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Chironomidae (Diptera) का प्रयोग भूतल अस्थायी जल निकायों के लिए एक तेजी Bioassessment प्रोटोकॉल के रूप में पोटा संबंधी Exuviae

doi: 10.3791/52558 Published: July 24, 2015

Abstract

Benthic macroinvertebrate assemblages का उपयोग कर रैपिड bioassessment प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पानी की गुणवत्ता पर मानव प्रभावों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। दुर्भाग्य से, जैसे कि डिप-नेट के रूप में पारंपरिक benthic लार्वा नमूना तरीकों, समय लेने वाली और महंगा हो सकता है। एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल Chironomidae सतह अस्थायी पोटा संबंधी exuviae (SFPE) का संग्रह शामिल है। Chironomidae जिसका अपरिपक्व चरणों में आम तौर पर जलीय निवास में होते मक्खियों (Diptera) की एक प्रजाति अमीर परिवार है। वयस्क chironomids, पानी से उभरने के पानी की सतह पर तैर रही है, उनके पोटा संबंधी खाल, या exuviae जा रही है। Exuviae अक्सर बैंकों के साथ या वे chironomid विविधता और समृद्धि का आकलन करने के लिए एकत्र किया जा सकता है, जहां हवा या पानी के वर्तमान, की कार्रवाई से अवरोधों के पीछे जमा। कुछ प्रजातियों दूसरों की तुलना में प्रदूषण के लिए और अधिक सहिष्णु हैं क्योंकि Chironomids, महत्वपूर्ण जैविक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, एकत्र SFPE के रिश्तेदार बहुतायत और जाति की संरचना को प्रतिबिंबितपानी की गुणवत्ता में परिवर्तन। इधर, क्षेत्र के संग्रह, प्रयोगशाला प्रसंस्करण, स्लाइड, बढ़ते और chironomid SFPE की पहचान के साथ जुड़े तरीकों के बारे में विस्तार से वर्णित हैं। SFPE विधि का लाभ एक नमूना क्षेत्र में कम से कम अशांति, कुशल और किफायती नमूना संग्रह और प्रयोगशाला प्रसंस्करण, पहचान में आसानी, प्रयोज्यता लगभग सभी जलीय वातावरण में, और पारिस्थितिकी तंत्र तनाव का एक संभावित अधिक संवेदनशील उपाय शामिल हैं। सीमाओं वे वयस्क पुरुषों के साथ जुड़े नहीं किया गया है अगर प्रजातियों के लिए पोटा संबंधी exuviae की पहचान करने के लार्वा microhabitat का उपयोग करें और अक्षमता का निर्धारण करने में असमर्थता शामिल हैं।

Introduction

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पर्यावरणीय स्वास्थ्य का मूल्यांकन करने के रहने वाले जीवों का उपयोग करें जो जैविक निगरानी कार्यक्रम, अक्सर पानी की गुणवत्ता का आकलन या पारिस्थितिकी तंत्र बहाली के कार्यक्रमों की सफलता की निगरानी करने के लिए उपयोग किया जाता है। Benthic macroinvertebrate assemblages का उपयोग कर रैपिड bioassessment प्रोटोकॉल (RBP) 1989 के बाद से 1 राज्य जल संसाधन एजेंसियों के बीच लोकप्रिय हो गया है। इस तरह की डुबकी-नेट, Surber पारखी, और हेस पारखी के रूप में 2 RBPs के लिए benthic macroinvertebrates नमूने के पारंपरिक तरीकों, समय किया जा सकता है महंगा है, लगता है, और केवल एक विशेष microhabitat 3 से assemblages उपाय हो सकता है। एक विशेष रूप से पानी शरीर के बारे में जैविक जानकारी पैदा करने के लिए एक कुशल, वैकल्पिक RBP Chironomidae सतह अस्थायी पोटा संबंधी exuviae (SFPE) 3 के संग्रह शामिल है।

Chironomidae: आमतौर पर गैर-काट midges के रूप में जाना जाता है (इनसेक्टा Diptera), आमतौर पर वयस्कों के रूप में उभर रहा से पहले जलीय वातावरण में पाए जाते हैं कि holometabolous मक्खियों हैं 60, पानी की सतह पर। chironomid परिवार दुनिया भर में वर्णित लगभग 5000 प्रजातियों के साथ, प्रजातियों युक्त है; हालांकि, के रूप में कई के रूप में 20,000 प्रजातियों 4 मौजूद का अनुमान है। Chironomids क्योंकि उनके उच्च विविधता और चर प्रदूषण सहनशीलता का स्तर 5 से कई जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में पानी और वास गुणवत्ता का दस्तावेजीकरण करने में उपयोगी होते हैं। इसके अलावा, वे आम तौर पर समुदाय 5,6 में 50% या प्रजातियों में से अधिक के लिए लेखांकन, अक्सर जलीय प्रणालियों में सबसे प्रचुर मात्रा में है और बड़े पैमाने benthic macroinvertebrates हैं। स्थलीय वयस्क के उद्भव के बाद, पोटा संबंधी exuviae (पोटा संबंधी त्वचा डाली) पानी की सतह पर तैर रहता है (चित्रा 1)। पोटा संबंधी exuviae हवा या पानी वर्तमान की क्रिया के माध्यम से बैंकों के साथ या अवरोधों के पीछे जमा और आसानी से और तेजी से पिछले 24-48 घंटा 7 के दौरान उभरा है कि chironomid प्रजातियों में से एक व्यापक नमूना देने के लिए एकत्र किया जा सकता है।

दूसरों 5 काफी संवेदनशील होते हैं, जबकि ntent "> रिश्तेदार बहुतायत और एकत्र SFPE का वर्गीकरण संरचना, कुछ प्रजातियों सहिष्णु बहुत प्रदूषण कर रहे हैं, विचार है कि पानी की गुणवत्ता को दर्शाता है SFPE विधि सहित पारंपरिक लार्वा chironomid नमूना तकनीक के कई फायदे हैं:। (1) कम से कम (2) के नमूने रहने वाले जीवों इकट्ठा करने पर ध्यान देते हैं, बल्कि निर्जीव त्वचा, ताकि समुदाय की गतिशीलता की गति प्रभावित नहीं है नहीं है; जीनस (3) की पहचान, और यदि कोई हो, वास अशांति एक नमूना क्षेत्र में होता है अक्सर प्रजातियों, अपेक्षाकृत आसान उपयुक्त चाबियाँ और विवरण 3 दिया जाता है, (4) का संग्रह, प्रसंस्करण, और नमूने की पहचान के पारंपरिक तरीकों के नमूने 3,8,9 की तुलना में कुशल और किफायती है, (5) संचित exuviae से उत्पन्न है कि टाक्सा का प्रतिनिधित्व microhabitats 10 की एक विस्तृत श्रृंखला, (6) विधि नदियों और नदियों, ज्वारनदमुख, लाक सहित लगभग सभी जलीय वातावरण में लागू होता हैतों, तालाबों, रॉक पूल, और झीलों; वे सभी अपरिपक्व चरणों पूरा किया और सफलतापूर्वक वयस्कों के 11 के रूप में उभरा है कि व्यक्तियों के प्रतिनिधित्व के बाद से और (7) SFPE शायद पारिस्थितिकी तंत्र के स्वास्थ्य के प्रति अधिक संवेदनशील सूचक हो।

SFPE विधि chironomid समुदायों के बारे में जानकारी जुटाने के लिए एक नया दृष्टिकोण नहीं है। SFPE का प्रयोग पहली बार 1900 के प्रारंभ में Thienemann 12 ने सुझाव दिया था। अध्ययन की एक किस्म (जैसे 7,16-19) वर्गीकरण सर्वेक्षण (जैसे, 13-15), जैव विविधता और पारिस्थितिकी के अध्ययन के लिए SFPE प्रयोग किया जाता है, और जैविक आकलन (जैसे, 20-22)। साथ ही, कुछ अध्ययनों नमूना डिजाइन, नमूना आकार, और प्रजातियों या पीढ़ी (जैसे, 8,9,23) के विभिन्न पता लगाने के स्तर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक नमूना घटनाओं की संख्या के विभिन्न पहलुओं को संबोधित किया है। इन अध्ययनों प्रजाति या पीढ़ी के अपेक्षाकृत उच्च प्रतिशत मध्यम effor के साथ पता लगाया जा सकता है कि संकेत मिलता हैटी या खर्च नमूना प्रसंस्करण के साथ जुड़ा। उदाहरण के लिए, एंडरसन और Ferrington 8 100 गिनती subsample पर आधारित, 1/3 कम समय के नमूने शुद्ध डुबकी की तुलना में SFPE के नमूने लेने के लिए आवश्यक था कि निर्धारित। एक अन्य अध्ययन में 3-4 SFPE नमूने हल और हर डुबकी शुद्ध नमूने के लिए और प्रजातियों समृद्धि 3 में वृद्धि हुई है के रूप में SFPE नमूने का पता लगाने प्रजातियों में डुबकी शुद्ध नमूनों की तुलना में अधिक कुशल थे कि पहचाना जा सकता है कि निर्धारित किया। SFPE नमूने 97.8% 3 कुशल थे, जबकि उदाहरण के लिए, प्रजातियों के साथ साइटों पर 15-16 प्रजातियों के मूल्यों समृद्धि, औसत डुबकी शुद्ध दक्षता 45.7% थी।

महत्वपूर्ण बात है, SFPE विधि यूरोपीय संघ के 24 में मानकीकरण किया गया है और पारिस्थितिक मूल्यांकन के लिए उत्तरी अमेरिका के 25 (chironomid पोटा संबंधी exuviae तकनीक (CPET) के रूप में जाना जाता है), लेकिन विधि विस्तार से वर्णित नहीं किया गया है। SFPE कार्यप्रणाली से एक आवेदन एट अल Ferrington, द्वारा बताया गया था।

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Protocol

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फील्ड संग्रह की आपूर्ति की 1. तैयारी

  1. अध्ययन डिजाइन के आधार पर एकत्र की है और प्रत्येक नमूना के लिए एक नमूना जार (उदाहरण के लिए, 60 मिलीग्राम) का अधिग्रहण किया जाना चाहिए कि SFPE नमूनों की संख्या निर्धारित करते हैं।
  2. प्रत्येक नमूने जार के लिए दो तारीख और इलाके लेबल तैयार करें। अंदर पर एक जगह और जार के बाहर करने के लिए अन्य प्रत्यय। नमूना एकत्रित कर देश, राज्य, काउंटी, शहर, पानी शरीर, जीपीएस निर्देशांक, दिनांक, और व्यक्ति (ओं) का नाम: प्रत्येक तिथि और इलाके लेबल निम्नलिखित जानकारी शामिल है कि सुनिश्चित करें।
  3. अन्य विशिष्ट सामग्री और उपकरणों (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) इकट्ठा।

2. फील्ड संग्रह

  1. एक हाथ में एक लार्वा ट्रे और दूसरे में एक चलनी पकड़ो। SFPE जमा जहां पानी में लार्वा ट्रे डुबकी (जैसे, फोम राशि, snags, आकस्मिक वनस्पति, वापस मलबे, eddies, और बैंक किनारों के साथ) (2A चित्रा), वाट की अनुमति देते हैंएर, exuviae, और मलबे लार्वा ट्रे दर्ज करें, और चलनी के माध्यम से इस सामग्री डालना। एक lotic प्रणाली में नमूना, नमूना पहुंच के बहाव के अंत में शुरू हो और (चित्रा 2 बी) नदी के ऊपर काम करते हैं। एक lentic प्रणाली में नमूने हैं, हवा के साथ तटरेखा पर शुरू करते हैं।
    1. दोहराएँ प्रत्येक पूर्व निर्धारित नमूना पहुंच के भीतर 10 मिनट के लिए 2.1 कदम (या के रूप में अन्यथा एक विशिष्ट नमूने शासन के लिए परिभाषित) (धाराओं से एकत्र नमूनों के लिए आम तौर पर 100-200 मीटर है, लेकिन जलीय निगरानी साइट के समग्र क्षेत्र पर निर्भर); के रूप में उपयुक्त SFPE संचय क्षेत्रों के बीच चाल है।
  2. नमूना साइट से पानी से भरा एक धारा निकलना बोतल का उपयोग कर चलनी के एक इलाके में मलबे ध्यान लगाओ और ध्यान से संदंश की सहायता और एक धारा निकलना बोतल से इथेनॉल की एक धारा के साथ SFPE नमूने के पूर्व लेबल नमूना जार हस्तांतरण। इथेनॉल के साथ नमूना जार भरें।
  3. दोहराएँ 2.1 सभी नमूनों के लिए 2.2 करने के लिए कदम।

3. नमूना उठा

नोट: इस प्रोटोकॉल के बाकी एक 300 SFPE subsample से संबंधित है और अन्य subsample आकार के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। अध्ययन के विशिष्ट लक्ष्यों और संसाधनों को पूरा करने के SFPE विधियों सिलाई के लिए Bouchard और Ferrington के 9 subsampling और नमूना आवृत्ति दिशानिर्देश देखें।

  1. प्रत्येक SFPE नमूना के लिए एक 1-घूंट शीशी आवंटित; प्रत्येक शीशी के अंदर जगह और इथेनॉल के साथ पूर्ण शीशी ¾ भरने के लिए एक तारीख और इलाके लेबल तैयार करते हैं।
  2. इसी नमूना जार से ढक्कन हटाएँ और संलग्न पोटा संबंधी exuviae लिए जाँच करें। धीरे इथेनॉल के साथ भरा एक धारा निकलना बोतल का उपयोग कर एक पेट्री डिश पर ढक्कन बंद सामग्री कुल्ला। जानें, और पेट्री डिश पर बंद लेबल सामग्री कुल्ला धीरे संदंश का उपयोग नमूना जार के अंदर से लेबल हटाने और। एक तरफ लेबल सेट करें।
  3. कोई SFPE नमूना जार में रहना सुनिश्चित करने के लिए इथेनॉल के साथ rinsing, एक लार्वा ट्रे में नमूना जार की सामग्री को स्थानांतरित। पोटा संबंधी exuviae, निवासियों के एक हिस्से का स्थानांतरणपेट्री डिश के लिए ट्रे से होने के कारण, और इथेनॉल। नमूना इथेनॉल में कवर किया जाता है सुनिश्चित करें।
  4. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत पेट्री डिश रखें। व्यवस्थित पोटा संबंधी exuviae के लिए पेट्री डिश की सामग्री को स्कैन। शीशी में संदंश और जगह का उपयोग पकवान से सभी पोटा संबंधी exuviae उठाओ। टूट रहे हैं कि नमूनों लेने मत करो, सूखे, या बाद में पहचान की समस्याओं से बचने के लिए संकुचित (यानी, cephalothorax और पेट के कम से कम आधा भी नहीं है)।
    नोट: प्रजातियों के लिए पहचान अक्सर कुछ मामलों में, जीनस स्तर की पहचान आंशिक नमूनों के साथ संभव हो सकता है, हालांकि पूरे नमूना, मौजूद है जो की आवश्यकता है।
    1. भंवर पकवान और शुरू में पता लगाया जा नहीं हो सकता है कि पकवान के पक्ष में अटक जा सकता है कि किसी भी सहित अतिरिक्त पोटा संबंधी exuviae, और साथ ही, किसी भी छोटे और पारदर्शी नमूनों के लिए स्कैन। लगातार दो स्कैन कोई अतिरिक्त पोटा संबंधी exuviae प्रकट जब तक दोहराएँ।
  5. चरणों को दोहराएँ 3.3 और3.4 सभी या 300 पोटा संबंधी exuviae उठाया गया है जब तक। 300 पोटा संबंधी exuviae उठाया गया है, लार्वा ट्रे को पेट्री डिश से अवशेषों को लौटने के लिए और इथेनॉल के साथ पेट्री डिश कुल्ला। फिर, खाली नमूना जार करने के लार्वा ट्रे से अवशेषों को हस्तांतरण की तारीख और इलाके लेबल जोड़ने के लिए, और जार पर ढक्कन लगा। बनाए रखने या परियोजना विशेष प्रोटोकॉल के अनुसार अवशेषों के निपटान के।

छंटनी 4. नमूना

  1. सब सिर्फ नमूनों को कवर करने के लिए पर्याप्त इथेनॉल के साथ भरा एक पेट्री डिश में लेबल किया शीशी से पोटा संबंधी exuviae उठाया डालो।
  2. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, अलग अलग रूपात्मक समूहों (यानी, morphotaxa) में नमूनों और अलग से एक लेबल शीशियों इथेनॉल के साथ वें 3/4 पूरा भर में प्रत्येक morphotaxon जगह है।
    1. Chironomid morphotaxa अलग करने के लिए बाहरी लक्षण का उपयोग। उदाहरण के लिए, cephalothorax से, उपस्थिति, आकार, आकृति में मतभेद का उपयोग करें, औरमस्तक tubercles, ललाट मौसा, ललाट setae, और वक्ष सींग की रंगाई। पेट से, morphotaxa जुदाई (चित्रा -4 ए) के लिए गुदा खण्डों के अलावा, पेट क्षेत्रों का कांटा, hookrows, हरे रंग का बिना कमाया हुआ चमड़ा, setae, और स्पर्स का उपयोग करें। Ferrington देखें, एट अल। 5, Sæther 26, पिंडर और अतिरिक्त विवरण और रूपात्मक विशेषताओं के आंकड़ों के लिए Reiss 27।
    2. नमूनों सुखाने के लिए शुरू अगर अतिरिक्त इथेनॉल का प्रयोग करें।

बढ़ते 5. स्लाइड

  1. 95% इथेनॉल के साथ प्रत्येक morphotaxon के लिए एक बहु अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से भरें।
    1. कई अभ्यावेदन रखें (जैसे, कुल का 25%) प्रत्येक morphotaxon की स्लाइड थाली के अलग-अलग कुओं में रखा जाना है। नमूनों पर्याप्त निर्जलीकरण के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से में बैठने की अनुमति।
  2. उपयुक्त स्थल है, संग्रह, और पहचान के सूचना प्रणालियों के साथ लेबल स्लाइड्स(चित्रा 3) पर।
  3. स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर प्लेस स्लाइड।
    नोट: चरण के लिए टेप स्लाइड के एक टेम्पलेट के अनुरूप नियुक्ति के लिए उपयोगी है।
  4. स्लाइड पर Euparal की एक बूंद प्लेस; यह coverslip के आकार का अनुमान लगाती है तो यह है कि Euparal फैल गया। Euparal के साथ काम करना उचित वेंटीलेशन का प्रयोग करें।
    नोट: Euparal के साथ काम करना उचित वेंटीलेशन का प्रयोग करें।
  5. संदंश का उपयोग Euparal में पहली morphotaxon से एक प्रतिनिधि शामिल करें।
    नोट: प्रयोगशाला Euparal में एम्बेड करने के लिए पहले पोंछे पर धीरे नमूना नल, एक संदंश का उपयोग, नमूना से अतिरिक्त इथेनॉल शून्य करने के लिए।
  6. ठीक इत्तला दे दी संदंश और / या विच्छेदन जांच (चित्रा -4 ए) का उपयोग कर पेट से cephalothorax अलग करें।
    1. Ecdysial सिवनी (चित्रा 4 बी) के साथ cephalothorax विभाजन और सिवनी किनारों विपरीत दिशा (चित्रा 4C) पर कर रहे हैं इतना है कि cephalothorax खुला।
    2. सी ओरिएंटephalothorax इतना है कि उदर पक्ष (चित्रा 4C) का सामना करना पड़ रहा है।
    3. पेट पृष्ठीय पक्ष स्थिति; तुरंत cephalothorax (चित्रा 4C) के नीचे रखें।
  7. नमूना पर एक coverslip रखें। एक किनारे फिर धीरे धीरे कम स्लाइड छू, और साथ ही, एक कोण पर coverslip पकड़ो और हवा बुलबुला गठन को कम करने के लिए coverslip के ड्रॉप। हल्के से coverslip पर प्रेस नमूना समतल करने के लिए।
  8. दोहराएँ सभी निर्जलित नमूनों के लिए 5.7 के माध्यम से 5.3 कदम।

6. परिकलित पहचान

  1. एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइड पर चढ़कर नमूनों की जीनस का निर्धारण करते हैं। एट अल Wiederholm 28 और Ferrington में कुंजी और निदान का उपयोग कर जीनस नमूनों को पहचानें। 5। यदि आवश्यक हो, एट अल, Ferrington का उपयोग कर परिवार के स्तर की पहचान की पुष्टि करें। 5। नोट: Wiederholm 28 और Ferrington के बाद से कई सामान्य विवरण और बदलाव नहीं किया गया है,एट अल। 5, इसलिए, इन चाबियों और निदान अधूरे हैं और प्राथमिक साहित्य के साथ पूरा किया जाना चाहिए।

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Representative Results

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चित्रा 1 chironomid जीवन चक्र को दिखाता है; अपरिपक्व चरणों (अंडा, लार्वा, प्यूपा) आम तौर पर में जगह ले, या निकट एक जलीय वातावरण, के साथ जुड़े। लार्वा जीवन चरण के पूरा होने पर, लार्वा एक ट्यूब की तरह आश्रय का निर्माण और आसपास के सब्सट्रेट करने के लिए रेशमी स्राव के साथ ही देता है और प्यूपीकरण होता है। विकासशील वयस्क परिपक्व हो गया है एक बार, प्यूपा खुद को मुक्त कर देते हैं और वयस्क पोटा संबंधी exuviae से उभर सकते हैं जहां पानी की सतह पर तैरती है। exuviae हवा से भर जाता है, और छल्ली के एक बाहरी मोमी परत के आधार पर, यह बैक्टीरिया मोम की परत विघटित करने के लिए शुरू करते हैं जब तक पानी की सतह पर तैर बनी हुई है।

2A चित्रा में सचित्र ऐसी नदी तट वनस्पति या गिर के पेड़ पानी की सतह के साथ संपर्क बनाने के रूप में जहां संचय के क्षेत्रों में exuviae पोटा संबंधी अस्थायी जल धाराओं या हवा ध्यान,। एक लार्वा ट्रे और चलनी और पोटा संबंधी इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है# 160; इन प्राकृतिक संचय क्षेत्रों से और चित्रा 2B में दिखाया गया है, microhabitats की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से Chironomidae के उद्भव का मूल्यांकन। कुछ अनुप्रयोगों के लिए, यह तुलना किसी नमूने स्थल पर कई नमूना साइटों के बीच या समय के साथ बनाया जा सकता है इतना है कि एक सुसंगत, मानकीकृत तरीके से नमूने एकत्र करने के लिए महत्वपूर्ण है। दस मिनट संग्रह अवधि chironomid रिश्तेदार बहुतायत 3,25 की पर्याप्त मूल्यांकन प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, Ferrington, एट अल। 3 प्रजातियां Chironomus riparius के उद्भव के अनुमानों की जांच की और 12 पैन गिरावट विश्लेषण किया गया बाद अनुमानों काफी भिन्न नहीं था कि पाया। एक 10 मिनट संग्रह अवधि के भीतर, कई और अधिक से अधिक 12 गिरावट आम तौर पर प्राप्त कर रहे हैं, इस प्रकार हम एक नमूना पहुंच के भीतर प्रचुर मात्रा में प्रजातियों का बहुमत इस समय सीमा में पता लगाया जाएगा कि आत्मविश्वास लगता है। 3

SFPE नमूने एकत्र किया गया है एक बार, उठाया, और, पुलिस अधीक्षक के अनुसार क्रमबद्धecimens जीनस या प्रजातियों की पहचान और वाउचर नमूनों के निर्माण के लिए मुहिम शुरू की स्लाइड कर रहे हैं। उपयुक्त स्थल है, संग्रह, और पहचान की जानकारी के साथ स्लाइड्स लेबल चित्रा 3 में, के रूप में सिफारिश की है। आमतौर पर, इलाके लेबल देश, राज्य, पानी शरीर, जीपीएस निर्देशांक, अध्ययन स्थल आईडी, संग्रह की तारीख, और नाम के बारे में जानकारी प्रदर्शित करता है नमूना एकत्र कि व्यक्ति। साथ ही, इस लेबल प्रत्येक स्लाइड पर चढ़कर नमूना के लिए एक अनूठा स्लाइड नंबर होगा। पहचान के लेबल से पता चलता है जीनस और प्रजातियों (जब लागू हो) की पहचान और नमूना पहचान उस व्यक्ति का नाम है।

पोटा संबंधी exuviae सही ढंग से विच्छेदित और जीनस पहचान और वाउचर नमूना तैयार करने के लिए उन्मुख होने की जरूरत है। चित्रा -4 ए स्लाइड पर पोटा संबंधी exuviae नियुक्ति सही पृष्ठीय पक्ष में दिखाता है। वे cylind हैं क्योंकि स्लाइड पर नियुक्ति के दौरान नमूनों शुरू में पृष्ठीय पक्ष झूठ नहीं हो सकता हैआकार में RICAL और अक्सर इथेनॉल और हवा के बुलबुले के साथ भर दिया। स्लाइड का सुझाव दिया है की दिशा में इसलिए, संदंश या एक विच्छेदन जांच के उपयोग से थोड़ा Euparal में पेट सेक करने के लिए। संपीड़न पृष्ठीय ध्यान में रखते हुए नमूना पूरबी और इथेनॉल और हवा के बुलबुले के सबसे निष्कासित। 4B पेट से cephalothorax कि अलग विच्छेदन दर्शाता लगाना चाहिए। शुरुआती पहली और दूसरी पेट खंड के बीच पेट फाड़ करने के लिए इस विच्छेदन के दौरान, यह खासियत है। सावधानी पेट के बाकी के साथ पहले पेट खंड बनाए रखने में रखा जाना चाहिए। चित्रा 4C coverslip की स्थिति पहले सही विच्छेदन और पोटा संबंधी exuviae के उन्मुखीकरण से पता चलता है। कुछ नमूनों के लिए, यह सीवन किनारों विपरीत दिशा में होते हैं और cephalothorax उदर ध्यान में रखते हुए उन्मुख है कि इतनी cephalothorax खोलने के लिए मुश्किल हो सकता है। फिर, cephalothorax की एक छोटी सी dorsoventral संपीड़न इस placeme प्राप्त करने के लिएNT की सिफारिश की है।

SFPE के संग्रह को सफलतापूर्वक (चित्रा 6) 23 झील गहराई मतलब / मतलब फास्फोरस एकाग्रता की एक ढाल के साथ प्रजातियों के संचय (चित्रा 5 ए) और जीनस समृद्धि (चित्रा 5 ब) और संचयी जाति की संरचना निर्धारित करने के लिए मिनेसोटा में शहरी झीलों में इस्तेमाल किया गया है। इन परिणामों के आधार पर, एक सबूत की अवधारणा अध्ययन मिनेसोटा भर में प्रहरी झीलों में जलवायु परिवर्तन (के संबंध में Chironomidae की लंबी अवधि की निगरानी के लिए लागू किया गया है http://midge.cfans.umn.edu/research/biodiversity/chironomidae /-झीलों -slice )। Rufer और Ferrington 23 मौसम के अनुसार झील प्रति चार SFPE नमूने chironomid समुदाय के बहुमत बरामद किया है और (चित्रा 5 ए, बी) शहरी झीलों में महत्वपूर्ण मौसमी भिन्नता का पता चला है कि निर्धारित किया। सभी 16 झीलों में अप्रैल के नमूने विभिन्न निहितसितम्बर के नमूने के माध्यम से मई की तुलना में NT टाक्सा। इसलिए, उत्तरी-शीतोष्ण क्षेत्रों में, मौसम के अनुसार चार बार नमूना अप्रैल में एक नमूना और मई और सितंबर के बीच तीन नमूनों के साथ की सिफारिश की है। बहरहाल, विभिन्न भौगोलिक क्षेत्रों और मौसम के लिए, नमूने शासन एकत्र समुदाय के हिस्से को अधिकतम करने के लिए क्षेत्र के अनुरूप होना चाहिए।

चित्र 1
Chironomid जीवन चक्र में चार जीवन चरणों, अंडा, लार्वा, प्यूपा, और वयस्क, चित्रा 1. Chironomid जीवन चक्र। रहे हैं। महिला वयस्कों के पानी की सतह पर अंडे देते हैं। अंडे नीचे सिंक और आम तौर पर एक सप्ताह के लिए कई दिनों में पक्षियों के बच्चे। अंडा बड़े पैमाने पर छोड़ने के बाद, लार्वा कीचड़ में बिल या जिसमें वे रहते हैं छोटे ट्यूबों फ़ीड का निर्माण, और विकसित करना। लार्वा उनके नलियों में है जबकि अभी भी pupae में बदलना। प्यूपीकरण के बाद, pupae के लिए सक्रिय रूप से की सतह पर तैरपानी और वयस्कों पोटा संबंधी exuviae से उभरने। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा एक धारा में SFPE संचय और क्षेत्र संग्रह तकनीकों के एक क्षेत्र के 2. उदाहरण हैं। (ए) SFPE एक प्रवेश के अपस्ट्रीम जमा होता है, जहां का एक उदाहरण है। सफेद, झागदार सामग्री जैसे macrophytes और शैवाल के रूप में कार्बनिक पदार्थ का एक संयोजन है, और पोटा संबंधी exuviae के हजारों सैकड़ों शामिल कर सकते हैं। (बी) के एक कलेक्टर एक चलनी और स्ट्रीम की नदी तट बैंकों से SFPE इकट्ठा करने के लिए लार्वा ट्रे का प्रयोग करेंगे कैसे का एक उदाहरण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा स्लाइड तारीख और इलाके लेबल (बाएं), पहचान लेबल (दाएं), और स्लाइड के स्थानों को दिखा 3. आरेख coverslip (बीच में) के तहत पोटा संबंधी exuviae मुहिम शुरू की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
विच्छेदन और ओरिएंटेशन exuviae चित्रा 4. चरण-दर-चरण पोटा संबंधी। (ए) Undissected पोटा संबंधी exuviae (cephalothorax और पृष्ठीय दृश्य में गिने क्षेत्रों के साथ पेट)। (पृष्ठीय दृश्य में cephalothorax और पेट) पोटा संबंधी exuviae विच्छेदित (बी)। (सी) विच्छेदित और उन्मुख पोटा संबंधी exuviae (cephalothorax: उपक्रमत्राल देखें; पेट:। पृष्ठीय दृश्य) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: मिनेसोटा में 16 शहरी झीलों से एकत्र SFPE नमूने के लिए वर्गीकरण संचय घटता। दोनों पैनलों के लिए, प्रत्येक रंग की लाइन 16 झीलों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक झील की विशेषताओं का एक विस्तृत विवरण के लिए Rufer और Ferrington 23 देखें। प्रत्येक डेटा बिंदु 2005 की बर्फ से मुक्त महीने (अप्रैल-अक्टूबर) के दौरान हवा के साथ तट के साथ एकत्र एक मासिक 10 मिनट SFPE नमूना प्रतिनिधित्व करता है। ए) SFPE नमूने के लिए प्रजाति संचय घटता। बी) SFPE नमूने के लिए परिकलित संचय घटता। थी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंएस आंकड़ा।

चित्रा 6
चित्रा 6: मिनेसोटा में 16 शहरी झीलों से मतलब epilimnetic फास्फोरस एकाग्रता (g / एल) से अधिक मतलब झील गहराई (एम) के एक समारोह के रूप में कई SFPE नमूनों से झील chemistries की एक ढाल भर में पता चला संचयी प्रजातियों। प्रत्येक डेटा बिंदु 16 झीलों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है; झीलों गहराई मतलब / उच्चतम मतलब फास्फोरस के लिए सबसे कम से हल कर रहे हैं। प्रत्येक झील की विशेषताओं का एक विस्तृत विवरण के लिए Rufer और Ferrington 23 देखें। मतलब फास्फोरस एकाग्रता के अनुपात के रूप में बढ़ जाती है का सामना करना पड़ा प्रजातियों का संचयी नंबर पर झील की गहराई बढ़ जाती है मतलब है।

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Discussion

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सफल SFPE नमूना संग्रह, स्लाइड, बढ़ते उठा छँटाई, और पहचान के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: (1) मैदान संग्रह (2A चित्रा) के दौरान अध्ययन के क्षेत्र के भीतर उच्च SFPE संचय के क्षेत्रों का पता लगाने; (2) धीरे-धीरे नमूना उठा दौरान सभी SFPE का पता लगाने के लिए पेट्री डिश की सामग्री स्कैनिंग; (3) (चित्रा -4 ए) बढ़ते स्लाइड के दौरान पेट से cephalothorax टुकड़े करना आवश्यक मैनुअल निपुणता विकसित करना; और (4) सही ढंग से जीनस को पहचान करने के लिए chironomid पोटा संबंधी exuviae के प्रमुख रूपात्मक पात्रों को पहचानने।

उच्च SFPE संचय (2A चित्रा) के क्षेत्रों का पता लगाने के सफल SFPE नमूना संग्रह में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। पोटा संबंधी exuviae जलीय वनस्पति या नाव रैंप की तरह मानव संरचनाओं में फंस गए हैं, और लहरों अपतटीय "windrows" 30 में सामग्री अस्थायी ध्यान केंद्रित कर सकते हैं। पानी की बड़ी निकायों के लिए,संचय के प्राकृतिक क्षेत्रों की पहचान पवन पैटर्न या पोटा संबंधी exuviae amassing कर रहे हैं, जहां का उपयोग क्षेत्रों के लिए watercraft के प्रयोग पर आधारित अध्ययन साइटों का पता लगाने की आवश्यकता हो सकती है। SFPE की पर्याप्त संख्या के साथ एक नमूना उभरते प्रजातियों की उपस्थिति का पता लगाने और सटीकता की एक उच्च डिग्री के साथ अलग-अलग प्रजातियों के रिश्तेदार बहुतायत अनुमान लगाने के लिए एकत्र किया जाना चाहिए। नमूना छँटाई के दौरान, यह धीरे-धीरे छोटे (लंबाई में 3-6 मिमी), हल्के से pigmented नमूनों के लिए पेट्री डिश कई बार स्कैन करने के लिए आवश्यक है। SFPE अक्सर शैवाल, पत्ते, लाठी, बीज, और फूलों से चिपके रहते हैं, और इसलिए, प्रारंभिक स्कैन के दौरान पता नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल जीनस पहचान (चित्रा -4 ए) के लिए पेट से cephalothorax के बढ़ते सावधान विच्छेदन और स्लाइड की आवश्यकता है। Cephalothorax और पहले पेट खंड के बीच exuviae काटना ठीक इत्तला दे दी संदंश और / या विच्छेदन जांच का प्रयोग करें। अंत में, जीनस पहचान नया taxonomists के लिए मुश्किल हो सकता है।जीनस के लिए नमूनों की पहचान करने के लिए शुरू करने से पहले आकृति विज्ञान और chironomid pupae की शब्दावली का अध्ययन करने के लिए समय ले लो। कुंजी और chironomid पीढ़ी के निदान के लिए Wiederholm 28 और Ferrington, एट अल। 5 देखें। पहचान के कौशल के लिए एक चिंता का विषय हैं, तो सभी स्लाइड या वाउचर नमूनों में से एक सबसेट उपयुक्त क्षमताओं के साथ एक प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है।

सबसे समुदायों में कंपित वयस्क emergences के आधार पर, कई नमूने घटनाओं सलाह दी जाती है, और लंबे समय तक अध्ययन के लिए एक पायलट परियोजना के तरीकों को अंतिम रूप देने के लिए पहले सबसे उपयोगी नमूना समय निर्धारित कर सकते हैं। ये अक्सर दुर्लभ टाक्सा 31 हैं, हालांकि यहां तक कि कई मौसम लक्षित नमूने की घटनाओं के साथ, समुदाय के अनुपात, नहीं चल पाता रहेगा। आवृत्ति सिफारिशों नमूना लेने के लिए Bouchard, और नदियों के लिए Ferrington 9 और Rufer और झीलों के लिए Ferrington 23 देखें। नमूना कार्यप्रणाली के संबंध में मुख्य चिंता का विषय एस एफ से संबंधित हैपीई अस्थायी दूरी। बड़े नदियों में exuviae 2 किमी 30 से ऊपर स्थानांतरित कर सकते हैं, जबकि धाराओं में, ठेठ बहाव, मी 50-250 के बीच है। फील्ड सबूत exuviae के पचास प्रतिशत या उससे अधिक वयस्क 20 उभर जहां के बहाव से अधिक 100 मीटर की दूरी विस्थापित नहीं है कि पता चलता है। एक एक संदिग्ध प्रदूषण स्रोत से नीचे की ओर 500 मीटर का एक नमूना पहुंच से अधिक SFPE एकत्रित कर रहा है, तो इसलिए, यह एकत्रित नमूनों के बहुमत संदिग्ध प्रभाव क्षेत्र में 25 के भीतर अपने जीवन चक्र पूरा कर लिया है कि संभावना है। झीलों, तालाबों, और पूल में, पोटा संबंधी exuviae सतह धाराओं के साथ आगे बढ़ना होगा और अक्सर पानी शरीर की हवा के साथ किनारे पर बड़ी संख्या में इकट्ठा।

सहित इस विधि के साथ जुड़े संभावित सीमाओं, वहाँ रहे हैं, लागत प्रभावी हालांकि: लार्वा 32 के द्वारा प्रयोग किया microhabitats निर्धारित करने के लिए (1) असमर्थता; (2) voltinism बहुधा है के बाद से असमर्थता, eclosion करने से पहले प्रमुख जीवन चक्र की घटनाओं और instar अवधि का आकलन करने के लिएएन 7 निर्धारित करने के लिए चुनौती दे; (3) assemblages मजबूत करने के लिए मौसमी परिवर्तनशीलता 30 का पता चला; (4) टूट या एक तेज दर 33 में सिंक कि हल्के से chitinized exuviae साथ प्रजातियों के खिलाफ एक पूर्वाग्रह; (5) pupae और वयस्क पुरुषों में पहले 5 जुड़े नहीं किया गया है अगर प्रजातियों के नमूनों की पहचान करने में सक्षम नहीं किया जा रहा; और (6) areal घनत्व या बायोमास का आकलन करने की कठिनाई।

ऊपर वर्णित है, पोटा संबंधी exuviae जलीय biomonitoring पढ़ाई 5 में शामिल करने के लिए सबसे उपयोगी और लागत प्रभावी जीवन चरणों में हैं। SFPE पद्धति में सुधार करने के लिए भविष्य के अध्ययन के परीक्षण में शामिल हैं: (1) उपयुक्त अनुकरण; (2) subsample आकार; इलाके और ब्याज की पानी शरीर पर निर्भर करता है नमूना घटनाओं की (3) उपयुक्त आवृत्ति; और (4) तापमान, आर्द्रता, decomposer टीका, और यांत्रिक गड़बड़ी के विभिन्न शर्तों के तहत exuviae के लिए डूबने और टूटने दरों। इसके अलावा, भविष्य के अध्ययन के शोधन में शामिल होना चाहिएइस तरह के डीएनए बारकोडिंग के रूप में आणविक आधारित पहचान की तकनीक, की, लार्वा और वयस्कों 34-35 से पोटा संबंधी exuviae संबद्ध करने के लिए।

यहाँ हम वर्णन किया है chironomid SFPE नमूना संग्रह, प्रयोगशाला प्रसंस्करण, स्लाइड बढ़ते, और विस्तार में जीनस पहचान। SFPE विधि विविध, व्यापक chironomid समुदायों का आकलन करने के लिए कुशल है और पानी की गुणवत्ता को बदलने के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं की पढ़ाई में benthic नमूने बढ़ाने कर सकते हैं। यह लागत प्रभावी, वैकल्पिक RBP बड़े पैमाने पर करने के लिए यह अच्छी तरह से अनुकूल बनाने के लिए कई अलग फायदे समय की विस्तारित अवधि से अधिक दोहराया नमूना घटनाओं में शामिल विश्लेषण करती है कि प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

रचना और इस पत्र को प्रकाशित करने के लिए अनुदान मिनेसोटा विश्वविद्यालय में कीट विज्ञान विभाग में Chironomidae अनुसंधान समूह (नियंत्रण रेखा Ferrington, जूनियर, पीआई) करने के लिए कई अनुदान और ठेके के माध्यम से प्रदान किया गया। धन्यवाद नाथन रॉबर्ट्स के लिए आंकड़ों के रूप में प्रयोग किया जाता म तस्वीरें साझा करने के लिए वीडियो में इस पांडुलिपि के साथ जुड़े।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Fisher Scientific S25309B  70-95%
Plastic wash bottles Fisher Scientific 0340923B
Sample jar Fisher Scientific 0333510B Glass or plastic, 60-mL recommended
Testing sieve Advantech 120SS12F 125-micron mesh size
Larval tray BioQuip 5524 White
Stereo microscope
Glass shell vials Fisher Scientific 0333926B 1-dram size
Plastic dropper Thermo Scientific 1371110 30 to 35 drops/mL
Fine forceps BioQuip 4524 #5
Petri dish Carolina 741158 Glass or plastic
Multi-well plate Thermo Scientific 144530 Glass or plastic
Glass microslides Thermo Scientific 3010002 3 x 1 in.
Glass cover slips Thermo Scientific 12-519-21G Circular or square
Euparal mounting medium  BioQuip 6372B
Pigma pen BioQuip 1154F Black
Probe BioQuip 4751
Kimwipes Kimberly-Clark Professional™ 34120

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References

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Chironomidae (Diptera) का प्रयोग भूतल अस्थायी जल निकायों के लिए एक तेजी Bioassessment प्रोटोकॉल के रूप में पोटा संबंधी Exuviae
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Kranzfelder, P., Anderson, A. M., Egan, A. T., Mazack, J. E., Bouchard, Jr., R. W., Rufer, M. M., Ferrington, Jr., L. C. Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies. J. Vis. Exp. (101), e52558, doi:10.3791/52558 (2015).More

Kranzfelder, P., Anderson, A. M., Egan, A. T., Mazack, J. E., Bouchard, Jr., R. W., Rufer, M. M., Ferrington, Jr., L. C. Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies. J. Vis. Exp. (101), e52558, doi:10.3791/52558 (2015).

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