Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Forward Genetik skærme med makrofager til at identificere Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52556
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College
* These authors contributed equally

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) er en obligat intracellulær, protozoal patogen. Det er det agens af toxoplasmose, en sundhedsfare i immunsvækkede personer. Det er også den model for andre Apicomplexan patogener, der inficerer mennesker, herunder Cryptosporidium og Cyclospora. Toxoplasmose er mest almindeligt erhvervet gennem indtagelse af mad eller vand forurenet med bradyzoite eller oocyst etape af parasitten. Ved indtagelse, disse stadier konvertere til tachyzoite fase af parasitten, der replikerer i værtsceller og formidler systemisk. T-celler, IFN-γ og, i mindre omfang, nitrogenoxid 1-4, er vigtige til kontrol af infektion, men er ikke i stand til at eliminere sygdommen, som en andel af tachyzoitter konverteres til bradyzoite fase der er beskyttet inden vævscyster hvilket resulterer i en lang levetid kronisk infektion. I virkeligheden er der ingen terapeutiske effektive mod kronisk cyste sTage af sygdommen. Svær toxoplasmose er oftest på grund af reaktivering af vedvarende infektion med bradyzoite etape af parasitten konvertere tilbage til den hurtigt replikerende tachyzoite fase karakteristisk for primær og akut infektion.

Tidlig overlevelse i lyset af den medfødte immunreaktion er vigtigt at give parasitten til opnå tilstrækkelige parasit numre, samt at nå distale steder, for at muliggøre etablering af kronisk infektion. T. gondii har udviklet strategier til at modvirke værtsforsvarsmekanismer, der sandsynligvis bidrager til dets evne til at replikere og sprede tidligt i infektionen. Først T. gondii danner en unik PV under parasit invasion, der stort set er adskilt fra endocytiske og eksocytiske processer i værtscellen sammenlignet med andre intracellulære patogener 5-9. Også, ligesom alle succesfulde intracellulære patogener T. gondii ændrer sin værtscelle for at skabe et tolerant miljø feller vækst. Dette omfatter omprogrammering værtscelle genekspression ved ændring værtscelle transkriptionsfaktorer herunder vigtige for regulering celleaktivering 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20 GRA16 21 og GRA24 22 har alle vist sig at være vigtige i reguleringen af transkriptionel respons og cellesignalerende kaskader af værtsceller inficeret med T. gondii. Nylige undersøgelser der anvender genetiske krydsninger mellem parasit stammer med forskellige fænotyper har været meget produktiv i at identificere parasit gener, der ligger til grund for parasit genotype-afhængige egenskaber, herunder unddragelse af immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs) 16,19,23-26. Hos mus immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs) er afgørende for bekæmpelse af type II og III genotyper af parasitten, mens den meget virulente Type I genotyper har udviklet mekanismer til at unddrage sig de murine IRGs. Det er imidlertid også klart, at parasitten har udviklet mekanismer til at unddrage sig antimikrobielle mediertorer ud over de IRGs og at nogle af disse mekanismer kan bevares på tværs af parasit genotyper 27,28. Desuden er meget lidt kendt om de kritiske formidlere af celle autonom immunitet mod T. gondii under human toxoplasmose. Parasite gener vigtige for resistens over for mediatorer af celle autonom immunitet kan også være vigtigt for overlevelse under tachyzoite at bradyzoite konvertering, som også kan udløses af værtens immunrespons. For eksempel kan nitrogenoxid på høje niveauer undertrykke parasit replikation i inficerede makrofager, men det kan også stimulere tachyzoite at bradyzoite omdannelse resulterer i cyste produktion 30-32.

ToxoDB er en funktionel genomisk database for T. gondii, der fungerer som en kritisk ressource for området i form af at give sekvens information for parasitten genom og adgang til offentliggjorte og ikke-offentliggjorte genomisk skala data, herunder community anmærkninger, gen exp undgå recidiv og proteomics data 33. Ligesom mange protozoiske patogener, at størstedelen af ​​genomet består af hypotetiske gener med ingen oplysninger baseret på gen-homologi at give indsigt i deres potentielle funktioner. Således forward genetik er et kraftfuldt værktøj til at identificere nye parasit gener er vigtige for immunforsvaret svig, cyste konvertering og andre funktioner kritiske for parasit patogenese samt ved omregning mellem forskellige udviklingsstadier. En yderligere styrke fremadgående genetik er, at det kan anvendes som et relativt ikke-forspændt tilgang at forespørge parasitten som de gener, der er vigtige for specifikke opgaver i patogenese, herunder immune unddragelse og cystedannelse. De seneste forbedringer i næste generation sekventering for mutational profilering har gjort det til en foretrukne metode til at identificere de ansvarlige parasit gener fra forward genetik studier ved hjælp af både kemiske og insertionsmutagenese 34-37.

ntent "> Det er vigtigt at identificere sårbarheder i T. gondii, der kan udnyttes til at øge effektiviteten af celle autonome immunmekanismer mod parasitten især dem, der kan også være aktiv over for resistente cyste scenen. Mod dette mål, en in vitro murine makrofag infektion og aktivering model blev udviklet til at identificere mutationer i parasitten, som specifikt forringe T. gondii fitness efter aktivering af inficerede makrofager, men ikke i naive makrofager. Denne makrofag skærm blev anvendt til at forespørge et bibliotek af T. gondii insertionelle mutanter for endeligt identificere T. gondii gener er vigtige for resistens over for nitrogenoxid 27,28. Isoleringen af et panel af T. gondii-mutanter med nedsat resistens over for aktivering af inficerede makrofager, især en markant følsomhed over for nitrogenoxid, viste anvendeligheden af skærmen for at identificere parasit gener vigtige for resistenstil mediatorer af celle autonom immunitet andre end resistensmekanismer beskrevet for de murine IRGs 28. Insertionsmutagenese har fordele i forhold til kemisk mutagenese til at generere et begrænset antal tilfældige mutationer i hver parasit klon og i teorien, lettere identifikation af stedet for mutation. Men identificere genomiske stedet i plasmid insertion i T. gondii insertionelle mutanter i praksis har været overraskende vanskelig i mange tilfælde 37. Insertion af et plasmid i et gen er også sandsynligt, at forstyrre funktionen af ​​et gen i modsætning til kemisk mutagenese, der typisk resulterer i enkelte nucleotidændringer. Imidlertid kemisk mutagenese med enten N-ethyl-N-nitrosourinstof (ENU) eller ethylmethansulfonat (EMS), kan tilbyde en øget evne til at analysere en større del af parasitten genomet sammenlignet med insertionsmutagenese, da det skaber flere enkelt nucleotid polymorfismer ( anslås til 10 -100) pr mutant 3438. Desuden har de seneste fremskridt inden hele genomet profilering gjort det muligt at bruge næste generation sekventering for at identificere den mest sandsynlige kandidat gener, der er ansvarlige for den identificerede fænotype af en muteret parasit 34,38. Uanset mutagenese fremgangsmåde, i sidste ende kræver bekræftelse af den rolle parasitten genet i resistens over for makrofagaktivering gendeletion og komplementering at opfylde molekylær Kochs postulater.

Evnen til at dissekere funktionen af et gen ved genetisk manipulation af både parasitten og makrofagen er vigtigt, da mange af generne identificeret via forward genetik i T. gondii, såvel som andre patogener, der stadig karakteriseres som hypotetiske gener med lidt at ingen sekvenshomologi med andre proteiner med kendte funktioner. Den aktuelle papir skitserer en generel fremgangsmåde, der kan anvendes til at identificere, om det afbrudte gen i en mutant er vigtigt for resistens over for et kendt ellerukendt mediator af celleautonom immunitet. Den indledende analyse af værten antimikrobielle faktorer udføres ved at vurdere overlevelsen af ​​vildtype og mutant parasitter i makrofager fra vildtypemus versus dem med specifikt gen deletioner i inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS), GP-91 phOx (NADPH oxidase), og specifikke immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs). Dette vil afgøre, om de identificerede parasit gener er vigtige for resistens over for nitrogenoxid, reaktive oxygen mellemprodukter eller immunitetsrelaterede GTPaser 28 henholdsvis, eller hvis en ukendt immun mekanisme er involveret. Aktivering af inficerede makrofager med både IFN-γ og LPS, der er beskrevet i den nuværende protokol, resulterer primært i isoleringen af parasitten gener vigtige for resistens over for nitrogenoxid 28. Anvendelsen af ​​farmakologiske midler, der inducerer nitrogenoxid i fravær af makrofagaktivering (nitrogenoxiddonorer) bekræftede, at de fleste af de identificerede gener var vigtige for rekomststödets til nitrogenoxid snarere end nitrogenoxid i forening med yderligere mediatorer forbundet med makrofagaktivering 28.

Trin et og to beskrive en fremad skærm designet til at isolere parasit mutanter med en fitness defekt efter aktivering af inficerede knoglemarv-afledte makrofager in vitro genetik. Trin man beskriver en dosistitrering analyse empirisk bestemme en dosis af IFN-γ og LPS til brug for makrofagaktivering, der reducerer parasit replikation, men ikke helt inhibere replikation af vildtype T. gondii parentale stamme, der anvendes til oprettelse af et bibliotek af parasitten mutanter. Trin to beskriver fremad genetiske skærm af den mutante kloner i makrofager i 96-brønds plader. Trin tre skitserer en tilgang for at bekræfte fænotype hver mutant identificeret i skærmen af ​​de 96 brønde og at vurdere, om defekt i hver mutant påvirker parasit overlevelse, replikering,eller cyste produktion til makrofagaktivering. Trin fire beskriver anvendelsen af ​​knoglemarv-afledte makrofager fra mus med deletioner i specifikke antimikrobielle veje til at identificere de immunmediatorer som parasitten mutanten specifikt modtagelige. Trin fem skitserer en tilgang for at afgøre, om en parasit mutant også kompromitteres til in vivo patogenese som vurderet af cyste produktion i hjernen hos inficerede mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle protokoller, der indebærer anvendelse af dyr blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og regler, der er fastsat ved New York Medical College Animal Care og brug Udvalg.
BEMÆRK: detaljerede protokoller for kemisk mutagenese 38, isolering af parasitter ved begrænsende fortynding 38, isolering af murine knoglemarv afledte makrofager 39, væksten af T. gondii i human forhud fibroblast (HFF) celler og cyste produktion i makrofager og grundlæggende immunfluorescensanalyse (IFA) 32 refereres. Gennemfør alle cellekultur ved 37 ° C i 5% CO 2 i D10 medier (Dulbeccos Modified High Glucose Eagle Medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin) . Hold alle reagenser sterile hele celle isoleringer og cellekultur.

1. Dosistitrering af IFN-γ og LPS til at bestemme Concentrner til at bruge til at aktivere Inficerede Makrofager for Forward Genetics Screen

  1. Kultur murine knoglemarvafledte makrofager O / N i otte kammer objektglas i en koncentration på 3 × 10 5 celler / ml i 250 pi D10 medier pr kammer. Brug makrofager 1-2 uger efter isolering fra knoglemarv.
    BEMÆRK: Chamber dias er købt der har en vækst øger RS ​​vask.
  2. Brug et hæmocytometer at tælle vildtype parasitter høstet fra human forhud fibroblast (HFF) celler dyrket i en T25 vævskulturkolbe. Resuspender parasitter i en koncentration på 5 x 10 5 vildtype parasitter per ml i D10 medier. Denne koncentration vil resultere i en infektionsmultiplicitet på ca. 1: 1 som makrofager vil være spredt O / N. Brug polystyren eller PET rør til alle manipulationer med parasitter som parasitten sticks til polypropylen.
  3. Fjern D10 medier i kammeret dias og erstatte med 250 pi afsuspension af vildtype parasitter. Tilføje forsigtigt parasitten suspension til hvert kammer af slæden ved at lade den flyde ned den indvendige side af hvert kammer. Lad ikke makrofager til at tørre ud på noget tidspunkt under protokollen.
  4. Cover chamber slides inficeret med parasitter med kammeret slide cover og sted i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 i 4 timer for at give tid til parasitten at invadere og etablere en PV.
  5. Gør fortyndinger af LPS og IFN-γ i 1 ml D10 medier i sterile rør til den dosis titreringer. For dosis titreringer holde enten LPS eller IFN koncentration konstant og variere den anden stimulus 40.
    1. For eksempel holder LPS konstant på 10 ng LPS pr ml og varierer koncentrationen af ​​IFN-γ (0, 1 enhed / ml, 10 enheder / ml, 100 enheder / ml, 1.000 enheder / ml). Hold IFN γ konstant på 100 enheder / ml og varierer koncentrationen af ​​LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Kort soniker LPS lager i 2 min udenopvarmning i et bad sonikator (ikke med en spids sonikator) før fortynding.
      BEMÆRK: Sonikering anbefales at forstyrre micelle aggregater dannet af LPS, der ikke binder korrekt til værtsceller.
  6. 4 timer efter initiering af co-kultur mellem parasitter og vedhængende makrofager i kammeret slide, kasseres D10 medier i hvert kammer og erstatte det med 300 pi passende fortyndinger af IFN γ og LPS i D10 medier. Medtag en kontrol med kun D10 medier til at evaluere parasit replikation i fraværet af makrofagaktivering.
  7. Re-cover kammer dias med kammeret slide cover og sted i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 i 24. til 30. ekstra time.
    BEMÆRK: Inkubationstiden afhænger fordoblingstiden for vildtype parasit stamme, der kan ligge i området 6-12 timer afhængigt af parasitten stamme. Et tidspunkt, der vælges inden parasit lysis af naive makrofager, men længe nok til at muliggøre mindst 3-4 doubling gange.
  8. Lav en 2,5% formaldehydopløsning i Dulbeccos phosphatbufret saltvand (PBS). Kassér medierne i kammeret slide og erstatte med 300 pi af 2,5% formaldehyd-opløsning. Fix i 20 minutter ved stuetemperatur.
  9. Skyl slide (s) to gange med 300 pi PBS pr kammer. For hver skylning, kasseres PBS i dias og tilføje nye PBS forsigtigt ned indersiden af ​​hvert dias kammer at undgå forstyrrelser af makrofager klæbet til dias. Tilføj 300 pi PBS pr kammer og sted dækning på kammer slide for at forhindre dias udtørring inden farvning.
    BEMÆRK: Slides kan placeres ved 4 ° C i op til 3 dage på dette tidspunkt før farvning.
  10. Farvning protokol for T. gondii påvisning ved immunfluorescensmikroskopi (IFA).
    1. Lav en 0,2% Triton X-100 i PBS (permeabilisering buffer). Placer opløsning i et rør i et 37 ° C vandbad og kort vortex at sikre Triton X-100 går i opløsning. KassérPBS i kammeret dias og erstatte med 300 pi af permeabilization buffer. Efterlad ved stuetemperatur i 30 min.
    2. Lav en opløsning af 10% gedeserum i PBS (blokerende opløsning). Kassér permeabilization buffer i slæden og erstatte med 300 pi blokerende opløsning pr kammer. Efterlad ved stuetemperatur i 30 min.
      BEMÆRK: føtalt kalveserum kan substitueres med gedeserum i alle farvningsprotokoller.
    3. For et trin IFA farvningsprotokol, at en 1: 1000 fortynding af en fluorescens-konjugeret antistof til T. gondii i blokerende opløsning. Fjern blokering løsning fra dias og tilføje 150 ul antistof opløsning pr kammer. Sæt dækslet glider på kammer slide for at forhindre cellerne i at tørre ud. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: antistofkoncentration skal bestemmes empirisk, afhængigt af kilden. Antistof købes direkte konjugeret til et fluorochrom eller konjugeret til et fluorokrom af brugeren.
      1. For en to-trins IFA farvningprotokol med en ukonjugeret antistof til T. gondii og en fluorescens-konjugeret sekundært antistof, bejdse lysbilleder med 150 pi ukonjugeret primært antistof mod T. gondii i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur. Skyl 3 gange med 300 pi PBS plus 1% gedeserum (vaskebuffer).
      2. Tilføj 150 pi fluorescens-konjugeret sekundært antistof specifikt for de arter oprindelsesbetegnelser for det primære antistof. Sæt dækslet glider på kammer slide for at forhindre cellerne i at tørre ud. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
    4. Skyl objektglassene 3x med PBS plus 1% gedeserum (vaskebuffer). For hver skylning fjernes opløsningen i kammerobjektglas ved dumpning sit indhold og erstat med 300 pi vaskebuffer.
    5. Skyl objektglassene 2x med 300 pi PBS.
    6. Fjern kammeret fra kammeret slide ifølge producentens anvisninger.
    7. Mount glider med montering medier indeholdende DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindol, dilactate) og en 22 mm x 50 mm dækglas.
  11. Undersøg dias ved hjælp af fasekontrast og fluorescens mikroskopi. Bestem det gennemsnitlige antal parasitter pr vakuole ved at undersøge mindst 100 solceller pr kammer godt. Den valgte dosis af IFN γ og LPS til skærmen skal være tilstrækkelig til at undertrykke, men ikke forhindre replikation af vildtype parasitter (se figur 1).

2. Isolering af Parasite mutanter med en Fitness Defect efter aktivering af inficerede makrofager

BEMÆRK: Et bibliotek af tilfældige T. gondii mutanter er nødvendig for skærmbilledet frem genetik. Tilfældig mutagenese af T. gondii kan udføres ved kemisk (ENU / EMS) eller insertionsmutagenese 27,28,38. Efter mutagenese, klon parasitter ved begrænsende fortynding og vokse individuelle kloner i 96-brønds plader indeholdende adhærente HFF celler i et volumen på 200 pi D10 medier 32,38.Det er afgørende, at 96-brønds plader til screening af parasitter i makrofager ved mikroskopi have optiske bunde at muliggøre mikroskopisk screening. Fasekontrast og fluorescensmikroskopi til screening farvede plader med 96 brønde kræver et inverteret fluorescensmikroskop med fasekontrast 4, 10, 20 eller 40X objektiv udstyret til lang arbejdstid afstande. En 4X mål er nyttige til at se hele godt, men bedre opløsning af parasitter opnås med 20X mål.

  1. Transfer 50 pi tachyzoite mutanter dyrket i sammenflydende HFF celler i 96-brønds vævskulturplader i to replikere 96-brønds plader indeholdende murine knoglemarv-afledte makrofager (1-2 uger efter isolering) i 100 pi D10 medier.
    BEMÆRK: Udfør første skærmbillede i 96-brønds plader af parasitten baseret på mængden af ​​parasit kultur at undgå at skulle tælle antallet af parasitter overført pr hver brønd. Således er mikroskopi analyse 2.6 kvalitativt baseret på whethER parasitter har generelt replikeret eller ikke replikeres. Trin 3 beskriver fremgangsmåde for at bekræfte fænotype af mutanterne i kammerobjektglas hjælp lige antal vildtype eller mutant parasitter til at inficere makrofager.
    1. Direkte tilføje parasitter til D10 medier allerede i hver brønd. Inficere to brønde med vildtype tachyzoitter som en positiv kontrol for parasit replikation.
  2. Placer de inficerede celler i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) i 4 timer for at tillade parasitter tid at invadere cellerne og skabe deres PV.
  3. Fjern medier fra én plade ved dumpning indholdet af pladen. Brug en enkelt flip af håndleddet at dumpe medierne i pladen i et discard bassin indeholder et vaskemiddel cidal for parasitterne.
    1. Tilsæt 100 pi "makrofagaktivering medier" ved hjælp af en steril bassin for medierne og en multikanalpipette. Brug den optimale koncentration af LPS og IFN-γ bestemt fra trin 1 til Macrophage aktivering medier. Ligeledes fjerne medier fra to eksemplarer kontrol plade og erstatte med 100 pi D10 medier.
  4. Placer de inficerede celler i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) i yderligere 24-30 timer.
  5. Farvning protokol for plader med 96 brønde til IFA.
    1. Kassér medierne i pladen og erstatte med 100 ul 2,5% formaldehyd i PBS. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Brug en steril bassin til formaldehyd og en multikanalpipette.
    2. Kassér formaldehydopløsning i pladen, og der tilsættes 100 pi PBS at skylle formaldehyd fra pladen.
    3. Kassér opløsningen i pladen, og der tilsættes 100 pi permeabilisering (PBS med 0,2% Triton X-100) til hver brønd. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
    4. Kassér opløsningen i pladen, og der tilsættes 100 pi blokeringsopløsning (PBS med 10% gede serum) til hver brønd. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
    5. Kassér opløsningen i psent. Der tilsættes 50 gl / brønd af en fluorescens-konjugeret anti-T. gondii antistof fortyndet 1: 1.000 i PBS plus 1% gedeserum. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med pladen låg på og en rocker.
      1. Alternativt bruge en ukonjugeret primært antistof mod T. gondii efterfulgt af farvning med en fluorescens-konjugeret sekundært antistof som beskrevet i 1.10.3.1.
    6. Kassér antistofopløsning i pladen og erstat med 100 ul / brønd PBS plus 1% gedeserum. Udfør denne skylning 3x efterfulgt af 2 ekstra skylninger med PBS alene. Efterlad 200 pi PBS i hver brønd, og dækslet på pladen med 96 brønde for at forhindre brøndene fra tørring.
      BEMÆRK: plade med dækslet på kan være indpakket i parafilm og ved mikroskopi placeret ved 4 ° C i op til 3 dage før analyse.
  6. Undersøg cellerne under et inverteret fluorescensmikroskop ved anvendelse af en 20-40X mål. Vælg mutanter, som replikerer i na &# 239; ve makrofag plade, men overvejende undlader at replikere over en parasit / vakuole i "aktiverede makrofager", eller at synes amorf eller nedbrudt i "aktiverede makrofager".
    BEMÆRK: Antallet af vildtype parasitter pr vacuole vil afhænge af dosis af IFN-γ og LPS anvendes, men er ideelt omkring 4 parasitter pr vacuole; et tal, der afspejler vækstsuppression, men ikke fuldstændig inhibering af replikation ved aktivering stimulus.

3. Vurdere Mutants at afgøre, om manglen er på niveau med Parasite Overlevelse eller replikering efter aktivering af inficerede makrofager

  1. Transfer udvalgt parasit mutanter fra plader med 96 brønde (indholdet af hele brønd) til T25s indeholdende HFF celler og tillade replikation.
  2. Kultur knoglemarv afledte makrofager O / N i 8 kammer objektglas i en koncentration på 3 × 10 5 celler / ml i 250 pi D10 medier. Forbered et dias til sammenligne parasite replikation i naive makrofager og en ekstra dias til at sammenligne parasit replikation efter aktivering af inficerede makrofager.
  3. Harvest tachyzoite parasitter og tæller i et hæmocytometer. Tilsæt 5 × 10 4 T. gondii parasitter til et kammer brønd indeholdende makrofager i D10 medier og kultur i 4 timer. Inklusive et godt med vildtype parentale parasitter som en kontrol. Podes en identisk gentagelse objektglas med samme parasit klon, der ikke vil modtage aktivering medier for at overvåge replikation af parasitter i naive makrofager.
  4. Kassér D10 medier fra 1 af replikat kammer dias og erstatte med 250 pi "aktivering media". Kassér D10 medier fra den anden replikere kammer slide og erstatte med 250 pi D10 medier. Inkuber både "aktiveret" og "naiv" makrofag slide med kammeret slide dækslet på ved 37 ° C og 5% CO2 i en Additional 24-30 timer.
  5. Fix, permeabilisere, og blokere dias til IFA farvning og analyse af parasitter som beskrevet i trin 1. Udfør IFA farvning med kamrene intakte.
    1. Co-plet-celler med et antistof mod lysosomal membranassocieret 1 (LAMP1) eller lysoTracker og antistof til T. gondii at vurdere, hvorvidt aktivering af inficerede makrofager udløser fusion af de mutante PV'er med lysosomer (figur 4).
    2. Brug antistoffer til specifikke compartimenten / organeller i parasitten / PV for farvning med IFA til at identificere ændringer i parasitten mutant, der er indlysende tidligt efter makrofagaktivering 28.
      BEMÆRK: Disse ændringer kan give indblik i den mekanisme, der ligger til grund for mangelfuld overlevelse / replikation af mutant efter makrofagaktivering.
  6. Undersøg objektglas med en 100X oliefase objektiv og fluorescensmikroskopi.
    1. Vurdere parasit replikation ved at bestemmeantal parasitter pr PV i 100 tilfældige vakuoler. Udfør mindst 2 tællinger af 100 vakuoler hver til statistisk analyse.
    2. Vurdere generelle parasit morfologi ved hjælp af både fluorescens analyse samt fasekontrastmikroskopi. Vis parasitter under fase 100x mål. Sunde parasitter har parasitter tæt indesluttet i en tætsiddende parasitophore vakuole. Parasitter, der har amorfe rummelige vakuoler med fase tætte fælge eller amorf parasitter tyder parasit død snarere end blot en defekt i replikation (figur 1 og 3).

4. vurdere, om følsomhed over Mutant Parasitter til Aktivering af inficerede makrofager er forbundet med kendte anti-mikrobielle mæglere

  1. Isoler knoglemarv-afledte makrofager fra vildtype C57 / BL6-mus, iNOS - / -, gp91-phOx - ​​/ - eller Irgm1 / Irgm3 - / - mus 32.
  2. Kultur respektive knoglemarv afledt macrophages O / N i 8 kammer objektglas i en koncentration på 3 × 10 5 celler / ml i 250 pi D10 medier.
  3. Fortsæt med parasit udfordring, IFA farvning og analyse som beskrevet i trin 3.
  4. Undersøg, om evne til mutant parasitter til at overleve og formere efter aktivering af inficerede makrofager er genoprettet i fravær af reaktive oxygen eller nitrogen arter eller specifik immunitet relaterede GTPaser 28.
  5. Brug farmakologiske midler, såsom nitrogenoxid-donorer, at vurdere, om bestemte antimikrobielle mediatorer er tilstrækkelige i sig selv til at forringe mutant parasitter i HFF celler eller naive makrofager eller hvis de kun handle sammen med andre mediatorer af makrofager aktivering 28.

5. Vurdere, om defekten i Mutant Parasite kompromiser kronisk infektion

  1. Isoler tachyzoitter fra vildtype, mutant eller målrettede gen slettet parasitter dyrket i T25s containing HFF celler. Parasitter skal være frisk lyseres fra HFF kulturer.
  2. Tæl parasitter ved hjælp af et hæmocytometer. Resuspender parasitter i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) i en koncentration per ml passende for en subletal dosis af parasitten leveret i 200 pi ved intraperitoneal (IP) injektion.
  3. Brug en 1 ml tuberkulin sprøjte og 25 G nål til at injicere parasitter med 200 pi volumen intraperitonealt (IP). Dosis afhænger af vildtypestammen af ​​parasitten og musen genotype.
    BEMÆRK: Type I genotyper parasitten er dødelige for mus under den akutte fase af infektion, uanset parasit dosis og er ikke egnede til studier af kronisk infektion i fravær af kemoterapi for T. gondii at undertrykke parasit replikation.
  4. Tredive dage efter parasit udfordring, ofrer mus ved inhalation af CO 2 fra en tryktank i en uncrowded kammer (en standard størrelse mus bur må ikke indeholde mere end 5 mis) efterfulgt af cervikal dislokation.
  5. Isoler hjernen fra mus ved hjælp af etablerede procedurer 41-43.
    1. Læg musen på sin forside. Spray hovedet med 70% ethanol til at sterilisere området.
    2. Brug skarp saks til at skære gennem hjernestammen. Brug dissekere saks til at gøre en overfladisk snit sideværts omkring højre og derefter venstre side af kraniet startende fra bunden af ​​hjernestammen. Brug pincet til forsigtigt skrælle kraniet for at blotlægge hjernen.
    3. Løft forsigtigt hjernen og sted saks mellem hjernen og bunden af ​​kraniet til at skære lugtenerven at befri hjernen. Løft hjernen med steril pincet eller en spatel og sted i en bakteriologisk Petri plade indeholdende 10 ml sterilt PBS.
  6. Skær hjernen i halve med en steril skalpel gennem centrum mellem højre og venstre hjernehalvdel.
  7. Tilsæt halvdelen af ​​hjernen til en lille morter indeholdende 1 ml PBS. Brug morter og støder tilgøre en bøde vævssuspension af hjernen, der kan passere gennem en bred boring 20-200 pi pipettespids.
    BEMÆRK: Den anden halvdel af hjernen, bør fastsættes i 2,5% formaldehyd i 1 time, hvis vævssnit er brug for histopatologi.
  8. Placer 100 pi af hjernen lysat i et 1,7 ml mikrocentrifugerør. Der tilsættes 1 ml 2,5% formaldehyd i PBS i rør indeholdende hjernen lysat at fastsætte hjernen suspension farvning. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
  9. Centrifugeres lysatet ved 8000 xg i 5 min i en mikrocentrifuge og omhyggeligt kasseres supernatanten.
  10. Der tilsættes 1 ml permeabilisering / blokerende buffer til lysatet (10% gedeserum, 0,2% Triton X-100 i PBS). Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
  11. Centrifuger lysatet ved 8000 xg i 5 minutter og fjern supernatanten.
  12. Tilsæt 200 pi FITC-konjugeret Dolichos biflorus agglutin (DBA). Brug en 1: 100 fortynding af lectin i PBS plus 10% gedeserum. Resuspender forsigtigt lysatet ved pipettering. Inkuberi 1 time ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: DBA er en ligand, som binder til CST1 på parasitten cyste væg.
  13. Centrifuger lysatet ved 8000 xg i 5 min og kassér supernatanten. Der tilsættes 1 ml PBS til pelleten. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Gentag PBS vask 3x. Fjern supernatanten efter den sidste vask ved hjælp af en pipette.
  14. Brug en bred boring 20-200 pi pipettespids til at udarbejde 5 ul af farvede hjerne lysatet og sted på et objektglas. Monter dias med en 25 x 25 mm dækglas for at skabe en våd mount af hjernen lysat. Lav 3 gentagne dias ved hjælp af 5 ul hjerne lysat hver.
  15. Tæl antallet af cyster pr hver 5 pi aliquot ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et 10X objektiv (figur 6).
    BEMÆRK: Nogle cyster er store (8 eller flere parasitter ca.), mens nogle er meget små (1-2 parasitter pr cyste). Tæl antallet af cyster pr hvert dias, men nummer af store versus antal små cyster.
  16. Tilføj antallet af cyster itected i de tre forskellige portioner 5 pi og ganges med den samlede fortyndingsfaktor x 2 (kun halvdelen af ​​hjernen blev gjort til en lysat) til at estimere det samlede antal cyster pr hjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Toxoplasma gondii replikerer frit i naive makrofager og har en fordobling tid mellem 6-12 timer afhængig af stammen af parasitten. Figur 1 viser repræsentative parasitter i naive versus aktiverede knoglemarv-afledte makrofager. Figur 2 viser den generelle morfologi af parasitter i HFF værtsceller ved 2, 4, 8, 16 og 32 parasitter / PV. I den nuværende protokol, er parasitten lov til at invadere naive makrofager og etablere en spirende parasitophore vakuole (PV) før leveringen af ​​en potent aktivering stimulus, LPS og IFN, til de inficerede makrofager. I denne model er replikation af vildtype parasitter bremset, men parasit replikation stadig fortsætter i ca. 24 timer, i hvilket tidsrum makrofagerne gradvis blevet bedre til at inhibere parasit replikation. Skærmen er designet til at fungere som en modificeret konkurrence model mellem den nødvendige tid til potent makrofag activation versus tid, hvor vildtype parasit eller parasit mutant kan fortsætte med at replikere under dets PV. Det første trin i skærmen er at vælge en dosis af LPS og IFN γ skal anvendes til aktivering af inficerede makrofager. Dosis bestemmes empirisk ved at bedømme parasit replikation i makrofager aktiveret med enten en konstant dosis af IFN-γ i kombination med en række LPS-koncentrationer eller en konstant dosis af LPS med en række af IFN-koncentrationer (trin 1). Dosis af stimuli aktivering skal evalueres for de parentale vildtype parasitter, der anvendes til oprettelse af parasitten mutanter ved kemisk eller insertionsmutagenese. Ideelt dosis af LPS og IFN γ vil tillade parasit replikation til et gennemsnit på 2-8 parasitter pr PV 24-30 timer efter aktivering i forhold til 8-16 parasitter pr PV i naive makrofager (figur 1 og 2).

Når den passende koncentration af LPS og IFN ^7; bestemmes, mutanterne screenes i 96-brønds optiske bottom vævskulturplader. Den optiske bund i pladerne er vigtig, fordi uregelmæssigheder i plast, der anvendes til traditionelle vævskulturplader gør det vanskeligt at opnå den passende opløsning til at screene parasitterne ved fasekontrast og fluorescensmikroskopi. Fasekontrast og fluorescensmikroskopi af 96-brønds plader kræver også en inverteret fluorescensmikroskop med fasekontrast 4, 10, 20 eller 40x objektiv udstyret til lang arbejdstid afstande. Mutanter screenet i replikate plader indeholdende murine knoglemarv-afledte makrofager. Efter udfordring med parasitter mutanter er inficerede makrofager i brøndene af en plade aktiveret med LPS og IFN γ mens den anden plade indeholdende inficerede makrofager dyrkes i kun D10 medier. Pladerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24-30 timer efter tilsætning af LPS og IFN γ. Efter inkubation celler fiXED, farvet for parasitter og analyseret ved IFA anvendelse af både fluorescens og fasekontrastmikroskopi. Mutanter udvælges der har normale parasit numre og replikation i naive makrofager men færre parasitter eller mindre vakuoler med færre parasitter i inficerede makrofager, som aktiveres. Når mutanter udvælges de skal blive screenet igen i kammer slides (trin 3) i naive og aktiverede makrofager i to uafhængige forsøg for at muliggøre analyse af parasit morfologi ved højere forstørrelser (100X objektiv og olie) og bekræfte, at de har normal replikation i naive makrofager men en defekt i replikation / overlevelse efter makrofagaktivering.

De fænotyper af mutanter med defekter i resistens over for aktivering af inficerede makrofager typisk inddeles i to brede kategorier: parasitter, der vises morfologisk intakt, men er ude af stand til at replikere ud over en enkelt parasit pr PV; og parasitter, der synes at være nedbrydelighedEd og kan også være i amorf rummelige solceller (figur 1 og 3). Morfologien og ultrastrukturen af ​​parasitten og PV ses bedst på objektglas ved anvendelse af en 100X objektiv og olie og ved fasekontrastmikroskopi kombineret med fluorescens-analyse. Farvning af parasitter for IFA med et antistof mod lysosomal associeret membranprotein-1 (LAMP1) er nyttig til at bestemme, hvorvidt defekt i mutanten er forbundet med en manglende evne til PV at forhindre fusion med lysosomer. Vist i figur 4 er en parasit i et fagolysosomet (LAMP1 positiv) versus en parasit, der er i en PV, der stort set er adskilt fra endocytiske system værtscellen (LAMP1 negativ). Fagolysosomet er tydeligt ved en kontinuerlig fast rand af LAMP1 belaste omkring hele parasit. I modsætning hertil en PV ofte lysosom organeller i nærheden men ingen kontinuerlig rand LAMP1 farvning omkring sin omkreds. Anvendelsen af ​​antistoffer mod definerede strukturer / organeller inden than parasitten, og / eller PV er anvendelige opfølgning IFA undersøgelser for at identificere anomalier i hver mutant er forbundet med aktivering af inficerede makrofager. Sådanne afhøringer med antistoffer kan give indsigt i de mekanismer, der ligger til grund for replikation / overlevelse defekt i en mutant. For eksempel viser figur 5 T. gondii mitochondrie farvet med monoklonalt antistof 5F4 anti-F1 ATPase betaunderenhed (en venlig gave fra Peter Bradley) 24 timer efter aktivering af makrofager inficeret med vildtype parasitter eller parasit mutanter. T. gondii blev co-farvet med et monoklonalt anti T. gondii-antistof. Vildtype T. gondii har en enkelt mitokondrie der strækker sig rundt om omkredsen af parasitten. Parasitten eneste mitokondrie i vildtype parasitter efter aktivering af inficerede makrofager var intakt i forhold til en fragmenteret mitokondrie i mutant parasitter. Mitokondrier fragmentering var tydelig, ikke kun i forringet / amorfparasitter, men også i parasitter, viste normal morfologi som bedømt ved fasekontrastmikroskopi. Dette antyder, at defekten i parasitten mutanten kan øge modtageligheden af ​​parasitten mitokondrier at være vært cellemediatorer induceret af makrofagaktivering.

Den nuværende model anvender en kombination af IFN-γ og LPS at aktivere inficerede makrofager. IFN γ stimulerer transskriptionsfaktoren STAT1. LPS, ligesom TNF-α, stimulerer transskriptionsfaktoren NF-KB. Kendt IFN γ -afhængige antimikrobielle mediatorer vigtige i celleautonom immunitet mod T. gondii omfatter et array af IFN γ -afhængige immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs, Euros) og reaktive nitrogen og oxygen arter foruden andre midler. For at bestemme om defekten i hver mutant er specifikt associeret med produktion af kendte IFN γ inducerbare antimikrobielle mediatorer, er knoglemarv-afledte makrofager isoleret fraiNOS - / -, gp 91 phOx - ​​/ - eller specifikke IRG / GBP gen slettes mus og analyseret for aktivitet mod de mutante parasitter. Kombinationen af IFN γ og LPS at aktivere inficerede makrofager fortrinsvis resulterer i mutanter med forøget følsomhed over for nitrogenoxid sammenlignet med vildtype parasitter 28.

Aktivering af inficerede makrofager kan inducere fase differentiering af parasitter fra tachyzoitter til bradyzoiter der er indeholdt i væv cyster. Sådanne cyster er karakteristisk for kronisk infektion. Således kan parasit mutanter, der er defekte for replikation / overlevelse efter aktivering af inficerede makrofager også være defekte til omdannelse til cyster i in vivo-infektion. For at vurdere cyste produktion i kronisk infektion mus udfordret intraperitonealt (ip) med en ikke-dødelig dosis af den parentale parasit stamme eller mutant klon. Cyster i hjernen varierer i størrelse fra mindre end 10 _Tæl mi diameter til mere end 50 pm, som vist i figur 6 antallet af både store og små cyster ved IFA, men holde tællingerne adskilt for at fastslå, om parasitten mutant svækkes til total cyste produktionen eller bare for etablering; 6. og vedligeholdelse af store cyster.

Figur 1
Figur 1. Naive murine knoglemarv-afledte makrofager er permissive for replikation af T. gondii men aktivering med IFN γ og LPS i det væsentlige inhiberer replikation. (A) A parasitophore vacuole (PV) af vildtype T. gondii 24 timer efter invasion af naive murine knoglemarv-afledte makrofager. (B) et PV af vildtype T. gondii parasitter bestående af fire parasitter pr vacuole 24 timer efter aktivering af inficerede makrofager.(C) Et eksempel på en mutant parasit i stand til at replikere og stadig på én parasit / PV 24 timer efter aktivering af inficerede makrofager. (D) Et eksempel på en mutant parasit, der vises nedbrydes inden en amorf PV 24 timer efter aktivering af inficerede makrofager . Den øverste række viser fasebilleder af parasitter og den nederste række viser fluorescerende billeder ved hjælp af et polyklonalt anti-serum mod T. gondii. Skalaen bjælke repræsenterer 5 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Parasite replikation evalueret af antallet af parasitter pr PV. Billederne viser 2, 4, 8, 16 og 32 parasitter pr PV i HFF celler. Hvert billede er en fusioneret fase billede thpå viser polyklonale antistof farvning af parasitten i rødt og BFF kernen i blå (DAPI). Skalaen bjælke repræsenterer 5 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Mutanter udviser en række fænotyper efter aktivering af inficerede makrofager. Søjlen til venstre er en fase billede af parasitten i makrofager, midterste kolonne er et fluorescerende billede ved hjælp af et antistof til T. gondii, og højre kolonne er en sammenfletning af fasen og fluorescerende billede. Parasitten er vist i grønt, og makrofag kerne i blåt. Skalaen bjælke repræsenterer 5 pm. Klik her for at se et størreversion af denne figur.

Figur 4
Figur 4. LAMP1 farvning adskiller solceller fra phagolysomes-holdige parasitter. Parasitter farves med en polyklonale anti T. gondii-antistof (rød) og LAMP1 med mAb 1D4B (grøn). En pil markerer en parasit PV, der har fusioneret med lysosomer. Parasitten uden at pilen er i en parasitophore vakuole (PV), der ikke har fusioneret med lysosomer. Skalaen bjælke repræsenterer 5 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Vildtype parasitter opretholde en intakt mitokondrie mens mitochondripå nedbrydes i parasit mutanter efter aktivering af inficerede makrofager. Mitochondrion (grøn) i vildtype parasitter (øverste panel) i forhold til tre forskellige mutant T. gondii parasitter på forskellige stadier af nedbrydning (tre nederste paneler) 24 timer efter aktivering af inficerede makrofager. Skalaen bjælke repræsenterer 5 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Påvisning af parasit cyster i hjernen ved hjælp af FITC-konjugerede bønner biflorus lectin. Cyste væg mærket med lectin er vist i grøn. Skalaen bjælke repræsenterer 50 um. Klik her for at se et større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne protokol giver en ikke-partisk tilgang, der bruger aktivering af murine knoglemarvafledte makrofager og forward genetik at isolere T. gondii mutanter med en defekt i deres evne til at overleve aktivering af inficerede makrofager. Fænotypen af ​​mutanter efter makrofagaktivering typisk falder ind under en af ​​to brede kategorier: 1) Parasitterne synes intakt, men undlader at replikere over 1 parasit pr PV; 2) parasitter forekommer nedbrudt og kan være i rummelige, amorfe solceller. Den omstændighed, at mutanterne har en fænotype som vildtype parasitter i naive makrofager i fravær af aktivering viser protokollen kan specifikt anvendes til at identificere mutanter, der specifikt svækkede i deres evne til at modstå makrofagaktivering. Det anbefales at bruge af primær knoglemarv-afledte makrofager versus RAW 264.7 makrofag cellelinie til skærmen, da morfologi parasitterne og parasit nummer pr Vacuole lettere visualiseret i knoglemarv-afledte makrofager.

Den beskrevne skærm kombineret med fremadrettede genetik giver et alsidigt værktøj til at dissekere parasit gener og i sidste ende genetiske veje vigtige for resistens over for specifikke mediatorer af celle autonom immunitet. Sådanne fremadrettede genetik undersøgelser er vigtigt at identificere parasit gener, der kan følges som en streng til at begynde optrævling parasit veje er vigtige for at modstå specifikke antimikrobielle mediatorer både in vitro og under patogenese. En tidligere vanskeligheder med fremadrettede genetiske metoder var identifikation af nøglen gen afbrydes i hver mutant. Cosmidbibliotek komplementering i T. gondii har været ganske effektiv til funktionel komplementering af celledeling mutanter. Den omstændighed, at replikation af vildtype parasitter også undertrykkes ved IFN-γ og LPS kun i mindre grad end de mutanter gør funktionel komplementering vanskeligere than for celledeling mutanter. Hele genomet mutational profilering for både kemiske og insertionelle mutanter i T. gondii har for nylig vist sig som en produktiv, og selv omkostningseffektive, avenue at identificere de gener, der er ansvarlige for fænotyper af mutanter i forward genetik skærme 34,36,37,44. Derfor har hele genomet mutationel profilering ved hjælp af næste generation sekventering forbedret den potentielle anvendelse af kemisk mutagenese af T. gondii i forward genetiske undersøgelser for at identificere gener er vigtige for specifikke funktioner. En sådan fremadgående genetik fremgangsmåde som beskrevet i den nuværende protokol er vigtige, da de fleste af genomet af T. gondii forbliver hypotetisk med et flertal af forudsagte gener, der ikke har homologi til andre gener eller funktionelle domæner, der kan hjælpe med identifikationen af kandidat parasit gener er vigtige for immunforsvaret unddragelse.

IFA-analyse af 96-brønds plader ikke generelt betragtes som et high throughput screening opfyldtHod. Vores erfaring er det rimeligt for en person til at farve og skærm 10 plader med 96 brønde i en dag eller cirka 960 mutanter. I papiret ved Skariah et al., Blev ca. 8.000 mutanter analyseret og 14 uafhængige mutanter blev isoleret, der var væsentligt forringet for overlevelse / replikation i aktiverede, men ikke naive makrofager 28. Den Hæmmede overlevelse af mutanterne var overvejende skyldes øget modtagelighed for nitrogenoxid. Begrænsningen i den samlede fremgangsmåde er primært på det niveau for at opnå enkelte kloner af parasitten snarere end screening ved mikroskopi som den første skærm i plader med 96 brønde er kvalitativ og rimelig hurtigt. Bekræftelse af fænotypen af ​​mutanter identificeret i skærmen på plade med 96 brønde følges op i trin 3 ved kvantitativ og kvalitativ analyse ved hjælp af makrofager i kammer dias og ved at tilsætte lige mange vildtype eller mutant parasitter. Anvendelsen af ​​andre analytiske screeningsmetodersåsom fluorometri på den samlede befolkning niveau af parasitter, snarere end individuelle parasit niveau som vurderet ved mikroskopi, er problematiske i den nuværende protokol, som mange af de nedbrudte parasitter pletten med det polyklonale antistof mod T. gondii som robust som vildtype parasitter med forskellen i mutanten er mere kvalitativ end kvantitativt på niveauet for fluorescens intensitet. Også dosis af IFN-γ og LPS, der kræves til at isolere mutanter med en defekt i resistens over for aktivering af inficerede makrofager resulterer i undertrykt replikation af vildtype parasitter omend på senere tidspunkter. Derfor måling af total parasit nummer for skærmen fremad genetik, herunder anvendelse af luminescerende parasitter er problematisk. Det er imidlertid muligt farvningsprotokol kunne elimineres i screeningen trin, hvis de parentale parasit kloner anvendes til kemisk eller insertionsmutagenese udtrykt en konstitutiv eller inducerbar fluorescerende eller luciferase markør. Den beskrevne protokol anvendelse IFA og mikroskopi screening af makrofager i 96-brønds plader muliggør isolering af mutanter defekte for overlevelse / replikation i aktiverede makrofager, men også klart savner visse potentielle mutanter på grund af den begrænsede mikroskopisk opløsning opnås ved anvendelse af 96-brønds pladeformat som ved denne beslutning amorfe hævede vakuoler pletten for parasit-antigen kan forveksles med sunde replikerende parasitter inden for en normal PV. Udskiftning af 96 brønddæksel glasplader, i stedet for 96-brønds plader med en optisk overflade er tilbøjelige til at opnå større opløsning under skærmen af ​​inficerede makrofager i 96 brønds plader.

Størstedelen af mutanterne identificeret ved anvendelse af IFN-γ og LPS i den beskrevne protokol til at aktivere makrofager følgende parasit invasion har en defekt i deres evne til at beskytte sig selv fra nitrogenoxid 28. I denne henseende skærmen selv beregnet til at være ikke-forspændt,kan berige for isolering af parasitten mutanter med øget modtagelighed for specifikke antimikrobielle mediatorer afhængigt af aktivering betingelser, typen og arter af makrofager og timingen af ​​parasitten invasion forhold til makrofagaktivering der er valgt til skærmen. Således medfødte immun celle valgt til skærmen og aktiveringen stimuli anvendes, er kritiske parametre, der påvirker den type antimikrobielle mæglere, som de resulterende parasit mutanter sandsynligvis vil være modtagelige. Genotypen af parasitten er også en kritisk parameter som type I genotyper parasitten er relativt resistente over for immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs) induceret i respons på IFN-γ, mens type II og III genotyper er mere modtagelige 26,45,46. I den beskrevne protokol, er makrofager aktiveret efter parasit invasion. Selvom type II-genotypen, Prugnaud stamme, der anvendes i den beskrevne skærmen er modtagelige for virkningen af ​​immunitetsrelaterede GTPaser, enllowing parasitten at invadere makrofager først muliggør replikation af vildtype parasitter før fuld induktion af IRGs. Også, er det ikke klart, at IRGs er effektive mod parasitten, hvis de er induceret i makrofager efterfølgende at parasit invasion og initiering af replikation.

Den beskrevne protokol anvender makrofager til at identificere parasit gener er vigtige for resistens over for IFN-γ-afhængige mediatorer af celleautonom immunitet, især nitrogenoxid. Isoleringen af ​​en pulje af parasit-mutanter, der deler en markant tilbøjelighed til nitrogenoxid samt en delt fænotype af nitrogenoxid-afhængige mitokondrisk fragmentering giver et unikt sæt af værktøjer til at identificere parasit gener og veje vigtige for resistens over for nitrogenoxid og for at forstå virkningen af nitrogenoxid mere bredt mod T. gondii og andre eukaryote pathogens.The beskrevne protokol med mindre modifikationer kan anvendes til frem genetik studies til at identificere parasit gener vigtige for resistens over for forskellige mediatorer af celle autonom immunitet. Potentielle modifikationer indbefatter ændring af typen af ​​værtscelle smittet, stimuli aktivering eller timingen af ​​aktiveringen i forhold til parasit invasion. For eksempel vil præ-aktivering af murine makrofager med IFN-γ før tilsætning af parasitter resultere i aktivering af immunitetsrelaterede GTPaser. En sådan model vil kunne anvendes til at identificere parasit gener i type I genotyper T. gondii, som kan bidrage til resistens medieret af ROP18 og ROP5 til immunitetsrelaterede GTPaser 24,25. Mediatorer af celleautonom immunitet mod T. gondii i humane medfødte immunceller ikke er så godt defineret som i gnavere. Således er anvendelsen af perifert blod monocytter humane screene kemiske mutanter af T. gondii kunne identificere både parasit gener vigtige for overlevelse under human infektion i medfødte immunceller samt mekanismer vigtige i mennesker for antimikrobiel resistens til T. gondii. Parasite gener er vigtige for resistens over for specifikke antimikrobielle mediatorer kan identificeres ved at isolere mutanter ude af stand til at overleve eksponering af inficerede værtsceller til farmakologiske midler, såsom reaktive oxygen eller nitrogen arter. Tilsvarende protokol kan modificeres til at isolere parasit mutanter med øget modtagelighed for inflammasome aktivering 47-49 eller ATP stimulering af makrofag purinergiske receptorer 50.

Tilsammen protokollerne beskriver en tilgang med fremad genetik og medfødte immunceller til at isolere parasit mutanter vigtige for T. gondii resistens over for IFN-γ-afhængig celle autonom immunitet. Vigtigt er det, den tilgang rakte er alsidig og kan let modificeres til at isolere parasit gener vigtige for at unddrage bestemte antimikrobielle mediatorer, parasit overlevelse i specifikke typer af værtsceller eller modstand for krisesituationer, for encounterødt under toxoplasmose. Endvidere kan parasit gener er vigtige for værtscelle aktivering modsætter i mange tilfælde også spille en rolle direkte eller indirekte i cyste produktion in vivo under infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Hyclone SH3008101 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBS Thermo SH3091003 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBS Thermo SH3002802  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamine Thermo SH3003401  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strep Thermo SV30010  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSS Thermo SH3003002 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPS LIST biologicals 201 http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γ Pepro Tech Inc 50-813-664 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slides Thermo 177402 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical plates Thermo 165306 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture plates Fisher 353072 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25 Fisher 156367 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehyde Ted Pella 18505 http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100 Fisher BP151 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 - protein conjugation kit Life Technologies A20181 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serum MP Biomedicals ICN19135680 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting media Vector Labs H1200 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTracker Life Technologies L-7526 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 mice Jackson Laboratories 664 http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out mice Jackson Labaoratories 2365 http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out mice Jackson Laboratories 2609 http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprusside ACROS Organics AC21164-0250  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOate ACROS Organics AC32865-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Tags

Immunologi , makrofager medfødte immunitet intracellulært patogen immun svig infektionssygdomme forward genetik parasit
Forward Genetik skærme med makrofager til at identificere<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Vigtigt for Modstand mod IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immunitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B.,… More

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter