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Immunology and Infection

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52556
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College
* These authors contributed equally

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) ist ein obligat intrazelluläre, Protozoen-Erreger. Es ist der Erreger der Toxoplasmose, ein Gesundheitsrisiko bei immungeschwächten Individuen. Es ist auch das Modellsystem für andere apicomplexan Krankheitserreger, die Menschen, einschließlich Cryptosporidium und Cyclospora infizieren. Toxoplasmose ist am häufigsten durch den Verzehr von Nahrung oder Wasser mit dem bradyzoite oder Oozysten Stadium des Parasiten verunreinigt erworben. Nach der Einnahme konvertieren diese Stufen auf die Tachyzoiten Stadium des Parasiten, die in Wirtszellen repliziert und verbreitet systemisch. T-Zellen, IFN-γ und, in geringerem Maße, Stickstoffmonoxid 1-4, sind wichtig für die Kontrolle der Infektion jedoch nicht zur Eliminierung der Erkrankung, als Anteil der Tachyzoiten umwandeln zum bradyzoite Stufe, die innerhalb Gewebezysten geschützt was zu einem langlebigen chronischen Infektion. In der Tat gibt es keine wirksame Therapie gegen die chronische Zyste sTage der Erkrankung. Schwere Toxoplasmose ist meist durch die Reaktivierung der persistierenden Infektion mit dem bradyzoite Stadium des Parasiten Konvertierung zurück in die schnell zu replizieren Tachyzoiten Phase charakteristisch für primäre und akute Infektion.

Frühe Überleben angesichts der angeborenen Immunantwort ist wichtig, damit der Parasit, genügend Parasitenzahlen zu erreichen, sowie distalen Stellen zu erreichen, für die Niederlassung einer chronischen Infektion zu ermöglichen. T. gondii hat Strategien zur Wirtsabwehrmechanismen, die wahrscheinlich ihre Fähigkeit zu replizieren und Verbreitung der Infektion früh beitragen entgegenzuwirken entwickelt. Zuerst T. gondii bildet eine einzigartige PV bei Parasitenbefall weitgehend getrennt von den endozytischen und Exozytose-Prozesse der Wirtszelle im Vergleich zu anderen intrazellulären Pathogenen 5-9 ist. Auch, wie alle erfolgreichen intrazelluläre Erreger T. gondii modifiziert seine Wirtszelle, um einen permissiven Umgebung f erstellenoder Wachstum. Dies beinhaltet eine Anpassung Wirtszelle Genexpression durch Veränderung Wirtszelle Transkriptionsfaktoren einschließlich der wichtig für die Regulierung Zellaktivierung 10-15. ROP16 16-19 GRA15 20. GRA16 21 und GRA24 22 erwiesen sich alle als bei der Regulierung der Transkriptionsreaktion und Zellsignalkaskaden von Wirtszellen mit T. infiziert wichtig gondii. Jüngste Studien mit genetischen Kreuzungen zwischen Parasitenstämme mit unterschiedlichen Phänotypen sehr produktiv bei der Identifizierung von Genen, die Parasiten Parasiten Genotyp-abhängigen Eigenschaften einschließlich Umgehung der Immunität GTPasen (IRGs) 16,19,23-26 zugrunde liegen gewesen. In Mäusen sind Immunität GTPasen (IRGs) kritisch für die Steuerung der Typ II und III Genotypen des Parasiten während der sehr virulenten Typ I Genotypen Mechanismen entwickelt, um die murinen IRGs entziehen. Es ist aber auch klar, dass der Parasit hat Mechanismen entwickelt, um antimikrobielle Medien umgehenren neben den IRGs und dass einige dieser Mechanismen können für Parasiten Genotypen 27,28 konserviert werden. Zudem ist sehr wenig über den kritischen Mediatoren der Zell autonome Immunität gegen T. bekannt gondii während menschliche Toxoplasmose. Parasite Gene wichtig für die Resistenz gegen Vermittler von Zell autonome Immunität kann auch überlebenswichtig sein, während Tachyzoiten Umwandlung, die auch von Wirtsimmunreaktionen ausgelöst werden können, um bradyzoite. So kann beispielsweise Stickstoffmonoxid auf hohem Niveau Parasitenreplikation in infizierten Makrophagen unterdrücken, aber es kann auch dazu anregen Tachyzoiten zu Umrechnung in Zyste Produktion 30-32 bradyzoite.

ToxoDB ist eine funktionelle Genomdatenbank für T. gondii, der als wichtige Ressource für das Feld in Bezug auf die Bereitstellung Sequenzinformation für die Parasitengenom und den Zugang zu veröffentlichten und nicht veröffentlichten genomischen Maßstab Daten einschließlich Community Anmerkungen Gen exp ression und Proteomik-Daten 33. Ähnlich wie bei vielen Protozoen- Pathogene, der Großteil des Genoms besteht aus hypothetischen Gene ohne von Informationen aus Genhomologie Einblick in ihre möglichen Funktionen bereitzustellen. So ist nach vorn Genetik ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Parasiten Gene wichtig für Immunevasion, Zyste Umwandlung und andere Funktionen entscheidend für Parasiten Pathogenese als auch für die Konvertierung zwischen verschiedenen Entwicklungsstadien zu identifizieren. Eine weitere Stärke der Vorwärtsgenetik ist, dass es als ein relativ nicht-vorgespannten Ansatz verwendet, um den Parasit zu den Genen, die für spezifische Aufgaben in Pathogenese, einschließlich Immunumgehung und Zystenbildung sind abzufragen. Die jüngsten Verbesserungen in Next Generation Sequencing für Mutationsprofiling haben sie eine Methode der Wahl für die Identifizierung der verantwortlichen Parasiten Gene von vorn Genetik Studien unter Verwendung von chemischen und Insertionsmutagenese 34-37 hergestellt.

ntent "> Es ist wichtig, um Schwachstellen in T. gondii, die ausgenutzt werden, um die Wirksamkeit der Zell autonomen Immunmechanismen gegen den Parasiten insbesondere solche, die auch gegen die resistenten Zyste Bühne aktiv sein können. Um dieses Ziel zu, ein in vitro-Mäuse zu verbessern identifizieren Makrophageninfektion und Aktivierungsmodell wurde entwickelt, um Mutationen in die Parasiten, insbesondere T. gondii Fitness nach Aktivierung der infizierten Makrophagen, aber nicht in naiven Makrophagen limitieren. Dieses Makrophagen Bildschirm verwendet, um eine Bibliothek von T. gondii Insertionsmutanten um abzufragen letztendlich identifizieren T. gondii wichtige Gene für die Resistenz gegen Stickoxid 27,28. Die Isolierung von einem Panel von T. gondii-Mutanten mit verminderter Widerstandsfähigkeit gegenüber der Aktivierung der infizierten Makrophagen, insbesondere eine ausgeprägte Empfindlichkeit gegenüber Stickstoffmonoxid, erwies sich die Nützlichkeit des Screening zur Identifizierung Parasiten Gene wichtig für WiderstandMediatoren der Zell autonome Immunität mit Ausnahme der für die murine IRGs 28 beschriebenen Resistenzmechanismen. Insertionsmutagenese hat Vorteile gegenüber chemischen Mutagenese im Hinblick auf die Erzeugung einer begrenzten Anzahl von zufälligen Mutationen in jeder Parasit Klons und theoretisch eine leichtere Identifizierung der Mutationsstelle. Die Identifizierung der Genom-Stelle des Plasmids Insertion in T. gondii Insertionsmutanten in der Praxis hat sich überraschend schwierig, in vielen Fällen 37. Einführen eines Plasmids in einem Gen ist auch geeignet, die Funktion eines Gens, das im Gegensatz zur chemischen Mutagenese, die typischerweise zu einzelnen Nucleotidänderungen stören. Die chemische Mutagenese mit entweder N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) zu einer erhöhten Fähigkeit, einen größeren Teil des Parasitengenoms zu analysieren bieten, im Vergleich zu Insertionsmutagenese, da sie mehrfache Punktmutationen erzeugt ( geschätzt bei 10 -100) pro Mutante 34, 38. Außerdem jüngsten Fortschritte in der gesamten Genoms Profilierung hat es möglich gemacht, um der nächsten Generation Sequenzierung verwenden, um die wahrscheinlichsten Kandidaten-Gene für die identifizierte Phänotyp eines mutierten Parasiten 34,38 verantwortlich sind. Unabhängig von der Mutagenese-Ansatz, Bestätigung der Rolle von dem Parasiten Gen der Resistenz gegen Makrophagenaktivierung erfordert letztendlich Gendeletion und Komplementation zu molekularer Koch-Postulate zu erfüllen.

Die Fähigkeit, die Funktion eines Gens durch genetische Manipulation sowohl des Parasiten und dem Makrophagen zergliedern ist wichtig, da viele der über Vorwärts Genetik in T. identifizierten Gene gondii, wie auch andere Krankheitserreger, werden noch als hypothetische Gene mit wenig bis keine Sequenzhomologie zu anderen Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. Die aktuelle Papier einen allgemeinen Ansatz, der verwendet werden kann, um zu ermitteln, ob die unterbrochene Gen in einer Mutante ist wichtig für den Widerstand gegen eine bekannte oder umreißtunbekannt Vermittler von Zell autonome Immunität. Die erste Analyse der Host antimikrobielle Faktoren wird durch die Auswertung der Überlebensrate von Wildtyp und Mutante Parasiten in Makrophagen, die von Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu denen mit spezifischen Gendeletionen in induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH-Oxidase) durchgeführt wird, und spezifische Immunität GTPasen (IRGs). Damit wird festgelegt, ob die identifizierten Parasiten Gene sind wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffmonoxid, reaktive Sauerstoffzwischenprodukte oder Immunität GTPasen bzw. 28 oder wenn ein unbekannter Immunsystems beteiligt ist. Aktivierung der infizierten Makrophagen sowohl IFN-γ und LPS in der aktuellen Protokoll beschrieben, resultiert in erster Linie bei der Isolierung von Parasitengene wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffoxid 28. Die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die Stickstoffmonoxid in Abwesenheit von Makrophagen-Aktivierung zu induzieren (Stickoxiddonoren) bestätigte, dass die Mehrheit der identifizierten Gene, die für Wieder warenWiderstand gegen Stickstoffmonoxid anstatt Stickoxid zusammen mit weiteren Mediatoren mit Makrophagenaktivierung 28 verbunden.

Schritt eins und zwei beschreiben eine Vorwärtsgenetik Bildschirm entworfen, um Parasiten Mutanten mit einem Fitness-Defekt nach der Aktivierung von infizierten Knochenmark-Makrophagen in vitro zu isolieren. Schritt eins beschreibt eine Dosistitration Analyse empirisch bestimmen eine Dosis von IFN-γ und LPS für Makrophagenaktivierung, die Parasiten Replikation reduziert, aber nicht vollständig hemmen die Replikation von Wildtyp T. verwenden gondii Elternstamm, die für die Erstellung der Bibliothek des Parasiten Mutanten verwendet wird. Schritt zwei wird die Vorwärts genetischen Screening der Mutanten-Klone in Makrophagen in 96-Well-Platten. Schritt drei beschreibt einen Ansatz, um den Phänotyp jeder Mutante in dem Bildschirm der 96-Well-Platten identifiziert und zu bewerten, ob der Fehler in jeder Mutante wirkt das Überleben der Parasiten, die Replikation zu bestätigen,oder Zysten Produktion als Antwort auf die Makrophagenaktivierung. Schritt vier wird die Verwendung von Knochenmark-Makrophagen von Mäusen mit Deletionen in spezifischen antimikrobiellen Wege um die Immunmediatoren, auf die der Parasit Mutante spezifisch empfindlich identifizieren. Schritt fünf beschreibt einen Ansatz, um zu bestimmen, ob ein Parasit Mutante ist auch für in vivo Pathogenese beeinträchtigt, wie durch Zystenproduktion in den Gehirnen von infizierten Mäusen ausgewertet.

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Protocol

HINWEIS: Alle Protokolle, die die Verwendung von Tieren beteiligt wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der New York Medical College der Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.
HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die chemische Mutagenese 38, Isolierung von Parasiten durch Grenzverdünnung 38, Isolierung von murinen Knochenmark-Makrophagen 39, das Wachstum von T. gondii in humanen Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen und Zysten in Makrophagen und grundlegende Immunfluoreszenzanalyse (IFA) 32 verwiesen. Führen Sie alle Zellkultur bei 37 ° C in 5% CO 2 in D10 Medien (Dulbecco modifiziertem Hoch Glucose Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin) . Bewahren Sie alle Reagenzien im gesamten Zellisolierungen und Zellkultur steril.

1. Dosistitration von IFN-γ und LPS die Konzentr Bestimmentionen zu verwenden, um infizierten Makrophagen für die Zukunfts Genetics Bildschirm aktivieren

  1. Kultur murinen Knochenmark-abgeleitete Makrophagen O / N in acht Kammerobjektträgern mit einer Konzentration von 3 × 10 5 Zellen / ml in 250 & mgr; l D10 Medium pro Kammer. Verwenden Makrophagen 1-2-Wochen nach der Isolierung aus dem Knochenmark.
    HINWEIS: Kammerobjektträger gekauft, die eine wachstumsfördernde RS waschen müssen.
  2. Verwenden Sie ein Hämozytometer zum Wildtyp-Parasiten von humanen Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen in einer T25-Zellkulturflasche gewachsen geerntet zählen. Resuspendieren Parasiten in einer Konzentration von 5 × 10 5 Wildtyp-Parasiten pro ml in D10 Medien. Diese Konzentration wird in einer Infektionsmultiplizität von etwa 1: 1 ergeben, wie die Makrophagen werden O / N vermehrt haben. Verwenden Sie Polystyrol oder PET Rohre für alle Manipulationen mit Parasiten, wie die Parasiten klebt an Polypropylen.
  3. Nehmen Sie die D10 Medien in den Kammer-Objektträgern und ersetzen mit 250 ul derAussetzung der Wildtyp-Parasiten. Fügen Sie vorsichtig die Parasitensuspension in jede Kammer des Schiebers, indem man es fließen die Innenfläche der jeweiligen Kammer. Erlauben keine Makrophagen an irgendeinem Punkt während der Protokoll austrocknen.
  4. Abdeckung Kammer-Objektträgern mit Parasiten mit der Kammer Schiebeabdeckung und bei 37 ° C für 4 h infiziert in einem Inkubator in 5% CO 2, um Zeit für die Parasiten, um einzudringen und stellen Sie eine PV ermöglichen.
  5. Die Verdünnungen von LPS und IFN-γ in 1 ml D10 Medium in sterilen Röhrchen für die Dosisanpassung. Für die eine Dosisanpassung zu halten entweder LPS oder IFN-Konzentration konstant und variiert die anderen Stimulus 40.
    1. Zum Beispiel halten LPS konstant bei 10 ng LPS pro ml und variiert die Konzentration von IFN-γ (0, 1 Einheit / ml, 10 Einheiten / ml, 100 Einheiten / ml, 1.000 Einheiten / ml). Halten IFN γ bei 100 Einheiten / ml konstant und variiert die Konzentration von LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Kurz beschallen LPS Lager für 2 Minuten ohneHeizung in einem Ultraschallbad (nicht mit einer Spitze Ultraschallgerät) vor der Verdünnung.
      HINWEIS: Die Ultraschallbehandlung wird empfohlen, Micellaggregate von LPS zu binden, die nicht korrekt an Wirtszellen gebildet stören.
  6. 4 Stunden nach Beginn der Ko-Kultur zwischen den Parasiten und adhärenten Makrophagen in der Kammer Rutsche, entsorgen Sie die D10 Medien in jeder Kammer und ersetzen Sie es mit 300 ul der geeigneten Verdünnungen von IFN-γ und LPS in D10 Medien. Umfassen eine Steuerung mit nur D10 Medien Parasiten Replikation in Abwesenheit von Makrophagen-Aktivierung zu bewerten.
  7. Re-Abdeckkammer gleitet mit der Kammer Gleitabdeckung und in einen Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 bis 30 weitere Stunden.
    Hinweis: Die Inkubationszeit hängt von der Verdopplungszeit des Wildtyp-Parasit-Stamm, der 6 bis 12 h in Abhängigkeit von der Parasitenstamm reichen kann. Ein Zeitpunkt wird so gewählt, vor der Lyse von naiven Makrophagen parasite aber lang genug, um mindestens 3-4 Dou Freigabebling Zeiten.
  8. Einen 2,5% igen Formaldehydlösung in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entsorgen Sie die Medien in der Kammer Rutsche und ersetzen mit 300 ul 2,5% Formaldehyd-Lösung. Fix für 20 min bei RT.
  9. Rinse Schieber (n) zweimal mit je 300 ul PBS pro Kammer. Für jeden Spül-, entsorgen Sie die PBS in der Folie und neue PBS sanft die Innenseite jeder Folie Kammer, um eine Störung der Makrophagen auf den Objektträger geklebt. Fügen Sie 300 ul PBS pro Kammer und Ort Abdeckung auf Kammer Folie, um Folien aus vor dem Austrocknen zu verhindern Färbung.
    HINWEIS: Folien können bei 4 ° C für bis zu 3 Tage an dieser Stelle vor der Färbung platziert werden.
  10. Färbeprotokoll für T. gondii Erkennung durch Immunfluoreszenz (IFA).
    1. Machen Sie eine 0,2% Triton X-100-Lösung in PBS (Permeabilisierung Puffer). Platzieren der Lösung in einem Rohr in einem 37 ° C Wasserbad und Vortexen, um sicherzustellen, das Triton X-100 in Lösung geht. Entsorgen Sie diePBS in den Kammer-Objektträgern und ersetzen mit 300 ul der Permeabilisierung Puffer. Verlassen bei RT für 30 min.
    2. Einen Lösung von 10% Ziegenserum in PBS (Blocklösung). Entsorgen Sie die Permeabilisierung Puffer in der Folie und ersetzen mit 300 ul Blockierungslösung pro Kammer. Verlassen bei RT für 30 min.
      HINWEIS: Fetales Kälberserum für Ziegenserum in allen Färbeprotokollen ersetzt werden.
    3. Für eine noch einen Schritt IFA Färbeprotokoll, machen Sie eine 1: 1000 Verdünnung eines Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gegen T. gondii in Blockierungslösung. Entfernen Blockierungslösung von Folie und fügen Sie 150 ul Antikörperlösung pro Kammer. Bringen Sie die Abdeckung gleiten auf Kammer Folie, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. Inkubieren für 1 h bei RT.
      HINWEIS: Antikörper-Konzentration muß empirisch je nach der Quelle bestimmt werden. Antikörper erworben wird direkt an ein Fluorochrom konjugiert sind oder an ein Fluorochrom vom Benutzer konjugiert.
      1. Für einen zweistufigen IFA FärbungProtokoll mit einem unkonjugierten Antikörper gegen T. gondii und eine fluoreszenz konjugierten Sekundärantikörper, Fleckenträger mit 150 ul unkonjugierten primären Antikörper gegen T. gondii in Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT. Spülen Sie 3x mit 300 ul PBS plus 1% Ziegenserum (Waschpuffer).
      2. Jeweils 150 ul fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper, der spezifisch für die Ursprungsspezies für den primären Antikörper. Bringen Sie die Abdeckung gleiten auf Kammer Folie, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. Inkubieren für 1 h bei RT.
    4. Rinse Folien 3x mit PBS plus 1% Ziegenserum (Waschpuffer). Für jede Spülen, entfernen Sie die Lösung in den Kammer-Objektträgern durch das Einbringen ihrer Inhalte und ersetzen mit 300 ul Waschpuffer.
    5. Rinse gleitet 2x mit 300 ul PBS.
    6. Entfernen Sie die Kammer aus der Kammer Folie als den Anweisungen des Herstellers.
    7. Berg rutscht mit Montage Medien mit DAPI (4'6-Diamidino-2-Phenyl-Indol, dilactate) und einem 22 mm x 50 mm Deckglas.
  11. Untersuchen Sie Folien mit Phasenkontrast und Fluoreszenz-Mikroskopie. Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der Parasiten pro Vakuole durch die Untersuchung von mindestens 100 PV pro Kammer gut. Die gewählte Dosis von IFN-γ und LPS für den Bildschirm muss ausreichen, um zu unterdrücken, aber nicht verhindern, dass die Replikation von Wildtyp-Parasiten (siehe Abbildung 1).

2. Isolierung von Parasite Mutanten mit Fitness Defect Nach Aktivierung von infizierten Makrophagen

HINWEIS: Eine Bibliothek von Zufalls T. gondii Mutanten wird für die Vorwärtsgenetik Bildschirm erforderlich. Zufallsmutagenese T. gondii kann durch chemische (DEU / EMS) oder Insertionsmutagenese 27,28,38 durchgeführt werden. Nach der Mutagenese Klon Parasiten durch Grenzverdünnung und wachsen einzelnen Klonen in 96-Well-Platten, die anhaftende HFF-Zellen in einem Volumen von 200 ul der Medien D10 32,38.Entscheidend ist, dass Platten mit 96 Vertiefungen für ein Screening von Parasiten in den Makrophagen durch Mikroskopie weisen optische Sumpf mikroskopische Screening zu ermöglichen. Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie zum Screening gefärbten 96-Well-Platten erfordert ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit Phasenkontrast-4, 10, 20 oder 40-fach Objektiv für große Arbeitsabstände ausgestattet. Eine 4X Ziel ist nützlich, wenn Sie die gesamte gut, aber eine bessere Auflösung der Parasiten mit dem 20X Ziel erreicht.

  1. Dann werden 50 & mgr; l in konfluenten HFF-Zellen in zwei gewachsen in 96-Well-Gewebekulturplatten Tachyzoiten Mutanten replizieren 96-Well-Platten, die Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen (1-2 Wochen nach der Trennung) in 100 & mgr; l D10 Medien.
    HINWEIS: Führen Sie das Einstiegsbild in 96-Well-Platten des Parasiten auf das Volumen der Parasit Kultur zu vermeiden, dass die Anzahl der Parasiten pro jeweils übertragen und zu zählen. So wird die Mikroskopie Analyse in 2,6 qualitativ auf der Basis whether Parasiten im Allgemeinen repliziert oder nicht repliziert. Schritt 3 beschreibt die Vorgehensweise, um den Phänotyp der Mutanten in Kammer-Objektträgern bestätigen Sie mit einer gleichen Anzahl von Wildtyp oder Mutante Parasiten, die Makrophagen zu infizieren.
    1. Direkt Parasiten auf die D10 Medien hinzufügen, die bereits in jedem Well. Infect zwei Brunnen mit Wildtyp-Tachyzoiten als positive Kontrolle für Parasiten-Replikation.
  2. Platzieren Sie die infizierten Zellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) für 4 h auf Parasiten erlauben Zeit, um die Zellen eindringen und erzeugen ihre PV.
  3. Entfernen Sie das Medium von einer Platte durch das Einbringen der Inhalt der Platte. Verwenden Sie eine einzige Wink mit dem Handgelenk, um die Medien in der Platte in eine Ablagebecken, das eine Reinigungs abtötende für die Parasiten zu entleeren.
    1. 100 l "Makrophagenaktivierung Medien" mit einem sterilen Becken für die Medien und einer Mehrkanalpipette. Verwenden Sie die optimale Konzentration von LPS und IFN-γ aus Schritt 1 für den mac bestimmtrophage Aktivierung Medien. Ebenso entfernen Medien aus der doppelten Steuerplatte und ersetzen mit 100 ul D10 Medien.
  4. Platzieren Sie die infizierten Zellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) für eine weitere 24-30 Std.
  5. Färbeprotokoll für 96-Well-Platten für die IFA.
    1. Entsorgen Sie die Medien in der Platte und ersetzen mit 100 ul 2,5% Formaldehyd in PBS. Inkubieren für 20 min bei RT. Verwenden Sie eine sterile Becken für die Formaldehyd und einer Mehrkanalpipette.
    2. Entsorgen Sie die Formaldehyd-Lösung in der Platte und fügen Sie 100 ul PBS, das Formaldehyd aus dem Teller zu spülen.
    3. Entsorgen Sie die Lösung in der Platte und fügen Sie 100 ul der Permeabilisierung Puffer (PBS mit 0,2% Triton X-100) in jede Kavität. Inkubieren für 30 min bei RT.
    4. Entsorgen Sie die Lösung in der Platte und fügen Sie 100 ul Blockierungslösung (PBS mit 10% Ziegenserum) in jede Kavität. Inkubieren für 30 min bei RT.
    5. Entsorgen Sie die Lösung in der pspät. Dann werden 50 ul / Vertiefung einer fluoreszenz konjugierten Anti- T. gondii Antikörper verdünnt 1: 1000 in PBS plus 1% Ziegenserum. Inkubieren für 1 h bei RT mit der Blechabdeckung auf und auf einer Wippe.
      1. Alternativ verwenden Sie eine nicht konjugierte primäre Antikörper gegen T. gondii, gefolgt durch Färbung mit einem fluoreszent-konjugiertem sekundärem Antikörper wie in 1.10.3.1 beschrieben.
    6. Entsorgen Sie die Antikörperlösung in der Platte und ersetzen mit 100 ul / Vertiefung PBS plus 1% Ziegenserum. Führen Sie diese Spülung 3x gefolgt von 2 zusätzlichen Spülungen mit PBS alleine. Lassen Sie 200 ul PBS in jede Vertiefung und setzen Sie die Abdeckung auf der Platte mit 96 Vertiefungen, um die Wells nicht austrocknen.
      HINWEIS: Die Platte mit der Abdeckung kann in Parafilm eingewickelt und bei 4 ° C für bis zu 3 Tage vor der Analyse durch Mikroskopie platziert werden.
  6. Untersuchen Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines 20-40X Ziel. Wählen Sie die Mutanten, die in den na und replizieren# 239; ve Makrophagen Platte aber überwiegend nicht in "aktivierte Makrophagen", über ein Parasit / Vakuole zu replizieren oder die amorphe oder in "aktivierte Makrophagen" abgebaut angezeigt.
    HINWEIS: Die Anzahl der Wildtyp-Parasiten pro Vakuole werden von der Dosis von IFN-γ und LPS abhängen, sondern im Idealfall etwa 4 Parasiten pro Vakuole; eine Zahl, die Unterdrückung des Wachstums, aber nicht vollständige Hemmung der Replikation von dem Aktivierungsstimulus widerspiegelt.

3. Werten Sie die Mutanten zu ermitteln, wenn der Mangel auf der Ebene der das Überleben der Parasiten oder Replication Nach Aktivierung von infizierten Makrophagen

  1. Selektierte Parasiten Mutanten von 96-Well-Platten (Inhalt der gesamten gut) bis T25s, die HFF-Zellen und ermöglicht die Replikation.
  2. Kultur Knochenmarkmakrophagen O / N bei 8 Kammerobjektträgern mit einer Konzentration von 3 × 10 5 Zellen / ml in 250 & mgr; l D10 Medien. Vorbereiten einer Folie zur pa vergleichenrasite Replikation in naiv Makrophagen und eine zusätzliche Folie, um Parasiten Replikation nach der Aktivierung von infizierten Makrophagen zu vergleichen.
  3. Ernte Tachyzoiten Parasiten und zählen in einem Hämocytometer. Fügen Sie 5 x 10 4 T. gondii Parasiten zu einer Kammer, die auch Makrophagen in D10 Medien und Kultur 4 Stunden. Fügen Sie einen gut mit Wildtyp-Eltern Parasiten als Kontrolle. Impfen Sie eine identische Replikation Schlitten mit der gleichen Parasiten Klon, der nicht Aktivierung Medien, um die Replikation des Parasiten in Makrophagen naiv überwachen erhalten soll.
  4. Entsorgen D10 Medien aus 1 der Wiederholungskammer gleitet und ersetzen mit 250 ul "Aktivierungsmittel". Entsorgen D10 Medien von der anderen Wiederholungskammer Rutsche und ersetzen mit 250 ul D10 Medien. Inkubieren sowohl die "aktivierte" oder "naiven" Makrophagen-Schlitten mit der Kammer Schieber auf bei 37 ° C und 5% CO 2 für eine zusätzonal 24-30 h.
  5. Fix, permeabilisiert, und Block Folien für IFA Färbung und Analyse von Parasiten, wie in Schritt 1 beschrieben, durchführen IFA Färbung mit den Kammern intakt.
    1. Co-Fleck-Zellen mit einem Antikörper gegen Membran-assoziierten 1 (LAMP1) oder Lysotracker und Antikörper gegen T. lysosomalen gondii zu beurteilen, ob die Aktivierung von infizierten Makrophagen auslöst Fusion der Mutante PVs mit Lysosomen (Abbildung 4).
    2. Verwenden Antikörper gegen spezifische Fächer / Organellen innerhalb der Parasit / PV für die Färbung von IFA Änderungen, die dem Parasiten Mutante, die offensichtlich sind früh nach Makrophagenaktivierung 28 zu identifizieren.
      HINWEIS: Solche Veränderungen können Einblick in den Mechanismus, der die Fehlüberlebens / Replikation der mutierten folgenden Makrophagenaktivierung zugrunde bereitzustellen.
  6. Untersuchen Sie Dias mit einem 100X Phasen Öl-Objektiv und Fluoreszenzmikroskopie.
    1. Bewerten Parasiten Replikation durch die Bestimmung derAnzahl der Parasiten pro PV in 100 zufällig Vakuolen. Führen Sie mindestens 2 Grafen von 100 Vakuolen jeweils für die statistische Analyse.
    2. Bewerten allgemeinen Parasiten Morphologie unter Verwendung von sowohl Fluoreszenzanalyse sowie Phasenkontrastmikroskopie. Ansicht Parasiten unter Phasen 100x Objektiv. Gesunde Parasiten Parasiten fest in einem eng anliegenden parasitophoren Vakuole bei. Parasiten, die amorphe Phase mit großen Vakuolen dichten Felgen oder amorphe Parasiten schlagen Parasiten Tod und nicht nur einen Fehler bei der Replikation (Abbildungen 1 und 3).

4. Evaluieren, ob die Anfälligkeit von Mutant Parasiten zu Aktivierung von infizierten Makrophagen wird mit bekannten Antimikrobielle Mediators Assoziierte

  1. Isolieren Knochenmark-Makrophagen aus Wildtyp-C57 / BL6-Mäusen, iNOS - / -, gp91-phox - / - oder Irgm1 / Irgm3 - / - Mäuse 32.
  2. Kultur jeweiligen Knochenmark stamm macrophages O / N bei 8 Kammerobjektträgern mit einer Konzentration von 3 × 10 5 Zellen / ml in 250 & mgr; l D10 Medien.
  3. Fahren Sie mit dem Parasiten Herausforderung, IFA-Färbung und Analyse wie in Schritt 3 beschrieben.
  4. Bestimmen, ob die Fähigkeit der Mutante Parasiten zu überleben und zu replizieren nach Aktivierung der infizierten Makrophagen in Abwesenheit von reaktiven Sauerstoff oder Stickstoffspezies oder spezifische Immunität GTPasen 28 wiederhergestellt.
  5. Verwenden pharmakologischen Mitteln, wie beispielsweise Stickstoffmonoxid-Donatoren, um auszuwerten, ob spezifische antimikrobielle Mediatoren sind ausreichend, um sich um mutierte Parasiten in HFF-Zellen oder Makrophagen naiven beeinträchtigen oder wenn sie in einem Strang nur mit anderen Mediatoren aus Makrophagen-Aktivierung 28.

5. Beurteilen, ob der Defekt in der Mutant Parasite Kompromisse Chronic Infection

  1. Isolieren Tachyzoiten von Wildtyp, Mutante oder gezielte Gen gelöscht Parasiten in T25s Zusammenarbeit gewachsenntaining HFF-Zellen. Parasiten sind frisch aus HFF Kulturen lysiert werden.
  2. Graf Parasiten mit einer Zählkammer. Resuspendieren Parasiten in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) bei einer Konzentration pro ml geeignet für eine subletale Dosis des Parasiten in 200 ul durch intraperitoneale (IP) Injektion verabreicht.
  3. Verwenden einer 1 ml Tuberkulin-Spritze und 25 G Nadel Parasiten mit einem 200 ul Volumen intraperitoneal (IP) injiziert. Die Dosierung hängt von der Wildtyp-Stamm des Parasiten und der Maus-Genotyp.
    HINWEIS: Typ I-Genotypen des Parasiten tödlich an Mäuse während der akuten Phase der Infektion unabhängig von Parasiten Dosis und sind nicht geeignet für die Untersuchung der chronischen Infektion in Abwesenheit von Chemotherapie T. gondii zu Parasiten Replikation unterdrücken.
  4. Dreißig Tage nach Parasiten Herausforderung, opfern Mäuse durch Inhalation von CO 2 aus einem Druckbehälter in einem menschenleeren Kammer (eine Standard-Größe Maus Käfig kann nicht mehr als 5 m enthaltenEis) durch Genickbruch folgte.
  5. Trennen Sie das Gehirn von der Maus mittels der üblichen Verfahren 41-43.
    1. Legen Sie die Maus auf seiner Vorderseite. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren.
    2. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um durch den Hirnstamm geschnitten. Verwenden Dissektionsscheren einen flachen Schnitt seitlich um den rechten und dann der linken Seite des Schädels hend von der Basis des Stammhirns zu machen. Verwenden einer Pinzette vorsichtig schälen die Schädel, um das Gehirn aus.
    3. Gently heben Sie die Gehirn und Ort Schere zwischen dem Gehirn und Schädelbasis, um den Riechnerv abgeschnitten, um das Gehirn zu befreien. Heben Sie das Gehirn mit einer sterilen Pinzette oder einem Spatel und in eine bakteriologische Petrischale mit 10 ml sterilem PBS.
  6. Schneiden des Gehirns in der Mitte mit einem sterilen Skalpell durch den Mittelpunkt zwischen der rechten und der linken Hemisphäre.
  7. Die Hälfte des Gehirns zu einem kleinen Mörser mit 1 ml PBS. Verwenden Sie den Mörser und Stößel zueinen feinen Gewebesuspension des Gehirns, die durch eine große Bohrung 20-200 ul Pipettenspitze passieren können.
    HINWEIS: Die andere Hälfte des Gehirns sollte in 2,5% Formaldehyd für 1 Stunde fixiert, wenn Gewebeschnitte für die Histopathologie benötigt.
  8. Zeigen 100 ul des Gehirns Lysat in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml 2,5% Formaldehyd in PBS in die Röhre, die das Gehirn-Lysat, um die Gehirnsuspension zur Färbung fixieren. Inkubiere bei Raumtemperatur für 30 min.
  9. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 8.000 xg für 5 min in einer Mikro und vorsichtig den Überstand verwerfen.
  10. 1 ml der Permeabilisierung / Blockierungspuffer zu dem Lysat (10% Ziegenserum, 0,2% Triton X-100 in PBS). Inkubiere bei Raumtemperatur für 30 min.
  11. Centrifuge Lysat bei 8.000 xg für 5 min und entfernen Überstand.
  12. Fügen Sie 200 ul FITC-konjugiertem dolichos biflorus agglutin (DBA). Verwenden Sie eine 1: 100 Verdünnung des Lektins in PBS plus 10% Ziegenserum. Resuspendieren Sie vorsichtig das Lysat durch Pipettieren. Bebrütenfür 1 h bei RT.
    HINWEIS: DBA ist ein Ligand, der an CST1 auf den Parasiten Zystenwand bindet.
  13. Zentrifuge Lysat bei 8000 × g für 5 min und Überstand verwerfen. 1 ml PBS zu dem Pellet. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. Wiederholen Sie PBS-Wasch 3x. Entfernen Sie den Überstand nach dem letzten Waschen mit einer Pipette.
  14. Verwenden Sie eine breite Bohrung 20-200 ul Pipettenspitze auf einen Objektträger erarbeiten 5 ul des gefärbten Hirn Lysat und Ort. Montieren Sie die Objektträger mit einem 25 x 25 mm Deckglas, um eine Nasspräparat des Gehirns Lysat erstellen. Stellen Sie 3 Wiederholungs Folien mit 5 ul der Gehirn Lysat jeder.
  15. Die Anzahl der Zysten pro jeweils 5 ul Aliquot durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines 10X-Objektivs (Abbildung 6).
    HINWEIS: Einige Zysten sind groß (8 oder mehr Parasiten ungefähr), während einige sind sehr klein (1-2 Parasiten pro Zyste). Count Anzahl der Zysten pro jeder Folie, aber die Nummer des Dokuments gegenüber großen Anzahl von kleinen Zysten.
  16. Fügen Sie die Anzahl der Zysten detreflektierten in den drei unterschiedlichen 5 ul Aliquots und multiplizieren mit der Gesamtverdünnungsfaktor x 2 (nur die Hälfte des Gehirns wurde in einem Lysat hergestellt), um die Gesamtzahl der Zysten pro Gehirn abzuschätzen.

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Representative Results

Toxoplasma gondii repliziert frei in naiven Makrophagen und weist eine Verdopplungszeit von 6-12 h in Abhängigkeit von der Belastung des Parasiten. Abbildung 1 zeigt repräsentative Parasiten in naiven Vergleich aktiviert Knochenmark stammenden Makrophagen. Abbildung 2 zeigt die allgemeine Morphologie des Parasiten in HFF Wirtszellen, die nach 2, 4, 8, 16 und 32 Parasiten / PV. In der gegenwärtigen Protokoll wird der Parasit darf naiv Makrophagen eindringen und stellen Sie eine im Entstehen begriffene parasitophoren Vakuole (PV) vor der Lieferung eines starken Aktivierungsstimulus, LPS und IFN, auf die infizierten Makrophagen. In diesem Modell wird die Replikation von Wildtyp-Parasiten verlangsamt, aber Parasiten Replikation noch läuft etwa 24 Stunden, während welcher Zeit die Makrophagen werden bei der Hemmung der Parasitenreplikation zunehmend geschickt. Der Bildschirm ist so konzipiert, als eine modifizierte Wettbewerbsmodell zwischen der Zeit für starke Makrophagen eine geforderte Funktionctivation gegen die Zeit, während der die Wildtyp-Parasiten oder Parasiten Mutante kann weiterhin innerhalb seiner PV replizieren. Der erste Schritt bei dem Schirm ist, um eine Dosis von LPS zu wählen und IFN- γ zur Aktivierung von infizierten Makrophagen verwendet werden. Die Dosis wird empirisch durch Auswertung Parasiten Replikation in Makrophagen, die mit entweder einer konstanten Dosis von IFN γ in Kombination mit einem Bereich von LPS-Konzentrationen oder einer konstanten Dosis von LPS mit einer Reihe von IFN-Konzentrationen (Schritt 1) ​​aktivierten bestimmt. Die Dosis der Aktivierungsreize muss für die elterlichen Wildtyp-Parasiten für die Erstellung der Parasit Mutanten durch chemische oder Insertionsmutagenese verwendet ausgewertet werden. Idealerweise wird die Dosis von LPS und IFN γ wird Parasiten Replikation auf durchschnittlich 2-8 Parasiten pro PV 24-30 h nach der Aktivierung im Vergleich zu 8-16 Parasiten pro PV in naiven Makrophagen erlauben (1 und 2).

Sobald die geeignete Konzentration von LPS und IFN- ^7; bestimmt ist, werden die Mutanten in 96-Well optischen Boden-Gewebekulturplatten gescreent. Optisches unten in den Platten ist wichtig, weil Unregelmßigkeiten in der Kunststoff, der für herkömmliche Gewebekulturplatten verwendet wird, macht es schwierig, die entsprechende Auflösung zu erreichen, um die Parasiten durch Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie zu screenen. Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie der 96-Well-Platten verlangt auch einen invertierten Fluoreszenzmikroskop mit Phasenkontrast-4, 10, 20 oder 40x, für lange Distanzen ausgestattet. Mutanten sind in Replikatplatten enthaltend Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen gescreent. Nach Provokation mit Parasiten Mutanten werden infizierte Makrophagen in den Vertiefungen einer Platte, die mit LPS und IFN-γ aktiviert wird, während die andere Platte mit infizierten Makrophagen ist in nur D10 Medien kultiviert. Die Platten werden bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24-30 Stunden nach der Zugabe von LPS und IFN γ inkubiert. Nach der Inkubation sind die Zellen fifeste, nach Parasiten gefärbt und durch IFA sowohl mit Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie analysiert. Mutanten werden ausgewählt, die normalen Parasitenzahlen und Replikation in Makrophagen naiv, aber weniger Parasiten oder kleiner Vakuolen mit weniger Parasiten in infizierten Makrophagen, die aktiviert werden müssen. Sobald Mutanten werden ausgewählt gibt man sie in Kammer-Objektträgern (Schritt 3) in naiv in zwei unabhängigen Experimenten erneut zu kontrollieren und aktivierten Makrophagen auf die Analyse von Parasiten Morphologie mit einer höheren Vergrößerung (100X Objektiv und Öl) zu aktivieren und um zu bestätigen, dass sie die normale Replikation in naiv Makrophagen haben aber ein Fehler in der Replikation / Überleben nach Makrophagenaktivierung.

Die Phänotypen der Mutanten mit Defekten im Widerstand gegen die Aktivierung der infizierten Makrophagen fallen typischerweise in zwei breite Kategorien: Parasiten, die morphologisch intakt erscheinen, sind aber nicht in der Lage, über eine einzelne Parasiten pro PV replizieren; und Parasiten, die scheinen Degrad werdened und kann auch in amorpher geräumige PVs (Abbildungen 1 und 3). Die Morphologie und Ultrastruktur des Parasiten und PV wird am besten auf Objektträger mit einem 100X Objektiv und Öl und durch Phasenkontrastmikroskopie in Kombination mit Fluoreszenzanalyse angesehen. Anfärbung der Parasiten für IFA mit einem Antikörper gegen lysosomale assoziiertes Membranprotein-1 (LAMP1) ist nützlich, um zu bestimmen, ob der Fehler in der Mutante mit der Unfähigkeit des PV die Fusion mit Lysosomen verhindern verbunden. In Abbildung 4 ist ein Parasit in einem Phagolysosom (LAMP1 positiv) im Vergleich zu einem Parasiten, der in einer PV ist, die weitgehend getrennt von der endozytischen System der Wirtszelle (LAMP1 negativ) ist. Die Phagolysosom ist durch eine kontinuierliche feste Rand LAMP1 belasten um die gesamte Parasiten evident. Im Gegensatz dazu hat ein PV oft Lysosom Organellen in der Nähe, aber keine durchgehende Rand LAMP1 Färbung um seinen Umfang. Die Verwendung von Antikörpern gegen definierte Strukturen / Organellen innerhalb ter Parasiten und / oder PV sind nützlich bei Follow-up-Studien IFA mit dem Diskontinuitäten in jeder Mutante mit der Aktivierung der infizierten Makrophagen zu identifizieren. Solche Verhöre mit Antikörper können Einblick in die Mechanismen, die die Replikation / Überleben Defekt in einem mutierten zugrunde liegen werden. Zum Beispiel 5 zeigt die T. gondii Mitochondrium mit dem monoklonalen Antikörper 5F4 anti-F1-ATPase beta-Untereinheit (eine Art Geschenk von Peter Bradley) 24 h nach der Aktivierung von Makrophagen mit Wildtyp-Parasiten oder Parasiten Mutanten infiziert gefärbt. T. gondii wurde mit einem monoklonalen Anti-T. co-gefärbt gondii-Antikörpers. Wildtyp T. gondii einen einzigen Mitochondrium, das um den Umfang des Parasiten erstreckt. Des Parasiten einzige Mitochondrium in Wildtyp-Parasiten nach der Aktivierung von infizierten Makrophagen intakt war im Vergleich zu einem fragmentierten Mitochondrium in der Mutante Parasiten. Mitochondrien Fragmentierung war nicht nur im eingeschränkten / amorphen deutlichParasiten, sondern auch in Parasiten, die normale Morphologie angezeigt, wie durch Phasenkontrastmikroskopie untersucht. Dies deutet darauf hin, dass der Defekt in der Parasiten-Mutante kann die Anfälligkeit des Parasiten Mitochondrium zu erhöhen, um Zellmediatoren durch Makrophagenaktivierung induzierte hosten.

Das aktuelle Modell verwendet eine Kombination von IFN γ und LPS auf infizierte Makrophagen zu aktivieren. IFN γ stimuliert den Transkriptionsfaktor STAT1. LPS, wie TNF-α, regt den Transkriptionsfaktor NF-KB. Bekannte IFN-γ abhängige antimikrobielle Mediatoren in der Zelle autonome Immunität gegen T. wichtig gondii umfassen eine Anordnung von IFN γ abhängige Immunität GTPasen (IRGs, Gbps) und reaktive Stickstoff- und Sauerstoffspezies zusätzlich zu anderen Mitteln. Um zu bestimmen, ob der Fehler in jeder Mutante wurde speziell mit der Herstellung von bekannten IFN- γ -induzierbaren antimikrobielle Mediatoren zugeordnet sind, Knochenmark-Makrophagen isoliert ausiNOS - / -, gp 91 phox - / - oder spezifische IRG / GBP-Gen gelöscht Mäusen und auf Aktivität gegen die Mutanten-Parasiten untersucht. Die Kombination von IFN γ und LPS auf infizierten Makrophagen aktivieren bevorzugt führt Mutanten mit erhöhter Anfälligkeit für Stickstoffmonoxid im Vergleich zum Wildtyp-Parasiten 28.

Die Aktivierung von infizierten Makrophagen können Phase Differenzierung der Parasiten aus Tachyzoiten zu Bradyzoiten, die in Gewebezysten enthalten sind, zu induzieren. Solche Zysten sind charakteristisch für chronische Infektion. So kann Parasiten Mutanten, die nach der Aktivierung von infizierten Makrophagen für die Replikation / Überleben defekt sind auch für die Umstellung auf Zysten während in vivo Infektions defekt. Um Zyste Produktion während einer chronischen Infektion zu evaluieren, werden die Mäuse intraperitoneal (ip) mit einer nicht-tödliche Dosis des Elternparasitenstamm oder dem mutierten Klon herausgefordert. Zysten im Gehirn in der Größe von weniger als 10 _. 6; m im Durchmesser um mehr als 50 um, wie in Abbildung 6 gezeigt, Die Anzahl der großen und kleinen Zysten durch IFA aber halten die Grafen zu trennen, um zu bestimmen, ob der Parasit Mutante ist für insgesamt Zyste Produktion oder einfach nur zum Aufbau beeinträchtigt und Wartung von großen Zysten.

Figur 1
Abbildung 1. Naive murinen Knochenmark-abgeleitete Makrophagen permissiv für die Replikation von T. gondii aber Aktivierung mit IFN-γ und LPS deutlich hemmt die Replikation. (A) A parasitophoren Vakuole (PV) von Wildtyp T. gondii 24 h nach der Invasion der naiven murinen Knochenmark-Makrophagen. (B) A PV von Wildtyp T. gondii Parasiten aus vier Parasiten pro Vakuole 24 h nach der Aktivierung der infizierten Makrophagen.(C) Ein Beispiel für eine Mutante Parasit unfähig zu replizieren und weiterhin an einem Parasiten / PV 24 h nach der Aktivierung der infizierten Makrophagen. (D) Ein Beispiel für eine Mutante Parasiten, die innerhalb einer amorphen PV 24 h nach der Aktivierung der infizierten Makrophagen abgebaut erscheint . Die obere Reihe zeigt Phasenbilder der Parasiten und die untere Reihe zeigt Fluoreszenzbilder unter Verwendung eines polyklonalen Antiserum gegen T. gondii. Der Maßstab entspricht 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Parasite Replikation durch die Anzahl der Parasiten pro PV ausgewertet. Die Bilder zeigen 2, 4, 8, 16 und 32 Parasiten pro PV in HFF-Zellen. Jedes Bild ist eine zusammengeführte Phasenbild thbei zeigt polyklonalen Antikörperfärbung des Parasiten in den roten und der HFF Kern in blau (DAPI). Der Maßstab entspricht 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Mutanten eine Reihe von Phänotypen nach Aktivierung der infizierten Makrophagen. Die Spalte auf der linken Seite ist ein Phasenbild der Parasiten in den Makrophagen, ist die Mittelsäule ein fluoreszierendes Bild unter Verwendung eines Antikörpers gegen T. gondii, und die rechte Spalte ist eine Zusammenführung der Phase und der Fluoreszenzbild. Der Parasit ist in grün und die Makrophagen Zellkern blau dargestellt. Der Maßstab entspricht 5 um. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur.

4
Abbildung 4. LAMP1 Färbung unterscheidet PVs aus phagolysomes haltigen Parasiten. Parasiten werden mit einem polyklonalen Anti-T. gefärbt gondii Antikörper (rot) und LAMP1 mit dem mAb 1D4B (grün). Ein Pfeil markiert einen Parasiten PV, die mit Lysosomen fusioniert hat. Der Parasit ohne Pfeil ist in einer parasitophoren Vakuole (PV), die nicht mit Lysosomen fusioniert hat. Der Maßstab entspricht 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Wildtyp-Parasiten halten eine intakte Mitochondrien während der mitochondriauf in Parasiten-Mutanten nach der Aktivierung von infizierten Makrophagen abgebaut. Mitochondrium (grün) in Wildtyp-Parasiten (oben) im Vergleich zu drei verschiedenen mutierten T. gondii Parasiten in verschiedenen Stadien der Abbau (unten drei Felder) 24 Stunden nach der Aktivierung der infizierten Makrophagen. Der Maßstab entspricht 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 6
Abbildung 6. Erkennung von Parasiten Zysten im Gehirn mit FITC-konjugiertem Lektin Dolichos biflorus. Die Zystenwand mit dem Lektin gekennzeichnet ist grün dargestellt. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere versio anzeigenn dieser Figur.

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Discussion

Die beschriebenen Protokoll stellt eine nicht voreingenommen Ansatz, der die Aktivierung von Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen und zukunfts Genetik T. isolieren verwendet gondii-Mutanten mit Defekt in der Fähigkeit, die Aktivierung von infizierten Makrophagen zu überleben. Der Phänotyp der Mutanten nach Makrophagenaktivierung fällt in der Regel in eine von zwei Kategorien: 1) Die Parasiten scheinen intakt, aber nicht über den 1. Parasiten pro PV replizieren; 2) Die Parasiten erscheinen abgebaut und können in geräumigen, amorphe PV ist. Die Tatsache, dass die Mutanten einen Phänotyp wie Wildtyp-Parasiten in naiven Makrophagen in Abwesenheit der Aktivierung zeigt das Protokoll spezifisch verwendet, um Mutanten, die spezifisch in ihrer Fähigkeit zur Aktivierung von Makrophagen Resist beeinträchtigt identifizieren. Die Verwendung von primären Knochenmark-Makrophagen ist gegenüber dem RAW 264.7 Makrophagen-Zelllinie für den Bildschirm zu empfehlen, da die Morphologie der Parasiten und Parasitenzahl pro vacuole sind leichter in Knochenmark stammenden Makrophagen sichtbar.

Die beschriebene Bildschirm kombiniert mit zukunfts Genetik bietet eine vielseitiges Werkzeug, um Parasiten Gene und letztlich genetischen Pfade wichtig für die Resistenz gegen spezifische Mediatoren der Zell autonome Immunität zu sezieren. Solche zukunfts Genetik Studien sind wichtig, um Parasiten Gene, die wie eine Kette entwirren Parasiten Wege wichtig für den Widerstand gegen spezifische antimikrobielle Mediatoren sowohl in vitro als auch während der Pathogenese zu beginnen, gefolgt werden kann zu identifizieren. Eine frühere Schwierigkeiten mit zukunfts genetische Ansätze war die Identifizierung des Schlüsselgens in jeder Mutante gestört. Cosmidbank Komplementierung in T. gondii ist sehr effektiv für die funktionale Ergänzung der Zellteilung Mutanten gewesen. Die Tatsache jedoch, dass die Replikation von Wildtyp-Parasiten werden ebenfalls von IFN-γ und LPS nur in einem geringeren Ausmaß als die Mutanten unterdrückt, macht funktionelle Komplementation schwieriger Than für die Zellteilung Mutanten. Gesamtgenom Mutationsprofiling für sowohl chemische als auch Insertionsmutanten in T. gondii hat vor kurzem aufgetaucht als produktive und sogar kosteneffektiv, avenue, um die für die Phänotypen der Mutanten in Vorwärtsgenetik Bildschirme 34,36,37,44 verantwortlichen Gene zu identifizieren. Folglich wurde gesamten Genoms Mutationsprofilerstellung mithilfe von Next Generation Sequencing das Nutzungspotential der chemischen Mutagenese von T. verbessert gondii in zukunfts genetische Studien, um Gene wichtig für bestimmte Funktionen zu identifizieren. Wie in der beschriebenen Protokoll eine Vorwärts Genetik Ansatz sind wichtig, da die meisten von dem Genom von T. gondii bleibt hypothetisch mit einer Mehrzahl von vorhergesagten Gene, die keine Homologie zu anderen Genen oder funktionelle Domänen, die bei der Identifizierung von Kandidatenparasitengene wichtig Immunevasion unterstützen könnten.

IFA-Analyse von 96-Well-Platten ist im allgemeinen nicht als ein Hochdurchsatz-Screening erfüllthod. Nach unserer Erfahrung ist es sinnvoll für eine Person zu färben und Bildschirm 10 Platten mit 96 Vertiefungen in einem Tag oder etwa 960 Mutanten. In dem Artikel von Skariah et al., Wurden rund 8.000 Mutanten analysiert und 14 unabhängige Mutanten wurden isoliert, die wesentlich für das Überleben / Replikation aktiviert, aber nicht naiv Makrophagen 28 beeinträchtigt wurden. Die beeinträchtigte Überleben der Mutanten war vorwiegend die Folge einer erhöhten Anfälligkeit für Stickstoffmonoxid. Die Begrenzung der Gesamtverfahren ist in erster Linie auf der Ebene der Einzelklone Erhalt des Parasiten anstatt Screening durch Mikroskopie als der Anfangsbildschirm in 96-Well-Platten ist qualitativ und angemessen schnell ist. Bestätigung der Phänotyp der Mutanten in dem Bildschirm des 96-Loch-Platte identifiziert wird in Schritt 3 durch quantitative und qualitative Analyse mit Makrophagen in Kammer-Objektträgern und durch Zugabe einer gleichen Anzahl von Wildtyp oder Mutante Parasiten gefolgt. Die Verwendung von anderen analytischen Screeningverfahrenwie Fluorometrie an der Gesamtbevölkerung Niveau Parasiten, anstatt die einzelnen Parasiten Niveau wie durch Mikroskopie untersucht, sind problematisch im aktuellen Protokoll wie viele der abgebauten Parasiten Fleck mit dem polyklonalen Antikörper gegen T. gondii als robuster als Wildtyp-Parasiten mit dem Unterschied in der Mutante als mehr qualitative als quantitative auf der Ebene der Fluoreszenzintensität. Auch die Dosis von IFN-γ und LPS erforderlich ist, um Mutanten mit einem Defekt im Widerstand gegen die Aktivierung der infizierten Makrophagen führt drückt Replikation von Wildtyp-Parasiten wenn auch zu späteren Zeitpunkten isoliert werden. Daher ist die Messung der Gesamtparasitenzahl für den Vorwärts Genetik Bildschirm einschließlich der Verwendung von lumineszierenden Parasiten problematisch. Jedoch ist es möglich, das Färbeprotokoll könnte im Screeningschritt eliminiert werden, wenn die Eltern Parasiten Klone für chemische oder Insertionsmutagenese verwendet exprimiert konstitutiv oder induzierbar fluoreszierenden oder Luciferase-Marker. Das beschriebene Protokoll mit IFA und Mikroskopie Screening von Makrophagen in Platten mit 96 Vertiefungen können für die Isolierung von Mutanten, die in aktivierten Makrophagen zu überleben / replikationsdefektive aber auch deutlich einige potentielle Mutanten aufgrund der begrenzten mikroskopische erreichbare Auflösung unter Verwendung des 96-Well-Platte-Format als verfehlt bei dieser Auflösung amorphen geschwollene Vakuolen, die für Parasitenantigen beflecken könnten für das gesunde replizieren Parasiten innerhalb eines normalen PV ist. Substitution von 96 Behälterabdeckung Glasplatten anstelle von 96-Well-Platten mit einer optischen Oberfläche, wahrscheinlich eine höhere Auflösung bei dem Bildschirm der infizierten Makrophagen in 96-Well-Platten zu erzielen.

Die überwiegende Mehrheit der identifizierten mit IFN-γ und LPS in dem beschriebenen Protokoll zu Makrophagen folgenden Parasiteninvasion aktivieren Mutanten haben einen Mangel in ihrer Fähigkeit, sich gegen Stickstoffoxid 28 zu schützen. In dieser Hinsicht ist der Bildschirm, obwohl beabsichtigt nicht-vorgespannt ist,kann zur Isolierung von Parasiten Mutanten mit einer erhöhten Anfälligkeit für bestimmte antimikrobielle Mediatoren, abhängig von den Aktivierungsbedingungen, der Art und Spezies von Makrophagen und dem Zeitpunkt der Parasitenbefall, bezogen auf die Makrophagenaktivierung, die für den Bildschirm gewählt reichern. Somit ist die für den Bildschirm und die Aktivierungsstimuli angelegt gewählt angeborenen Immunzelle sind kritische Parameter, die die Art des antimikrobiellen Mediatoren, zu denen die resultierenden Mutanten sind Parasiten anfälligen schlagzäh. Der Genotyp des Parasiten ist auch ein kritischer Parameter, als Typ I-Genotypen des Parasiten sind relativ resistent gegen Immunität GTPasen (IRGs) in Reaktion induziert IFN-γ, während die Typ II und III Genotypen sind anfälliger 26,45,46. In dem beschriebenen Protokoll werden Makrophagen nach Parasitenbefall aktiviert. Obwohl der Typ-II-Genotyp ist Prugnaud Stamm, in der beschriebenen Bildschirm verwendet anfällig für die Wirkung der Immunität GTPasen einllowing der Parasit an Makrophagen eindringen können erste Replikation von Wildtyp-Parasiten vor vollständiger Induktion der IRGs. Auch ist es nicht klar, dass IRGs wirksam gegen Parasiten, wenn sie in den Makrophagen im Anschluß an Invasion und Initiation der Replikation Parasiten induziert sind.

Das beschriebene Protokoll verwendet Makrophagen Parasiten wichtige Gene für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Mediatoren der Zell autonome Immunität, insbesondere Stickstoffmonoxid identifizieren. Die Isolierung von einem Pool von Parasiten Mutanten, die eine deutliche Anfälligkeit für Stickstoffmonoxid sowie einen gemeinsamen Phänotyp von Stickstoffmonoxid-abhängige mitochondriale Fragmentierung Aktie bietet eine einzigartige Reihe von Tools, um Parasiten Gene und Signalwege wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffmonoxid und um Verständnis zu identifizieren die Wirkung von Stickstoffmonoxid breiter gegen T. gondii und anderen eukaryotischen pathogens.The beschriebenen Protokoll mit geringfügigen Änderungen kann für Vorwärtsgenetik studie verwendet werdens, um Parasiten Gene wichtig für die Resistenz gegen verschiedene Mediatoren der Zell autonome Immunität zu identifizieren. Potentielle Modifikationen umfassen die Änderung der Art der Wirtszelle infiziert, die Aktivierungsstimuli oder das Timing der Aktivierung relativ zu Invasion Parasit. Zum Beispiel würde eine Voraktivierung von murinen Makrophagen mit IFN-γ vor der Zugabe von Parasiten bei Aktivierung der Immunität GTPasen führen. Ein solches Modell könnte verwendet werden, um Parasiten Gene in Typ identifizieren I Genotypen von T. gondii, der dem Widerstand von ROP18 und ROP5 um Immunität GTPasen 24,25 vermittelte beitragen können. Mediatoren der Zell autonome Immunität gegen T. gondii in menschliche Zellen des angeborenen Immunsystems sind nicht so gut wie bei Nagetieren definiert. Somit ist die Verwendung von menschlichen peripheren Blutmonozyten, um chemische Mutanten screenen T. gondii könnten beide Parasiten Gene wichtig für das Überleben während der Infektion beim Menschen in der angeborenen Immunzellen sowie Mechanismen beim Menschen fo wichtig zu identifizierenr Antibiotikaresistenz auf T. gondii. Parasite wichtige Gene für die Resistenz gegen spezifische antimikrobielle Mediatoren kann durch Isolierung von Mutanten keine Exposition der infizierten Wirtszellen, pharmakologische Mittel zu überleben, wie reaktive Sauerstoff- oder Stickstoffspezies identifiziert werden. Ähnlich kann das Protokoll modifiziert werden, um Parasiten Mutanten mit einer erhöhten Anfälligkeit zu isolieren, um die Aktivierung 47-49 oder ATP Stimulation der Makrophagen purinerger 50 Inflammasoms.

Zusammengenommen mit zukunfts Genetik und angeborenen Immunzellen, um Parasiten Mutanten wichtig für T. isolieren die Protokolle beschreiben einen Ansatz gondii Beständigkeit gegen IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität. Wichtig ist, legte der Ansatz her ist vielseitig und kann leicht geändert werden, um Parasiten Gene wichtig für die Umgehung spezifische antimikrobielle Mediatoren, das Überleben der Parasiten in bestimmte Arten von Wirtszellen oder Resistenz gegenüber Bedingungen encounte betonen isolierenrot bei Toxoplasmose. Ferner kann Parasiten wichtige Gene zu widerWirtsZellAktivierung in vielen Fällen auch eine Rolle direkt oder indirekt in der Zysten Produktion in vivo während der Infektion.

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Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
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Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

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References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

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Immunologie Heft 97, Makrophagen angeborenen Immunität intrazelluläre Erreger Immunevasion Infektionskrankheiten vorn Genetik Parasiten
Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität
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Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B.,… More

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

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