Abstract
利用底栖动物组合快速生物协议已被成功地用于评估对水质影响的人。不幸的是，传统的底栖幼虫抽样方法，如浸渍网，可以是费时和昂贵的。另一种方案包括收集的摇蚊表面浮蛹蜕（SFPE）。摇蚊是蝇（双翅目），其不成熟的阶段，通常发生在水生境的物种丰富的家庭。摇蚊成虫从水中冒出，离开他们的蛹皮或蜕皮，浮于水面。蜕经常沿着积累银行或障碍物后面由风或水流，在那里他们可以收集，评估摇蚊的多样性和丰富性的作用。摇蚊可作为重要的生物学指标，因为一些物种更耐受污染比其他。因此，收集SFPE的相对丰度和物种组成反映水质变化。这里，与现场收集，实验室加工，滑动安装，并鉴定摇蚊SFPE的相关联的方法进行详细说明。该SFPE方法的优点包括最小干扰以采样区，有效和经济的样品采集和实验室处理，便于识别，适用性在几乎所有的水生环境和生态系统压力的一个潜在的更敏感量度。这些限制包括无法确定幼虫微生境使用，无法确定蛹蜕物种，如果他们没有得到与成年男性有关。
Introduction
生物监测方案，它使用活的生物体来评估环境健康，经常被用来评价水质或监测生态系统恢复计划的成功。自1989年1快速生物的协议（RBP）利用大型底栖无脊椎动物组合已经国家水资源管理机构的欢迎。传统的抽样大型底栖动物的限制性商业惯例的方法，如畅游网，Surber取样和采样赫斯2，可时间耗时，昂贵，并可能只从一个特定的微生3测量组合。生成有关特定水体的生物信息的有效，替代RBP涉及收集摇蚊表面浮蛹蜕（SFPE）3。
该摇蚊科（昆虫纲：双翅目），俗称非蠓，是holometabolous苍蝇正在成为成人之前，通常发生在水环境 60;在水的表面。摇蚊的家庭是物种丰富，全球约有描述5000种;然而，多达20000物种估计存在4。摇蚊是在记录水与居住环境的质量，因为其高度多样性和可变污染公差等级5许多水生生态系统中非常有用。此外，他们往往在水生系统中最丰富和广泛的大型底栖动物，一般占50％以上的品种，在社会5,6。继陆地成人出现，蛹蜕（投蛹皮）仍浮在水面（ 图1）。蛹蜕皮积累沿银行或后面的障碍物通过风或水流的作用，可以很容易和快速地收集，得到与上24-48小时7中已经出现摇蚊物种的综合样本。
ntent“>的相对丰度，并收集SFPE的分类构成反映水质，考虑到一些种类非常宽容的污染，有的则是相当敏感的5 SFPE方法比传统的摇蚊幼虫的采样技术许多优点，包括：（1）最小，如果有的话，生境破坏发生在取样面积;（2）样本不注重收集活的生物体，而是无生命的肌肤，让社会动态的轨迹不会受到影响;（3）鉴定属，和常的物种，是比较容易得到适当的密钥和描述3;（4）收集，处理，以及确定用样品是有效和经济相比传统采样方法3,8,9;（5）累计蜕皮表示源自类群广泛微生境10;（6）该方法在几乎所有的水生环境是适用的，包括溪流和河流，河口，湖泊ES，池塘，岩石池和湿地;和（7）SFPE说不定是生态系统健康更敏感的指标，因为它们代表了已完成所有的未成熟阶段并成功成为大人11个人。该SFPE方法不收集有关摇蚊社区信息的新途径。利用SFPE首次由蒂内曼12在20世纪初提出。各种研究已经使用了SFPE分类调查（ 如，13-15），生物多样性和生态研究（ 如 7,16-19），以及生物评估（ 如，20-22）。此外，一些研究已经解决了样本设计，样本大小，和所需的用于实现种或属（ 例如，8,9,23）的各种检测水平样本的事件数的不同方面。这些研究表明，种或属的相对高百分比可以与中等避免费劲地检测T或与费用来样加工有关。例如，安德森和Ferrington 8确定，基于100计数子样本， 第三届 1/3更少的时间被要求挑选相比，浸净样品SFPE样本。另一项研究确定了3-4 SFPE样品可以进行排序，并确定了每一个浸净样品，并且样品SFPE比浸净样品更有效的检测，在物种的物种丰富度增加了3。例如，在站点物种丰富度15-16种值，平均倾斜度，净效率为45.7％，而SFPE样品分别为97.8％，有效率3。
重要的是，SFPE方法已经标准化，在欧洲联盟24（称为摇蚊蛹蜕皮技术（CPET））和北美25生态评估，但该方法尚未被详细描述。所述SFPE方法的一个应用是通过Ferrington， 等人描述。
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Protocol
1.准备的现场采集耗材
- 确定应基于该研究设计来收集，并获得一个样品罐（ 例如，60ml）中的每个样品SFPE样本的数目。
- 准备两个日期和位置标签每个样品罐。将一个在里面，并加盖对方的罐子外面。确保每个日期和地点标签包括以下信息：国家，州，县，市，水体，GPS坐标，日期和人（S）的名字收集样品。
- 收集其他特殊材料和设备（见表具体材料/设备）。
2.现场采集
- 持有幼虫盘，一手在其他筛子。浸幼虫托盘放入水中，其中SFPE积聚（ 如，泡沫积累，断枝，紧急植被，杂物，背漩涡，并沿边缘的银行）（ 图2A），允许笏呃，蜕皮和杂物进入幼虫托盘，通过筛倒出这种材料。如果取样在激流系统，开始在样品到达下游端和上游工作（ 图2B）。如果取样在静水系统，开始在顺风海岸线。
- 10分钟重复步骤2.1（或作为另外定义为一个特定的抽样制度）内的每个预先确定样品到达（通常100-200米从流收集的样本，但依赖于水生监测点的总面积）; SFPE聚集区之间移动为宜。
- 集中在碎片用喷瓶灌满水从采样点的筛子的一个区域，并仔细转移SFPE样本预先标记的样品罐钳的帮助和乙醇的喷瓶流。填充用乙醇样品罐。
- 重复步骤2.1至2.2的所有样品。
3.样品采摘
注意：此协议的其余部分涉及一个300 SFPE子样本，并可能需要进行修改，对于其他子样本大小。见查德和Ferrington的二次抽样9采样频率为准则SFPE剪裁方法，以满足特定的研究目标和资源。
- 分配的1打兰小瓶每个SFPE样品;准备一个日期和地点标签将每个瓶中并填补小瓶¾充满乙醇。
- 从相应的样本罐子取下盖子，检查连接蛹蜕皮。轻轻冲洗掉盖子上的内容用喷瓶充满乙醇的培养皿。找到并使用镊子从样品罐中拆掉标签，轻轻冲洗掉标签的内容到培养皿。抛开标签。
- 转移样品罐的内容到一个幼虫托盘，用乙醇漂洗，以确保没有SFPE留在样品罐。转让蛹蜕，住宅建设的一部分因，和乙醇从托盘到培养皿。确保该样品是覆盖在乙醇。
- 将立体显微镜下培养皿。系统地扫描培养皿蛹蜕皮的内容。挑选使用镊子，并放入小瓶菜都蛹蜕皮。不要挑标本被破坏（ 即不具有至少一半的头胸部和腹部），干燥，或压缩，以避免以后的识别问题。
注：鉴定物种往往需要将整个样品存在时，虽然在某些情况下，属级鉴定可能与局部标本。- 漩涡菜和扫描附加蛹蜕皮，包括任何可能被粘在培养皿的两侧，以及，任何小和半透明标本可能没有被最初检测到。重复，直到连续两次扫描显示没有额外的蛹蜕皮。
- 重复步骤3.3和3.4，直到所有或300蛹蜕都被接走。当300蛹蜕皮已经拾取，从培养皿返回残余物，幼虫托盘和冲洗培养皿用乙醇。然后，从幼虫托盘传送残渣到空样品瓶，加入的时间和位置的标签，并把盖子上的罐子。保留或根据具体项目的协议处理残留物。
4.样品排序
- 倾所有拾取蛹蜕皮从标记小瓶到培养皿填充有足够的乙醇以刚好覆盖试样。
- 下一个立体显微镜，标本分离成不同形态组（ 即 morphotaxa），并把每个morphotaxon成单独标记的小瓶充满3/4 个充满乙醇。
- 利用外部形态特征分开摇蚊morphotaxa。例如，从该头胸部，使用在存在，大小，形状的差异，并着色头侧瘤，疣正面，正面刚毛，和胸角。从腹部，用刺，hookrows，鲨鱼皮，刚毛，杂散腹段，除了肛门裂片为morphotaxa分离（ 图4A）。见Ferrington 等人 5，•塞特26，平德和赖斯27为附加描述和形态特征的数字。
- 使用额外的乙醇，如果标本开始变干。
5.将安装
- 填充多孔板的一个孔中的每个morphotaxon用95％的乙醇。
- 放置多个表示（ 例如，总的25％）被滑动安装到板的各个孔中的每个morphotaxon的。允许标本坐在井为至少10分钟，进行脱水充分。
- 标签幻灯片合适的站点，收集和鉴定informati上（ 图3）。
- 在立体显微镜载玻片的地方。
注：贴在舞台上滑动的模板是一致的布局非常有用。 - 将Euparal的幻灯片上的一滴;传播Euparal使其近似于盖玻片的大小。与Euparal时，请使用适当的通风。
注：与Euparal时，请使用适当的通风。 - 从嵌入使用镊子第一morphotaxon到Euparal的代表。
注：要过多的无效乙醇的标本，使用镊子，轻轻拍打标本实验室湿巾先于Euparal嵌入它。 - 分开用细尖镊子和/或夹层探头（ 图4A）腹部的头胸部。
- 拆分沿ecdysial缝合（ 图4B）的头胸部并打开头胸部使得缝合边缘上相对的侧面（ 图4C）。
- 东方的Cephalothorax使得腹侧朝上（ 图4C）。
- UP位置腹部背侧;放置紧接头胸部（ 图4C）以下。
- 放置在试样上盖玻片。持盖玻片一角度，与一个边缘接触滑动，然后慢慢降低其拖放盖玻片，以减少空气泡的形成。轻轻地按一下盖玻片压平标本。
- 重复步骤5.3至5.7的所有脱水标本。
6.鉴定属
- 确定的使用复合显微镜载玻片上的标本的属。确定试样使用按键和诊断中Wiederholm 28和Ferrington 等菌属。5。如果需要，使用Ferrington， 等确认家庭级鉴定。5。注：有，因为Wiederholm 28 Ferrington众多的一般描述和修订，等 5，因此，这些键和诊断是不完整的，并需要与主文献加以补充。
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Representative Results
图1示出的摇蚊生命周期;不成熟的阶段（卵，幼虫，蛹）通常发生在，或与水环境密切相关。当幼虫生命阶段完成后，幼虫构建了一个筒状的住房和丝质分泌物附着于周围的基底和化蛹发生。一旦显影成人已经成熟，蛹释放本身和游到水中，其中成人可以从蛹蜕皮出现的表面上。的蜕皮充满空气，并凭借角质层的外蜡质层的，但它仍然漂浮在水面上，直到细菌开始分解蜡层。
水流或风精矿浮动蛹蜕成积累，等领域，其中河岸植被或倒下的树木使与水接触的表面， 图2A所示。幼体盘和筛可用于收集蛹＆＃160;从这些天然积累区和从微生广谱评价摇蚊的出现， 如图2B所示 。对于某些应用，它收集样品以一致的，标准化的方式，使比较可以在给定的采样点进行间几个样点或以上的时间是很重要的。十分钟收集期间已经显示出提供了摇蚊相对丰3,25充分的评价。例如，Ferrington 等人 3审查了物种摇riparius出苗估计和发现估计没有显着变化后12盘倾角进行了分析。步行10分钟收集期，很多超过12逢低通常获得，因此，我们有信心，在一个样本达到大多数物种丰富将在这一时间进行检测。3
一旦SFPE样本已收集，采摘，并分类，SPecimens是滑动安装的属或种鉴定和创作凭证标本。标签与合适的站点，收集和识别信息的幻灯片建议， 如图3。一般情况下，地方的标签显示了有关国家，州，水体，GPS坐标，学习网站的ID，收集日期和名称信息人所收集的样品。此外，该标签将具有为每个载玻片上的标本的唯一幻灯片编号。识别标签显示属，种（如适用）的识别和鉴定标本的人的名字。
蛹蜕需要正确解剖为导向鉴定属和凭证标本的准备。 图4A显示了正确的背侧蛹蜕放置在幻灯片上。在放置到幻灯片，标本可能最初不说谎背侧，因为他们是CYLINDrical在形状和经常充满乙醇和气泡。因此，使用镊子或解剖探头轻微挤压腹部进Euparal走向滑动建议。压缩应定向试样背面观和排出大部分乙醇和气泡。 图4B表明分离从腹部的头胸部的解剖。在此夹层，它是典型的初学者撕裂所述第一和第二腹节之间的腹部。注意应放置在保持第一腹段与腹部的其余部分。 图4C示出盖玻片定位之前正确解剖和蛹蜕皮的取向。对于某些样品，也可以是难以打开的头胸部使得缝合边缘上相对的两侧和头胸部定向在腹面观。同样，头胸部的轻微背腹压缩来实现这一placemeNT建议。
SFPE集合已成功应用于城市湖泊在明尼苏达州以确定物种的积累（ 图5A）和丰富的属（ 图5B）和累积物种组成以及平均磷浓度梯度/平均深度湖（ 图6）23。基于这些结果，证明了概念的研究已实施长期监测摇蚊的有关气候变化的整个明尼苏达州定点湖（ http://midge.cfans.umn.edu/research/biodiversity/chironomidae -slice-湖泊/ ）。 Rufer和Ferrington 23确定每一季区主要SFPE样品中回收大部分摇蚊社区和检测的重要季节变化城市湖泊（ 图5A，B）。在所有16湖泊，四月样品各色所含NT类群比五月至九月的样本。因此，在北温带地区，采样每个赛季四次推荐，与4月的一个样本，五月至九月间三个样品。然而，对于不同的地理区域和气候，采样制度应当符合该地区最大限度地收集社会各界的部分。
图1.摇蚊的生命周期。有四个生命阶段，卵，幼虫，蛹和成虫，在摇蚊生命周期。成年女性躺在水面上的鸡蛋。鸡蛋沉底，通常在数天孵化一周。离开卵块后，幼虫钻入泥或构建他们生活的小管，饲料，和发展。幼虫变身成蛹，同时仍然在他们的试管。化蛹，蛹积极游到的表面从蛹蜕水和成虫。 请点击此处查看该图的放大版本。
图中的流SFPE积累和场收集技术的区域的2实施例。（A）的 ，其中SFPE将累积日志的上游的一个例子。白色泡沫状物质的有机物的组合，如大型植物和藻类，并可以包含数百至数千蛹蜕皮的。 （ 二）如何收集会用一个筛子和幼虫托盘从流的河岸银行收集SFPE一个例子。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.图中显示的幻灯片的日期和地点标记（左），识别标签（右）和幻灯片的位置安装在盖玻片（中心），蛹蜕。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.一步一步蛹蜕清扫和方向。（A）Undissected蛹蜕（头胸部和腹部有编号的背面观段）。 （ 二）解剖蛹蜕（头胸部和腹部背面观）。 （ 三）解剖和定向蛹蜕（头胸部：VEN二尖瓣视图;腹部：背视图） 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：分类积累曲线从16城市湖泊在明尼苏达州收集的样品SFPE。对于这两个面板，每个彩色线代表16湖泊之一。见Rufer和Ferrington 23的每个湖泊的特征的详细描述。每个数据点代表在2005年的无冰（4月至10月）沿着岸边顺风收集每月10分钟SFPE样本。 A）物种积累曲线SFPE样品。 B）属的积累曲线SFPE样本。 请点击此处查看THI的放大版本。的身影。
图6：横跨湖化学来自多个SFPE样品从16城市湖泊在明尼苏达州的平均epilimnetic磷浓度（微克/升）以上的平均湖泊深度（μm）的函数的梯度检测累积物种。每个数据点代表了16湖泊之一;湖泊从最低排序，以最高平均磷/平均深度。见Rufer和Ferrington 23的每个湖泊的特征的详细描述。遇到随着平均磷浓度比物种的累积数量超过意味着湖泊深度增加。
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Discussion
成功SFPE样品收集，挑选，整理，滑动安装，并识别最关键的步骤是：（1）野外采集（ 图2A）在定位的研究区域内高SFPE聚集区; （2）缓慢地扫描所述培养皿中的样品采摘检测所有SFPE的内容; （3）制定必要的手工灵巧滑动安装（ 图4A）在解剖从腹部的头胸部; （4）承认摇蚊蛹蜕关键形态学特征正确识别到属。
检测的高SFPE积累（ 图2A）的区域是在成功SFPE样品收集的最重要的一步。蛹蜕陷入水生植被或类似船坡道人力结构和波能集中漂浮物进入境外“干草列”30。对于较大的水体，积累的自然区域的识别可能需要定位基于风的模式或使用船只访问地区蛹蜕的积累研究地点。需要与SFPE的足够数量的样品被收集，以检测正在出现的物质的存在并估计个别物种的相对丰度的精确度很高。在样品分选，就必须慢慢扫描培养皿多次较小（3-6毫米长），轻轻着色标本。 SFPE经常粘到藻类，叶，枝，种子和花，因此，可能无法在初始扫描过程中被检测到。此外，该协议需要仔细解剖和滑动安装在腹部属标识（ 图4A）的头胸部。用细尖镊子和/或夹层探头解剖头胸部和腹部首段之间蜕皮。最后，鉴定属可能是困难的新分类学家。以开始识别标本属前研究形态和摇蚊蛹术语的时间。见Wiederholm 28和Ferrington 等人 5为键和摇蚊属的诊断。如果识别技能是一个问题，所有幻灯片或凭证标本的子集可被发送到一个实验室用适当的能力。
基于大多数社区交错成人emergences，多次采样事件通知，并为长期研究，试点项目可确定之前敲定方法最有用的采样时间。即使有多个，季节性针对性的取样事件，社会中所占的比例将不被察觉的，但这些往往是罕见的类群31。对于采样频率的建议，请参阅布沙尔和Ferrington 9流和Rufer和Ferrington 23湖。有关抽样方法主要关注涉及SFPE浮动距离。在流，典型漂移是50-250之间男，而在较大的河流蜕皮可能拉升2公里30。现场证据表明，百分之五十以上的蜕皮不取代的，其中成人20出现下游100多米。因此，如果一个人正在收集SFPE超过从疑似污染源下游500米样品范围，它很可能是大部分收集的标本完成其生命周期中的疑似冲击区25内。在湖泊，池塘和水池，蛹蜕将与表面水流移动，并经常收集大量的水体的下风侧。
虽然具有成本效益的，存在与这种方法相关联的潜在的局限性，其中包括：（1）无法确定由幼虫32小生境; （2）无法评估主要的生命周期事件和龄持续时间之前羽化，由于化性是经常恩挑战，以确定7; （3）较强的季节性变化来检测组合30; （4）对物种掉以轻心chitinized蜕皮，打破了下沉或以更快的速率33偏置; （5）不能够确定标本种类，如果蛹和成年男性以前没有相关的5;和（6）估计的面密度或生物量的难度。
如上所述，蛹蜕是最有用的，具有成本效益的生命阶段中的水生生物监测研究5至包括。未来的研究，以改善SFPE方法包括测试：（1）适当的复制; （2）子样本大小;取决于地方和感兴趣的水体采样事件（3）适当的频率;和（4）下沉和击穿率对于温度，湿度，分解器接种，和机械干扰的各种条件下蜕皮。此外，未来的研究应包括细化的基于分子的鉴定技术，如DNA条码，蛹蜕皮与幼虫和成虫34-35相关联。
在这里，我们所描述的摇蚊SFPE样品采集，实验室处理，滑动安装，并属鉴定细节。该SFPE方法是有效的评估不同，普遍摇蚊社区和可以增加在生物反应研究底栖样改变水质。这具有成本效益，替代RBP提供了几个显着的优点，使得它非常适合于大规模的分析，其中包括在延长的时间周期重复采样事件。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
资金用于撰写和发布本文通过多种赠款和合同昆虫学系的摇蚊研究小组（LC Ferrington，小，PI）在明尼苏达大学提供了依据。 感谢弥敦道罗伯茨分享作为数字照片四野在视频中与此相关的手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25309B | 70-95% |
| Plastic wash bottles | Fisher Scientific | 0340923B | |
| Sample jar | Fisher Scientific | 0333510B | Glass or plastic, 60-mL recommended |
| Testing sieve | Advantech | 120SS12F | 125-micron mesh size |
| Larval tray | BioQuip | 5524 | White |
| Stereo microscope | |||
| Glass shell vials | Fisher Scientific | 0333926B | 1-dram size |
| Plastic dropper | Thermo Scientific | 1371110 | 30 to 35 drops/mL |
| Fine forceps | BioQuip | 4524 | #5 |
| Petri dish | Carolina | 741158 | Glass or plastic |
| Multi-well plate | Thermo Scientific | 144530 | Glass or plastic |
| Glass microslides | Thermo Scientific | 3010002 | 3 x 1 in. |
| Glass cover slips | Thermo Scientific | 12-519-21G | Circular or square |
| Euparal mounting medium | BioQuip | 6372B | |
| Pigma pen | BioQuip | 1154F | Black |
| Probe | BioQuip | 4751 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional™ | 34120 |
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