Abstract
Mange progressive neurologiske sykdommer hos mennesker, slik som epilepsi, krever pre-kliniske dyremodeller som langsomt utvikler sykdommen for å teste intervensjoner på ulike stadier av sykdommen. Disse dyremodeller er spesielt vanskelig å gjennomføre i umodne gnagere, en klassisk modell organisme for laboratoriestudie av disse lidelsene. Opptak kontinuerlig EEG hos unge dyremodeller av beslag og andre nevrologiske lidelser presenterer en teknisk utfordring på grunn av den lille fysiske størrelsen av unge gnagere og deres avhengighet av demningen før avvenning. Derfor er det ikke bare et klart behov for forbedring av pre-klinisk forskning som vil bedre å identifisere slike behandlinger som er egnet for oversettelse til klinikken, men også et behov for nye enheter i stand til å ta opp kontinuerlig EEG i umodne rotter. Her beskriver vi teknologien bak og viser bruk av en ny miniatyr-telemetrisystem, spesielt konstruert for bruk i umodne rotter or mus, som også er effektive for bruk hos voksne dyr.
Introduction
Den eldste - og fortsatt den mest brukte - teknikk for opptak biopotentials i hjernen er elektroencefalogram (EEG). Den brukes klinisk for nevrologiske abnormiteter, inkludert beslag deteksjon 1, lokalisering av anfall foci to, og diagnostisering av hjernerystelse 3,4. Denne teknikken er også mye brukt for å gi grunnleggende informasjon om mekanismene for søvn og å diagnostisere søvnforstyrrelser 5,6.
Som i den kliniske diagnose av epilepsier, har EEG blitt uunnværlig for translasjonell forskning i dyremodeller av både genetiske og ervervede epilepsi. I gjeldende forskningssøknader, "fast" eller "tethered" opptak er standard, og er rutinemessig utført hos voksne gnagere i uker av gangen 7. Men elektrisk støy, bevegelse gjenstander, og risikoen for at tethered dyr vil skade seg selv ved å trekke i kabelen har lange compromised disse eksperimentene. Derfor, for å forbedre eksperimentelle forhold og suksessrate, må vi utvikle nye teknologier som ville tillate for eliminering av den kablede grensesnittet mellom dyr og instrumentering. Den mest åpenbare område i utvikling er design og implementering av telemetri systemer som gjør det mulig for høykvalitets opptak, og samtidig opprettholde en lang levetid og minimere ubehag for dyr fag. Redusere den fysiske størrelsen på disse enhetene vil gjøre translasjonsforskning i neonatale og juvenile gnager modeller av nevrologiske lidelser.
Lave kanal-count EEG opptak i rotter er ansatt i stor utstrekning for å utvikle nye behandlingsformer for å undertrykke epileptiske anfall i stand til oversettelse til mennesker. Opptak fra en eller flere områder for en lengre periode åpne mange muligheter for å bruke gnagermodeller for epilepsi i translasjonell forskning. Mye av moderne forskning på dette området har som mål å hindre forekomsten av kronisk Seizures eller utviklingen av epilepsi (dvs. epileptogenesis), og slike forskningsinnsats krever omfattende om ikke kontinuerlig EEG-overvåkning for å bestemme effektiviteten av den foreslåtte behandlingen 8; en liten, enkel, telemetrisk system med én, to eller fire kanaler som opererer mellom 0,1-100 Hz per kanal vil sterkt fremme denne type translasjonell forskning. Elektrografisk anfall oppstår ofte med minimale atferd (sikkert uten kramper), som begrenser nytten av analyser basert på beslag atferds. Strategien med å kombinere EEG opptak og samtidig videoovervåking tillater en mulighet til å fange hvert anfall; og dessuten disse analytiske tilnærminger kan tillate kvantitativ vurdering av interiktal toppene som oppstår i epileptiske hjernen mellom "ictal" (eller anfall) hendelser 9. Videre, muligheten til å få en kontinuerlig høy kvalitet, lave artefakt EEG opptak, hvor trådløs teknologi er genereltoverlegen, vil gi rom for utvikling av bruk av PC-baserte algoritmer for å studere spesifikke EEG-kurver (f.eks theta, gamma), samt automatisk registrering av anfall, noe som reduserer arbeidsmengden eksperimentator.
Den primære preklinisk modell for å studere kronisk epilepsi etter hjerneskade er den voksne rotte eller mus, enten gjennom en chemo-konvulsiv (dvs. kainsyre eller pilokarpin) eller elektrisk indusert status epilepticus (SE), som etterfølges av kronisk epilepsi. Under disse forholdene, kan alvorlige kramper i forbindelse med SE eller de påfølgende beslag i epileptiske dyr føre til skader fra dyret rive eller trekke i fortøyningen og løsne skruene som holder å feste en headcap. Til syvende og sist er det dette problemet som regel avslutter disse eksperimentene, og likevel behovet for å skaffe langsiktige høyoppløselige EEG poster for eksperimenter som tar sikte på å utvikle nye behandlingsformer for kroniskeepilepsi er det viktigste. I tillegg, bolig, overvåking og analyse av data fra langsiktig implantert dyr er en betydelig investering i både direkte kostnader og etterforsker tid; derfor kan tidlig avslutning av forsøket medføre betydelige kostnader til forskerne. Som disse modellene av epilepsi fremgang, beslag vanligvis blitt hyppigere og mer alvorlige 10-12, noe som øker sannsynligheten for at dyr blir skadet, akkurat som sin nytteverdi for å utvikle nye behandlingsformer blir størst. Disse dyrene kan rutinemessig utvikle dusinvis av krampeanfall per dag, som ofte oppstår i klynger 13.
Sannsynligvis en av de viktigste utviklingen i biomedisinsk vitenskap har vært bruk av genet målretting i musemodeller. Denne tilnærmingen har tillatt, og vil fortsette å tillate utvikling av dyremodeller av genetisk epilepsi som reproduserer faktiske humane syndromer 14-16. Genetiske manipulasjoner kan foretas somproof-of-prinsippet terapi for å undertrykke epileptiske anfall eller blokkere utviklingen av epilepsi etter hjerneskade 17-20. Denne type forskning vil dra dramatisk fra evnen til å utføre høy gjennomstrømming kontinuerlig opptak av EEG. For tiden er det mulig å ta opp fra mus med enten tethered eller telemetri systemer; Men utfordringene med å skaffe høy kvalitet artefakt-free opptak er vesentlig vanskeligere enn rotter, og ofte dette krever ulike former for ryggsekker som mus kontinuerlig forsøker å fjerne. Stress kan øke anfalls alvorlighetsgrad, frekvens og / eller varighet, og derfor vil til slutt endre epilepsi av forsøksdyrene, og dermed blander sammen studien. En liten, lett, lav profil miniatyr telemetri system vil lette opptak av langsiktig EEG fra genetiske musemodeller av sykdom hos mennesker.
I tillegg til de ovenfor beskrevne problemene, innspilling EEG i umodne gnager modells av sykdom har sin egen unike sett av utfordringer. Umodne dyr kan veie så lite som 6 g (P8 mus) til 17 g (P6 rotte). Det er nesten umulig å lage serie multi-dagers tethered EEG opptak på grunn av økt stress fra fortøyningen og manglende evne til å tillate naturlig oppdrett av valpen ved demningen. Inntil dyrene er avvent, må de forbli i omsorgen av demningen. Dammen er utsatt for å ødelegge noen ekstern kontakt forsamlingen på valpen, avslutte valpen, og i noen tilfeller si opp hele kullet. Videre gjør den umodne gnager skallen det vanskelig å montere noen elektrode søyle til skallen med mekanisk integritet. Disse utfordringene, som er unike for umodne gnagere, krever en ny løsning for å lage robuste, langsiktige elektrografisk opptak. Her har vi fokus på å demonstrere implantasjon og registrering av EEG ved hjelp av en roman miniatyr trådløs sender og presentere tre proof-of-prinsippet eksperimenter som eksempler for bruk av miniatyr trådløs telemetri system: 1) immoden rotteunge modell av hypoksi-ischemi, 2) voksne mus behandlet med DFP for å indusere status epilepticus og påfølgende spontan beslag, og 3) genetisk modell av vaskulære misdannelser kavernøse som resulterer i anfall og død hos voksne mus.
Miniatyr trådløs telemetri system er designet for å møte fire hoved krav: (1) minimal invasiv kirurgisk implantering; (2) kompatibilitet for boliger av gnager unger med demningen og kullsøsken; (3) lavt strømforbruk på enheten, og dermed gir for måneder med kontinuerlig overvåkning uten kirurgisk re-implantasjon; og (4) evne til å ta opp høykvalitets EEG-kurver med minimal bevegelse gjenstander. Den trådløse senderen veier <0,6, 2,3 og 4 g og er <0,3, 0,8 og 1,4 cm 3 avhengig av batteriet med en grunnflate på 5 x 7, 7 x 9, eller 7 x 12 mm som monteres enkelt i skallen av dyret med cyanoakrylat gel. Ingen bein skrue ankere for å sikkert feste enheten tilskallen, redusere antall hull som må bores i skallen, og operasjonen tid. Anordningen er i stand til å forsterke to kanaler med EEG eller lokale feltpotensialer fra dype strukturer i hjernen, slik som i hippocampus, i over to uker, to måneder eller 6 måneder i denne konfigurasjonen. Den lille størrelsen på den trådløse senderen reduserer risikoen for infeksjon, øker dyr mobilitet, og til slutt reduserer morbiditet og mortalitet som ellers øker den tid, penger og antall dyr som trengs for et eksperiment. Alt av elektronikk og batteri blir puttet i medisinsk-grade epoxy som gjør at enheten vanntett og tøff, hindrer demningen fra å tygge på senderen som ellers kunne gjengi enheten ubrukelig. I motsetning til radiofrekvenssendere, bruker telemetrisystemet kapasitiv kopling mellom sender og en mottakerantenne som sitter under dyrets bur, slik at brukeren kan holde dyr i standard gnager boliger. Flere kanaler recording tillate opptak av multimodale biopotentials, for eksempel elektro og elektroencefalogram. Dyremodeller av komorbiditet vil ha nytte av muligheten til å ta opp biopotentials løpet oppførsel 21-23. Kombinere atferd med EEG overvåking vil gi forskere med et bedre verktøy for forskning og pre-kliniske studier.
Protocol
Følg institusjonelle retningslinjer for dyr omsorg for kirurgisk verktøy sterilisering, og endre protokollen som er nødvendig for å følge de retningslinjer og innhente godkjenning av institusjonens Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Kirurgisk Forberedelse
- Rengjøre og forberede senderen for å sikre trygge og sterile kirurgi. Ta av senderen fra den antistatiske emballasjen og enten spray eller suge i 70% etanol. Skyll sender med sterilt saltvann og sted mellom sterile bomulls svamper dynket i sterilt saltvann eller holde nedsenket i sterilt saltvann.
- Samle og sterilisere verktøyene som kreves for kirurgi; damp autoklav for sterilisering. Se tabell av materialer og reagenser for listen over kirurgiske verktøy.
2. Kirurgisk Implantasjon
- Bedøve dyr og vedlikeholde anestesi ifølge IACUC-godkjent protokoll. Ved oppstart og under surgery sjekke tå-pinch refleks hver 15 min. Mangel på respons indikerer tilstrekkelig grad av anestesi.
- For valper, bruke anestesi ved isofluran (4%) med O 2 (100%). For voksne bruker ketamin (100 mg / kg) med xylazin (10 mg / kg).
- Fix posisjon i stereotaksisk ramme. Plasser øre bar tips i øregang. Ikke overdrevent stramme øret barer som skallen er veldig myk i små rotteunger. Fest anestesi nesen membran.
- Holde dyret varmt under operasjonen ved å plassere den på varmeputen er satt til 37 ° C. Hos voksne dyr, gjelder smøring salve til øynene til dyret.
- Sterilisere innsnitt området og opprettholde sterile kirurgiske feltet.
- Vattpinne hodebunnen med skiftende anvendelser av 70% etanol og betadine. Begynn i midten av hodebunnen og gjør stadig bredere konsentriske sirkler.
- Dekk dyret med drapere og gjennomføre operasjonen i løpet drapert dyr. Opprettholde klorle kirurgiske feltet ved å stille den kirurgiske set-up med sterile forheng, sprøyteutstyr med 70% etanol.
- Bruk sterile kirurgiske hansker og kappe (eller som kreves av institusjonen). For å opprettholde sterile feltet, bruk en kirurgisk assistent.
- Lag et snitt i hodebunnen av dyret litt bak øynene langs midtlinjen, ca 2 cm. Vær forsiktig når du setter skalpellen som skallen er fortsatt veldig myk i små rotteunger. Gjør et enkelt kutt så snittet blør mindre, og helbreder raskere.
- Expose skallen. Forbered et rent og tørt sted å maksimere bindingen mellom senderen og bein i skallen. Bruk aneurisme klipp å forstå hodebunnen.
- Dra forsiktig hodebunnen bort fra midtlinjen på fire hjørner. Se etter anatomiske landemerker som bregma og lambda i skallen. Husk skallen bein er ikke smeltet i dyr i denne alderen. Bruk Paxinos atlas av stereotaksiske koordinater for å finne den riktige plasseringen for graden hullet.
- Bruk en Dremel-type verktøy med en Burr-type borekronen. Lag to Burr hull i ønskede posisjoner opptak med hullene blir større enn 300 mikrometer i diameter. Plasser graden hull for referanseelektroden over cerebellum bak lambda av skallen.
- Sikre at ledningene på senderen er på linje med de grad hull. Hvis elektrode ledningene ikke er like lange, er lim forurensning av elektrodene sannsynlig, og vil resultere i dårlig signal. Å justere ledninger, sjekk anfall av senderen og forsiktig bøye elektroder til å stille opp i løpet av de tiltenkte områder for grad hull.
- Trim elektrode fører. Bruk av kirurgiske sakser for å trimme elektrodene til den ønskede lengde. Elektroden dybde er viktig for den type opptak kreves for forsøket (dvs. sett elektrodene over dura for EEG opptak, eller bruk stereotaksiske koordinater for definerte strukturer i hjernen).
- Rikelig anvendelse cyanoakrylat på undersiden av senderen to dekke området og pass på å unngå belegg på elektrodene. Cyanoakrylatlim er en elektrisk isolator, forurensende elektroder med lim vil resultere i ikke noe signal.
- Hvis du tar opp fra dype strukturer i hjernen, montere senderen på kanyleholderen og plassere den i stereotaxic arm for z-aksen kontroll. Senk senderen bruker stereotaxic arm til passende dybde og plassere cyanoacrylate gel rundt senderen.
- Helt tørre skallen før du plasserer senderen for å sikre sterkt lim obligasjon. Påfør senderen belagt med cyanoakrylat til skallen. Vær nøye med å justere elektroder med tilsvargrad hull.
- Prøv å unngå skadelige store vaskulære strukturer. Hold senderen på plass med et lett trykk i ett minutt. Bruk lett trykk for å danne en sterk binding mellom senderen og hodeskallen.
- Påfør ekstra cyanoacrylate, nok til å forsegle senderen / skull grensesnitt. For å sikre agood passform og sterk binding, maksimere arealet av det limet som kommer i kontakt med skallen. Påfør cyanoacrylate limet i en sirkel rundt senderen, noe som gjør at både hodeskallen og veggen til senderen er dekket.
- Anvende kjemisk accelerant (0,1 ml) via en sprøyte rundt cyanoakrylat i bunnen av den implanterte senderen. Bruk accelerant sparsomt, tar seg ikke å gjelde til omkringliggende vev.
Note: Kjemisk akselerasjon av cyanoakrylat herde sikrer at den sterke binding mellom senderen og skallen dannes raskt. Cyanoakrylat accelerant er nyttig for herding av klebemiddelhastighet, men er ikke nødvendig. - Fjern brennbar ved å vaske området grundig med sterilt saltvann. Cyanoakrylat-akselerator kan forårsake irritasjon av vev hvis ikke vasket fra området av snittet. Å vaske området, fylle en 1,0 ml sprøyte med sterilt saltvann og vanne området gjennom en sprøyte nål. Vanligvis 0,5 ml saltvann er nok til å vaske utakseleratoren.
- Sutur huden rundt bunnen av senderen, men dekker ikke senderen. Øverst på senderen må være over huden for å effektivt overføre nervesignaler. Huden bør være rimelig stramt rundt senderen og lim rundt enheten. Bruk Vicryl eller silke sutur (soft tråden); Huden i umodne dyr er myk og blir lett skadet hvis myke sting ikke blir brukt. For voksne dyr, bruke noen suturering materiale.
- Fjern dyret fra stereotaxic ramme og plassere på oppvarmet teppe for utvinning.
- Sikre dyrene er varm (37 ° C) og ambulerende (dvs. helt restituert) før retur til demningen. Sikre at dyret er hydrert ved å knipe huden på dyrets rygg (hvis dyret er dehydrert, vil huden forbli deformert). Hvis dyret er dehydrert, administrere subkutan injeksjon av Ringer Laktat buffer. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholdesternal recumbency.
- Administrere buprenorfin (0,05 mg / kg) til dyr for post-kirurgisk smertebehandling og en subkutan injeksjon av 0,1 ml bupivacain rundt injeksjonsstedet.
Merk: Fra start til slutt hele prosedyren skal være ferdig i 5-10 min for dyr i denne alderen (postnatal dag 6). Kirurgisk tid kan det ta lengre tid for eldre dyr.
- Administrere buprenorfin (0,05 mg / kg) til dyr for post-kirurgisk smertebehandling og en subkutan injeksjon av 0,1 ml bupivacain rundt injeksjonsstedet.
3. Care og Bolig
Merk: Noen demninger kan ikke tolerere valper implantert med enheten. Demninger kan trenge å bli valgt som er tolerant. Det er akseptabelt for dammen for å flytte valper rundt buret ved å plukke dem opp av senderen.
- Når dyrene er avvent, enkeltvis-huse dem for å unngå fjerning av enhetene fra buret kompis.
- Avlive dyrene ved dødelig dose av pentobarbital (25 mg / kg) eller isofluran (i en glassklokke) når tegn på lidelse er tilstede.
- Merk, noen dyr bolig bur med nettinginnsatser kan interFere med de implanterte sendere. Husk å sjekke høyden på ledningen innsatsen for å sørge for at dyr ikke kan få senderen fanget mellom "barer" av ledningen innsatsen. Ta kontakt med veterinær for å få hjelp.
4. Opptak EEG
- Plasser dyr i et bur i seg selv eller ko-huset med kullsøsken og demningen. Imidlertid sted bare en implantert dyr i et enkelt bur. Ikke la unger alene i innspillingen kammeret i mer enn 2 timer. Overvåke dyr for tegn på stress og dehydrering.
- Koble den medfølgende strømforsyningen til mottakeren base og kontrollere strømlampen lyser. Koble mottakeren basen til en datainnsamling system som bruker (Bayonet Neil-Concelman) BNC kabler.
- Plasser dyret bur på toppen av mottakerbasis (figur 2). Den "signal" lyset skal lyse opp som indikerer en sender har blitt oppdaget. Data kan nå bli registrert.
- To registrere data, koble mottakeren basen til en analog-til-digital omformer og koble omformeren til en datamaskin (figur 1).
- Sett samplingsfrekvens på opptaket. Sikre dataene er samplet riktig. Velge minst 250 Hz samplingsfrekvens (500 Hz anbefales) for opptak (båndbredde fra senderen er 0,1 til 100 Hz).
- Lagre digitaliserte data og analysere ved hjelp av signalbehandlingsprogramvarepakker som Matlab.
5. EEG analyse - Generelt
- Utfør FFTs (Fast Fourier transformasjoner) for å forvandle time EEG data til frekvensområdet fra 0-100 Hz.
- Utfør et estimat av makt spektral tetthet (PSD) fra FFT bruker 256 Hann-vinduet segmenter basert på Welch metode og normalisert med 10 x log 10 (PSD). Strøm spektra viser bestemte frekvenser som dominerer EEG signal over ønsket tidsrom.
- Gruppe data på tvers av dyrene ved å ta gjennomsnittet av PSD fra hvert dyrover tid matchet behandlinger. Lag 95% konfidensintervall av 1,96 x mean (PSD) / kvadratrot (n) der n er antall dyr (PSD spor). Plott de midlere og 95% konfidensintervall for dataene for å generere en kvantitativ rapport over hele frekvensinnholdet av EEG tvers kullene av dyr som sammenligner behandlede grupper sammenlignet med kontrollgrupper.
6. Perinatal Hypoksi-iskemi (HI) Modell Protocol
- Anesthetize P6 - 7 rotteunge bruker isoflurananestesi (4% med 100% O 2) ved å plassere dyret i en anestesi boks (boks med innspill fra anestesi fordamper). Ved oppstart og under operasjonen sjekk tå-pinch refleks hver 15 min. Mangel på respons indikerer tilstrekkelig grad av anestesi.
- Plasser valpen på ryggen, utsetter nakken og skrubb med vekslende anvendelser av 70% etanol og 10% Betadine. Gjenta etanol / betadine skrubb tre ganger.
- Foreta en 1 cm innsnitt i huden i nakken med scissors på midtlinjen av nakken. Løft huden med pinsett og gjøre kutt med saks. Pass på å ikke kutte muskelvev når du gjør snittet.
- Bruk stump disseksjon teknikk for å avsløre halspulsåren. For å utføre stump disseksjon, bruke to par butte-nese tang. Sett spissene inn i vevet, og la fjærvirkningen av det kirurgiske instrumentet spre vev. Gjenta til arteria carotis er utsatt. Identifiser halsarterie ved en rød farge, og tilstedeværelsen av synlig puls.
- Separat halspulsåren fra nervus vagus med butte pinsett. Sett inn butte-tipped tang mellom arterie og nerve. Slipp pinsett og la våren handling av verktøyet skille carotis fra nervus vagus.
- Place aneurism klemmer 4-5 mm fra hverandre på halspulsåren. Pass på å ikke skade arterien med klemmene ved å unngå raske bevegelser.
- Cauterize halspulsåren mellom aneurism klemmer. Å cauterize arterienTrykk på såre mellom klemmene med en varm cauterizer tips. Etter at arterien blir kuttet, at begge ender er skikkelig kauteriseres for å unngå blødning.
- Fjern klemmene, lukker halsen snittet med tre sting. Bare sutur huden, tar seg ikke å sy muskelvev.
- At dyret kan komme i 1 time. Overvåk pust dyrets og blødning fra halsen. Hvis blødningen er til stede, ikke påfører dyret HI (trinn 6.10).
- Plasser dyret i et temperaturregulert kammer ved 37 ° C og kontinuerlig innføre 8% O 2/92% N2 blandingen inn i kammeret i 2 timer.
Representative Results
Vi utviklet og implementert konseptet med å samle inn EEG fra en enkelt voksen gnager, skjematisk i figur 1 For IACUC godkjenningsprosessen, må utformingen integrere godt inn i eksisterende institusjonelle dyrefasiliteter.; Derfor er systemet designet for å være lett å installere i en standard dyrefasilitet uten bruk av ekstra plass: dyret er plassert i en vanlig "dyrefasilitet-issue" boliger bur som er plassert på innsiden av en mottaker med en integrert Faraday-bur for å redusere elektrisk støy. Signalet fra hver mottaker basen er utført av ledninger til en digitaliserings som er koblet til en datamaskin (figur 1). En enkelt datamaskin er nødvendig for å samle inn data fra opp til 32 dyr registrert samtidig, avhengig av evnen til brukerens datainnsamlingssystemet. Denne typen oppsett bruker lite strøm og produserer lite varme, en funksjon kompatibel med klima-kontrollerte dyrefasiliteter. Data kan værevises i sanntid på skjermen, slik at eksperimentell overvåking og lagret langsiktig på eksterne harddisker (10 TB lagringsplass enhet).
For å minimere skaden ved kull-kamerater og valp kannibalisering ved demningen, vi testet ulike senderen formfaktorer. Den endelige utformingen var et kuppelformet sylinder; en form som er vanskelig for rotter til å bite og skade. En individuell senderen på hodeskallen til en voksen rotte er vist i figur 2A, og en tidlig versjon av høy tetthet (32 dyr) mottaker baser og opptak rigger hvor standard gnagerhuset er anordnet er vist i figur 2B. Strømutbyttet var en ekstremt viktig faktor; Vi valgte kapasitiv kobling som en dataoverføringsprotokoll. Følgende design tillater opptak kontinuerlig EEG i over seks måneder, avhengig av batterikapasitet (Figur 2A). Mus så unge som postnatal dag 12 (P12, figur 3A) og rotter så unge som P6 (Figure 3B) tolerere senderen ganske godt. Hvis man følger senderen til skallen med cyanoakrylat gjør at dyrene til å vokse med senderen til voksen alder (figur 3C), under opprettholdelse av kontinuerlig anskaffelse av EEG-data.
Den unike miniatyrisert formfaktor på senderen og trådløst grensesnitt gir seg for arbeid med dyremodeller av neo og perinatale forhold. Dataene i figur 4 viser to kanaler av EEG opptak av sub-akutt anfall aktivitet som følger hypoksisk-iskemisk (HI) infarkt (arteria carotis ligering, etterfulgt av 2 timer med hypoksi med 8% O 2 blanding) i en P7 Sprague-Dawley rotteunge 13. HI behandling fører til en stor lesjon i halvkule ipsilaterale til ligert carotis. Her opptakene viser en klynge av to anfall generalisert over begge halvkuler av den skadde hjernen. Den svarte spor viser EEG-aktivitet i den halvkule kontralateralt til lesjonen, denblå strek viser EEG i ipsilaterale halvkuler (det vil si i området av lesjonen). Mens anfallet aktivitet er til stede i begge halvkuler av hjernen, viser ispilateral halvkule EEG bakgrunn undertrykkelse, som er en indikasjon på pågående hjerneskade 21.
Status epilepticus kan induseres hos voksne rotter ved å injisere dyrene med organofosfat, DFP 22,23. Dataene i figur 5 viser EEG gjentatte utladninger, som er en indikasjon på status epilepticus (se tidsbestemte utvidelser figur 5A, B). Under prøven spor, tiden løpet av status epilepticus over 12 timer er analysert med en ikke-lineær blandede effekter modell som kvantifiserer intensiteten av beslagene over tid. Alvorlighetsgraden av status epilepticus er definert av EEG kraft i gamma band (20-60 Hz). Her ble den ovenfor beskrevne kraft i gjennomsnitt over 12 dyr og plottet over 12 timer med 95% konfidensintervall. Th e data viser en markant økning i gamma makt innenfor den første timen av DFP behandling, som vedvarer over 12 timer hvor dyrene ble kontinuerlig overvåket. Den følgende analysemetoden gjør det mulig for en kvantitativ måling av alvorlighetsgraden av akutt status epilepticus, et fenomen som tidligere analysert primært med atferdsmessige tiltak. Vi inkluderer denne analyseteknikken som et eksempel, fordi den utnytter effektberegnings i klassiske EEG band, og har vært mye brukt i prekliniske studier for å teste effekten av antikonvulsiv medikamenter i vårt laboratorium 24-26. Muligens den mest verdifulle aspektet ved å lage sammenhengende, uforstyrret trådløse innspillinger med trådløs telemetri er evnen til å ta opp unormale spontane hendelser som oppstår med lav forekomst. Disse typer data viser den brede nytten av den trådløse sendesystemet.
554fig1.jpg "/>
Fig. 1: Skjematisk av epoken opptakssystem for trådløs opptakssystem består av to komponenter: 1) en trådløs skull montert sender som forsterker biosignal, og 2) en mottaker plate plassert under standard gnager boliger. Utgangen fra mottakeren basen er et analogt signal som består av det demodulerte biosignal forsterkes til et maksimum på 4 V topp-til-topp. Dette signal kan deretter mates inn i et datainnsamlingssystem for opptak.
Figur 2:. Senderen og mottakeren Denne spesielle trådløs sender (A) veier 4 g og fortrenger <1,4 cm 3 av volum og med en grunnflate på 7 x 12 mm monteres enkelt til skallen av rotter og mus. Senderen kan forsterke to kanaler med biopotentials for inntil 6 måneder etter som batteriet er drained. Større batterier kan brukes i lengre opptakstid. Dyr er plassert i standard gnager bur på toppen av Epoch mottaker (B). Vist til høyre er et tidlig eksempel på to separate opptaks riggene hver er i stand til å spille inn fra 16 dyr samtidig som viser den relativt lite fotavtrykk (2 "x 4", ca. 60 cm x 120 cm) av hver av opptaks riggene.
Figur 3:. Implantere den trådløse senderen i rotter og mus Senderen gir kontinuerlig EEG opptak for opptil 6 måneder i mus så unge som postnatal dag 12 (P12, øverst). Den midterste bildet er av en P7 rotteunge implantert med miniatyr-senderen. Senderen forblir fast festet til skallen som dyret modnes. Dyret nederst er P280 og ble implantert med en humbug-senderen i en alder av P7. Systemet muliggjør simultaaktige og kontinuerlig EEG opptak fra flere dyr i alderen P7 gjennom avvenning, redusere antall kull som trengs for pre-klinisk, langsiktig, EEG overvåking studier.
Figur 4: Dual-kanals opptak hypoksi-iskemi indusert anfall med telemetrisystemet Dual-kanals opptak av unormal EEG med trådløs telemetri i en P7 rotteunge etter carotis ligation (ischemi) under 8% O 2 -håndtering (hypoksi).. (A) og (B), utvidet utsikt over kurvene. Anfall aktivitet er til stede i begge halvkuler (svart, blå) med betydelig EEG undertrykkelse stede i halvkule med iskemisk infarkt (blå).
Figur 5: Opptak status epilepticus hos voksne rotter. Surface EEG opptak (dvs. dural) med miniatyr trådløs telemetri system som svar på diisopropylfluorophosphate (DFP) behandling i en voksen rotte. De skraverte perioder i den øverste spor (A og B) er utvidet utsikt over kurvene i spor under. Data registrert med den trådløse senderen kan deretter bli analysert i frekvensplanet slik at statistiske sammenligninger i en kohort av dyr. (C) Dataene er gjennomsnittlig og 95% konfidensintervall av gamma bandet effekt (20-60 Hz) Følgende DFP-indusert status epilepticus (N = 12) over 12 timer etter inntak av DFP.
Figur 6:. Opptak av beslag og endringer i EEG i en transgen musemodell for vaskulære svamp misdannelser Her registrerer vi fra en transgen mus (A) thpå er under anfall aktivitet. Til å begynne med er normal EEG mønster tilstede (1); umiddelbart før beslaget er det en periode av pre-ictal fordypning (2), som etterfølges av en klynge av fem beslag (3). Etter anfallene, unormale ictal utslipp er til stede i signalet (4). Kontroll dyr har ingen anfall og ingen unormale EEG funksjoner (B).
Discussion
Det kan være svært dyrt å gjøre langsiktige elektrografisk opptak i små dyremodeller av sykdom. Ved å stole på enkle elektriske kretser og understreker lavt strømforbruk, har vi vært i stand til å skape en sender systemet (figur 1 og 2) som reduserer kostnadene for langsiktig overvåking eksperimenter. Den totale kostnaden for en 6 måneders overvåking eksperiment kan være så lavt som $ 470, pluss kostnaden av dyret (~ $ 1,5 dyr per diem, $ 200 sender). Den lille størrelsen på senderen tillater kontinuerlig uavbrutt elektrografisk opptak i små dyr, prekliniske modeller av sykdom hos mennesker, som er svært vanskelig å få tak i med eller bundet radio-frekvensbaserte trådløse registreringssystemer (figur 4). Endelig reduserer skallen monterte typen av senderen operasjonen tid og påkjenning på dyr som ellers kan kompromittere et eksperiment. Her viser vi proof-of-prinsippet eksperimenter fra tre different eksperimentelle modeller av anfall: perinatal hypoksi-iskemi 13, 27, 28 i en rotteunge (figur 4), DFP-indusert status epilepticus (figur 5) og beslag i en genetisk-indusert modell av svamp vaskulære misdannelser (figur 6).
Muligens den mest kritiske aspektet for å skaffe gjenstand frie, langsiktige elektrografisk opptak er å verifisere uhemmet elektrode tilgang til kortikal regionen av interesse (figur 4-6). Dette omfatter den felles referanse / jordingselektrode. Spesielt kritisk er å feste senderen til skallen for epidural EEG applikasjoner. Under denne prosessen er det mulig å belegge utilsiktet spissen av elektrodene med cyanoakrylat gitt svært kort lengde av elektrodene. Coating elektrodene i cyanoacrylate kan dempe EEG-signaler eller helt isolere dem i worst-case scenario. Tilsvarende, mangel på god elektrisk forbindelse between den felles referanse / bakken og dyrets hjerne vil hindre riktig drift av differensialforsterkeren i senderen, noe som resulterer i en elektrisk "støy" utgangssignal. Ofte etter operasjonen, signaler av god kvalitet kan bli svekket i opp til 48 timer på grunn av ødem som omgir graden hull i skallen. Som ødem avtar, signaler generelt bedre. Dette kan unngås ved å plassere elektrodene på overflaten av hodet uten å gjøre Burr hull. Konsekvensene av denne fremgangsmåte er økt potensial til å belegge elektrodene med cyanoakrylat, redusert høyfrekvente aktivitet på grunn av mikro elektriske egenskapene til skallebenet, og potensialet for elektrisk å isolere den felles referanse / første gjengivelses støy i signalene. Praktisere korrekt plassering av elektrodene kan gjøres med et tynt stykke av tre eller finer som etterligner tykkelsen av mus eller rotte skalle. Resultatene som presenteres i dette manuskriptet illustrerer quaheten av opptak som kan oppnås ved hjelp av trådløs telemetri teknologi.
Kirurgisk implantering ved hjelp av metoden beskrevet heri kan ta så lite som 10 minutter, avhengig av kompleksiteten av operasjonen. For kirurgisk tilgang til dype strukturer i hjernen, slik som CA1 regionen av hippocampus, er det best å feste senderen til en mikromanipulator montert på en stereotaksisk ramme. Mikromanipluatoren vil gi kirurgen med nøyaktigheten til implantatet senderen ifølge publiserte stereotaksiske Koordinatene i atlas av mus 29 og rotte 30 hjerner. Dette kan gjøres ganske enkelt ved å overvinne en del av kanyle slangen til senderen med cyanoakrylat, og deretter montering av kanylen i den mikromanipulator. Mikromanipulator kontroll av x, y, og z-koordinatene vil gi ytterligere stabilitet ved montering av transmitteren til skallen før suturing huden lukket. Tilsetningen av benskruer rundt perimeter av transmitteren kan hjelpe til å forankre senderen til skallen, selv om de ikke er nødvendig. Benskruer kan være effektive, men i visse dyremodeller av kramper og epilepsi, for eksempel litium-pilokarpin-behandlede voksen rotte. Disse dyrene har en tendens til å ha spontane epileptiske anfall med intens motorisk aktivitet som kan skade senderen under anfallet. Ytterligere kompleksitet kan tilsettes til disse eksperimentene. For eksempel, er senderen kompatibel med mange forskjellige modeller av traumatisk hjerneskade, for eksempel kontrollert cortical innvirkning 31. Holdbarheten av senderanordningen ble testet ved implantering av dyr med sendere ved P7, og deretter boliger dem i dyrefasilitet. Etter 12 måneder, de fleste av implantater forble intakt på skallen. Når dyr ble avlivet, hodeskaller syntes å være normal og senderen ble innebygd i skallebenet, som krever betydelig kraft for å pakke den ut. Vær forsiktig når du dype strukturer i hjernener studert; som vokser i hjernen, og elektrodene forblir stasjonære, vil den endelige stilling av elektrodene kan forventes å endre seg. For de teknikker som er beskrevet her, ble elektrodene vanligvis posisjonert over dura, som tillot både i hjernen og hodeskallen til å vokse og for elektrodene å forbli i sine opprinnelige posisjoner. Den begrensende faktoren i hvor lenge senderen kan brukes er batteristørrelsen (dvs. før batteriet går tomt).
Et selvstendig monolittisk konstruksjon (dvs. transmitteren er innleiret i harde epoksy) av senderens huset gir seg til bruk med umodne pups plassert med demningen og deres kullsøsken. Ofte co-boliger implantert dyr med kablede stagene resultater i ødeleggelsen av den implanterte maskinvare eller kannibalisering av valpene ved demningen. Den glatte vegger formen på senderen gjør det mulig for implantasjon med nesten ingen maskinvarefeil eller tap av unger på grunn av kannibalisering.
Disclosures
Drs. Lehmkuhle og Dudek har en økonomisk interesse i epitel, Inc., designere av Epoch trådløse biopotential opptakssystem.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert gjennom National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag R43 / R44 NS064661.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Powder Free Sterile Latex Surgical Glove |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
| Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
| Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
| Fine burr | FST | 19007-07 | |
| Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
| Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
| Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
| Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
| Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
| Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
| Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
| Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
| Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
| Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
| Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
| PC-compatible computer |
References
- Boylan, G. B., Stevenson, N. J., Vanhatalo, S. Monitoring neonatal seizures. Semin. Fetal Neonatal Med. 18 (4), 208-208 (2013).
- Panzica, F., Varotto, G., Rotondi, F., Spreafico, R., Franceschetti, S. Identification of the Epileptogenic Zone from Stereo-EEG Signals: A Connectivity-Graph Theory Approach. Front Neurol. 6 (4), 175 (2013).
- Arciniegas, D. B. Clinical electrophysiologic assessments and mild traumatic brain injury: state-of-the-science and implications for clinical practice. Int J Psychophysiol. 82 (1), 41-52 (2011).
- Mizrahi, E. M., Kellaway, P. Cerebral concussion in children: assessment of injury by electroencephalography. Pediatrics. 73 (4), 419-425 (1984).
- Pisarenco, I., Caporro, M., Prosperetti, C., Manconi, M. High-density electroencephalography as an innovative tool to explore sleep physiology and sleep related disorders. Int J Psychophysiol. S0167-8760 (14), 3-8 (2014).
- Konadhode, R. R., et al. Stimulation of MCH neurons increases sleep. J. Neurosci. 33 (25), 10257-10263 (2013).
- Bertram, E. H., Williamson, J. M., Cornett, J. F., Spradlin, S., Chen, Z. F. Design and construction of a long-term continuous video-EEG monitoring unit for simultaneous recording of multiple small animals. Brain Res. Protoc. 1-2 (1), 85-97 (1997).
- Stables, J. P., et al. Therapy discovery for pharmacoresistant epilepsy and for disease-modifying therapeutics: Summary of the NIH/NINDS/AES Models II Workshop. Epilepsia. 44 (12), 1472-1478 (2003).
- White, A. M., et al. Efficient unsupervised algorithms for the detection of seizures in continuous EEG recordings from rats after brain injury. J. Neurosci. Methods. 152 (1-2), 255-266 (2006).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The ontogeny of seizures in a rat model of limbic epilepsy: evidence for a kindling process in the development of chronic spontaneous seizures. Brain Res. 625 (2), 295-300 (1993).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The evolution of a rat model of chronic spontaneous limbic seizures. Brain Res. 661 (1-2), 157-162 (1994).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. J. Neurosci. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous electroencephalographic monitoring with radio-telemetry in a rat model of perinatal hypoxia-ischemia reveals progressive post-stroke epilepsy. J. Neurosci. 30 (1), 404-415 (2010).
- Galanopoulou, A. S. Basic mechanisms of catastrophic epilepsy -- overview from animal models. Brain Dev. 35 (8), 748-756 (2013).
- Lerche, H., et al. Ion channels in genetic and acquired forms of epilepsy. J Physiol. 591 (Pt 4), 753-764 (2013).
- Rossignol, E., et al. WONOEP appraisal: new genetic approaches to study epilepsy). Epilepsia. 55 (8), 1170-1186 (2014).
- Westmark, C. J., et al. Reversal of fragile X phenotypes by manipulation of AβPP/Aβ levels in Fmr1KO mice. PLoS One. 6 (10), e26549 (2011).
- Sukhotinsky, I., et al. Optogenetic delay of status epilepticus onset in an in vivo rodent epilepsy model. PLoS One. 8 (4), e62013 (2013).
- Krook-Magnuson, E., Armstrong, C., Oijala, M., Soltesz, I. On-demand optogenetic control of spontaneous seizures in temporal lobe epilepsy. Nat Commun. 4, 1376 (2013).
- Paz, J. T., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nat Neurosci. 16 (1), 64-70 (2013).
- Monod, N., Pajot, N., Guidasci, S. The neonatal EEG: statistical studies and prognostic value in full-term and pre-term babies. Electroecephalogr Clin Neurophysiol. 32 (5), 529-544 (1972).
- Deshpande, L. S., Carter, D. S., Blair, R. E., DeLorenzo, R. J. Development of a Prolonged Calcium Plateau in Hippocampal Neurons in Rats surviving Status Epilepticus Induced by the Organophosphate Diisopropylfluorophosphate. Toxicol Sci. 116 (2), 623-631 (2010).
- Todorovic, M. S., Cowan, M. L., Balint, C. A., Sun, C., Kapur, J. Characterization of status epilepticus induced by two organophosphates in rats. Epilpsy Res. 101 (3), 268-276 (2012).
- Lehmkuhle, M. J., et al. A simple quantitative method for analyzing electrographic status epilepticus in rats. J. Neurophysiol. 101 (3), 1660-1670 (2009).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J. Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Pouliot, W., et al. A comparative electrographic analysis of the effect of sec-butyl-propylacetamide on pharmacoresistant status epilepticus. Neuroscience. 12 (231), 145-156 (2012).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Vannucci, R. C., Vaccucci, S. J. A model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Ann N Y Acad Sci. 835, 234-249 (1997).
- Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2013).
- Bolkvadze, T., Pitkanen, A. Development of post-traumatic epilepsy after controlled cortical impact and lateral fluid-percussion-induced brain injury in the mouse. J. Neurotrauma. 29 (5), 789-812 (2012).
