel opnemen hypoxie-ischemie geïnduceerde aanvallen met het telemetriesysteem Dual-channel opnames van abnormale EEG met de draadloze telemetrie in een P7 rat pup na carotis ligatie (ischemie) gedurende 8% O 2 behandeling (hypoxie).. (A) en (B), uitgebreid uitzicht op de golfvormen. Epileptische activiteit is aanwezig in beide hemisferen (zwart, blauw) met aanzienlijke EEG onderdrukking aanwezig in het halfrond met ischemische infarct (blauw).
Figuur 5: Opname-status epileptiCUS bij volwassen ratten. Surface EEG-registraties (dwz durale) met de miniatuur draadloze telemetriesysteem in reactie op (DFP) behandeling in een volwassen rat diisopropylfluorfosfaat. De gearceerde perioden in de bovenste curve (A en B) zijn gedetailleerde weergave van de golfvormen in sporen hieronder. Gegevens die met de draadloze zender kan dan worden geanalyseerd in het frequentiedomein zodat statistische vergelijkingen in een cohort van dieren. (C) Gegevens zijn het gemiddelde en de 95% betrouwbaarheidsintervallen van gamma band vermogen (20-60 Hz) na DFP-geïnduceerde status epilepticus (N = 12) gedurende 12 uur na toediening van DFP.
Figuur 6:. Registratie van aanvallen en veranderingen in de EEG in een transgeen muismodel van vasculaire holle misvormingen Hier hebben we opnemen van een transgene muis (A) thbij ondergaat epileptische activiteit. Aanvankelijk moment normale EEG patroon (1); onmiddellijk voor de aanval is er een periode van pre-ictal verdieping (2), die wordt gevolgd door een cluster van vijf toevallen (3). Na de toevallen, abnormale ictal ontladingen in het signaal (4). Controle dier heeft geen aanvallen en geen abnormale EEG kenmerken (B).
Discussion
Het kan erg duur om langdurige elektrografische opnamen in kleine diermodellen van de ziekte. Door te vertrouwen op eenvoudige elektrische circuits en het benadrukken van een laag stroomverbruik, zijn we in staat om een zender (figuren 1 en 2) dat de kosten van de lange-termijn monitoring experimenten vermindert creëren. De totale kosten van een 6 maanden controle experiment kon zo laag zijn als $ 470, plus de kosten van het dier (~ $ 1,5 dier per diem, $ 200 zender). Het kleine formaat van de zender maakt continue ononderbroken elektrografische opnames dierenverblijf, pre-klinische modellen van menselijke ziekten, die zeer moeilijk te verkrijgen met aangebonden of radiofrequente-gebaseerde draadloze opnamesystemen (figuur 4) zijn. Tenslotte, de schedel bevestigd aard van de zender beperkt de operatietijd en stress van het dier die anders een experiment kan compromitteren. Hier tonen we proof-of-principle experimenten uit drie diffErent experimentele modellen van epilepsie: perinatale hypoxie-ischemie 13, 27, 28 in een rattenpup (figuur 4), DFP-geïnduceerde status epilepticus (figuur 5) en toevallen bij een genetisch-geïnduceerde model van caverneuze vaatmalformaties (figuur 6).
Misschien wel de meest cruciale aspect voor het verkrijgen-artefact vrij, op lange termijn elektrografische opnames is om ongeremd toegang elektrode naar de corticale regio van belang (figuur 4-6) te controleren. Dit omvat de gemeenschappelijke referentie / aardelektrode. Bijzonder kritisch is het bevestigen van de zender naar de schedel voor epidurale EEG-toepassingen. Daarbij is het mogelijk onbedoeld bekleden het uiteinde van de elektroden cyanoacrylaat gezien de zeer korte lengte van de elektroden. Coaten van de elektroden in cyanoacrylaat kan de EEG-signalen verzwakken of volledig te isoleren ze in de worst-case scenario. Evenzo gebrek aan goede elektrische verbinding between gemeenschappelijke referentie / massa en de hersenen van het dier voorkomt goede werking van de verschilversterker in de zender, waardoor een elektrisch 'noisy "signaal. Vaak, na een operatie, goede kwaliteit signalen kunnen worden gecompromitteerd tot 48 uur vanwege oedeemvorming rond de boorgaten in de schedel. Als het oedeem afneemt, signalen over het algemeen te verbeteren. Dit kan worden vermeden door het plaatsen van de elektroden op het oppervlak van de schedel zonder boorgaten. De gevolgen van dit proces verhoogd potentieel het bekleden van de elektroden cyanoacrylaat, verminderde hoogfrequente activiteit als gevolg van de laagdoorlaat elektrische eigenschappen van het schedelbeen, en de mogelijkheid om elektrisch te isoleren van de gemeenschappelijke referentie / gemalen waardoor ruis in de signalen. Het beoefenen correcte plaatsing van de elektroden kan met een dun stuk hout of fineer dat de dikte van de muis of rat schedel nabootst. De in dit manuscript resultaten illustreren het quateit van de opnames die kan worden verkregen met behulp van draadloze telemetrie technologie.
Chirurgische implantatie toepassing van de hierin beschreven werkwijze kan zo weinig als 10 minuten, afhankelijk van de complexiteit van de operatie. Voor chirurgische toegang tot diepe hersenstructuren zoals het CA1-gebied van de hippocampus, het het beste om de zender bevestigen aan een micromanipulator gemonteerd op een stereotaxisch frame. De micromanipulator zal de chirurg voorzien van de nauwkeurigheid van de zender implanteren volgens gepubliceerde stereotaxische coördinaten in de atlas van de muis 29 en 30 ratten hersenen. Dit kan gedaan worden door simpelweg hechten een stuk injectienaald slang aan de zender cyanoacrylaat en monteren van de hypodermische naald in de micromanipulator. Micromanipulator beheersing van x, y en z coördinaten verhoogde stabiliteit bij het monteren van de zender naar de schedel vóór hechten van de huid gesloten. De toevoeging van botschroeven rond het perimeter van de zender kan helpen verankeren de zender naar de schedel, hoewel ze niet noodzakelijk. Botschroeven kan effectief zijn, maar in sommige diermodellen van aanvallen en epilepsie, zoals lithium-pilocarpine-behandelde volwassen rat. Deze dieren hebben de neiging om spontaan convulsies met intense motorische activiteit die de zender tijdens de inbeslagneming kan beschadigen hebben. Aanvullende complexiteit kan worden toegevoegd om deze experimenten. Bijvoorbeeld, de zender is compatibel met vele verschillende modellen van traumatisch hersenletsel, zoals gecontroleerde corticale invloed 31. De duurzaamheid van de zendinrichting werd getest door het implanteren van dieren zenders op P7, en vervolgens ze te huisvesten in de dieren faciliteit. Na 12 maanden meeste implantaten intact op de schedel. Bij dieren werden gedood, de schedels normaal lijkt te zijn en de zender is verankerd in het schedelbot, hetgeen aanzienlijke kracht om het uit te pakken. Wees voorzichtig bij het diepe hersenstructurenzijn onderzocht; de hersenen groeit en de elektroden stil blijven, zou de uiteindelijke positie van de elektroden worden verwacht veranderen. Voor de hier beschreven technieken werden de elektroden typisch boven de dura, waardoor zowel de hersenen en de schedel te groeien en positioneringen hun oorspronkelijke positie blijven. De beperkende factor in hoe lang de zender kan worden gebruikt, is de grootte van de batterij (dat wil zeggen tot de batterij leeg is).
Een self-contained monolithische ontwerp (de zender is ingebed in hard epoxy) van de behuizing van de zender leent zich om te gebruiken met onvolwassen pups ondergebracht bij de dam en hun nestgenoten. Vaak co-housing geïmplanteerde dieren met vast aanbinden leidt tot de vernietiging van de geïmplanteerde apparatuur of cannibalization van de pups door de dam. De gladde wanden vorm van de zender maakt voor implantatie met vrijwel geen hardware storing of verlies van pups als gevolg van kannibalisatie.
Disclosures
Drs. Lehmkuhle en Dudek een financieel belang in Epitel, Inc., ontwerpers van de Epoch draadloze biopotential opnamesysteem.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke R43 / R44 NS064661.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Powder Free Sterile Latex Surgical Glove |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
| Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
| Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
| Fine burr | FST | 19007-07 | |
| Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
| Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
| Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
| Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
| Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
| Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
| Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
| Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
| Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
| Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
| Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
| PC-compatible computer |
References
- Boylan, G. B., Stevenson, N. J., Vanhatalo, S. Monitoring neonatal seizures. Semin. Fetal Neonatal Med. 18 (4), 208-208 (2013).
- Panzica, F., Varotto, G., Rotondi, F., Spreafico, R., Franceschetti, S. Identification of the Epileptogenic Zone from Stereo-EEG Signals: A Connectivity-Graph Theory Approach. Front Neurol. 6 (4), 175 (2013).
- Arciniegas, D. B. Clinical electrophysiologic assessments and mild traumatic brain injury: state-of-the-science and implications for clinical practice. Int J Psychophysiol. 82 (1), 41-52 (2011).
- Mizrahi, E. M., Kellaway, P. Cerebral concussion in children: assessment of injury by electroencephalography. Pediatrics. 73 (4), 419-425 (1984).
- Pisarenco, I., Caporro, M., Prosperetti, C., Manconi, M. High-density electroencephalography as an innovative tool to explore sleep physiology and sleep related disorders. Int J Psychophysiol. S0167-8760 (14), 3-8 (2014).
- Konadhode, R. R., et al. Stimulation of MCH neurons increases sleep. J. Neurosci. 33 (25), 10257-10263 (2013).
- Bertram, E. H., Williamson, J. M., Cornett, J. F., Spradlin, S., Chen, Z. F. Design and construction of a long-term continuous video-EEG monitoring unit for simultaneous recording of multiple small animals. Brain Res. Protoc. 1-2 (1), 85-97 (1997).
- Stables, J. P., et al. Therapy discovery for pharmacoresistant epilepsy and for disease-modifying therapeutics: Summary of the NIH/NINDS/AES Models II Workshop. Epilepsia. 44 (12), 1472-1478 (2003).
- White, A. M., et al. Efficient unsupervised algorithms for the detection of seizures in continuous EEG recordings from rats after brain injury. J. Neurosci. Methods. 152 (1-2), 255-266 (2006).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The ontogeny of seizures in a rat model of limbic epilepsy: evidence for a kindling process in the development of chronic spontaneous seizures. Brain Res. 625 (2), 295-300 (1993).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The evolution of a rat model of chronic spontaneous limbic seizures. Brain Res. 661 (1-2), 157-162 (1994).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. J. Neurosci. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous electroencephalographic monitoring with radio-telemetry in a rat model of perinatal hypoxia-ischemia reveals progressive post-stroke epilepsy. J. Neurosci. 30 (1), 404-415 (2010).
- Galanopoulou, A. S. Basic mechanisms of catastrophic epilepsy -- overview from animal models. Brain Dev. 35 (8), 748-756 (2013).
- Lerche, H., et al. Ion channels in genetic and acquired forms of epilepsy. J Physiol. 591 (Pt 4), 753-764 (2013).
- Rossignol, E., et al. WONOEP appraisal: new genetic approaches to study epilepsy). Epilepsia. 55 (8), 1170-1186 (2014).
- Westmark, C. J., et al. Reversal of fragile X phenotypes by manipulation of AβPP/Aβ levels in Fmr1KO mice. PLoS One. 6 (10), e26549 (2011).
- Sukhotinsky, I., et al. Optogenetic delay of status epilepticus onset in an in vivo rodent epilepsy model. PLoS One. 8 (4), e62013 (2013).
- Krook-Magnuson, E., Armstrong, C., Oijala, M., Soltesz, I. On-demand optogenetic control of spontaneous seizures in temporal lobe epilepsy. Nat Commun. 4, 1376 (2013).
- Paz, J. T., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nat Neurosci. 16 (1), 64-70 (2013).
- Monod, N., Pajot, N., Guidasci, S. The neonatal EEG: statistical studies and prognostic value in full-term and pre-term babies. Electroecephalogr Clin Neurophysiol. 32 (5), 529-544 (1972).
- Deshpande, L. S., Carter, D. S., Blair, R. E., DeLorenzo, R. J. Development of a Prolonged Calcium Plateau in Hippocampal Neurons in Rats surviving Status Epilepticus Induced by the Organophosphate Diisopropylfluorophosphate. Toxicol Sci. 116 (2), 623-631 (2010).
- Todorovic, M. S., Cowan, M. L., Balint, C. A., Sun, C., Kapur, J. Characterization of status epilepticus induced by two organophosphates in rats. Epilpsy Res. 101 (3), 268-276 (2012).
- Lehmkuhle, M. J., et al. A simple quantitative method for analyzing electrographic status epilepticus in rats. J. Neurophysiol. 101 (3), 1660-1670 (2009).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J. Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Pouliot, W., et al. A comparative electrographic analysis of the effect of sec-butyl-propylacetamide on pharmacoresistant status epilepticus. Neuroscience. 12 (231), 145-156 (2012).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Vannucci, R. C., Vaccucci, S. J. A model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Ann N Y Acad Sci. 835, 234-249 (1997).
- Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2013).
- Bolkvadze, T., Pitkanen, A. Development of post-traumatic epilepsy after controlled cortical impact and lateral fluid-percussion-induced brain injury in the mouse. J. Neurotrauma. 29 (5), 789-812 (2012).
