Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En murin model af Irreversible og reversibel Ensidig ureteric Obstruktion

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52559

Protocol

Generel Vejledning: Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og forskrifter, der fastsættes af Dyr (Videnskabelige procedurer) Act 1986. Denne protokol og den ledsagende video protokollen er for både en standard UUO og en R-UUO, der kan udføres på mange stammer mus. I de ledsagende video, begge procedurer udføres på C57BL / 6-mus 8 uger gamle. Dataene i repræsentative resultater afsnittet blev opnået fra mandlige FVB / n mus.

BEMÆRK: Denne protokol og ledsagende video detaljer, hvordan du udfører en standard UUO og R-UUO udnytte venstre ureter dog de samme teknikker kan let anvendes på den rigtige ureter.

1. Animalske Forberedelse og Laparotomi

  1. Udfør alle procedurer med sterile (autoklaveret) instrumenter og forbrugsvarer.
  2. Injicer ketaminhydrochlorid (70 mg / kg) og medetomidinhydrochlorid (1 mg / kg) intraperitonealt at bedøvemusen. Bemærk: Varigheden af ​​den resulterende bedøvelsesmiddel fly er 4 timer, og ingen supplerende anæstesi er påkrævet.
  3. Bekræft anæstesidybden ved tab af reflekser f.eks, tå knivspids.
  4. Fjern alle hår omkring indsnit område og forberede den abdominale hud til operation via anvendelse af en fortyndet klorhexidin opløsning.
  5. Placer musen på et opvarmet kirurgisk pad i liggende stilling og løse lemmer til puden anvendelse af lav-tack tape.
  6. Under proceduren overvåge mus for tegn på forbrændinger som følge af den opvarmede kirurgiske pad. Hvis det er muligt bruge et ikke-elektriske varmekilde.
  7. Indgiv smertestillende ved en subkutan injektion af buprenorphinhydrochlorid (0,06 mg / kg) og anvende eye smøremiddel for at forhindre udtørring af hornhinden.
  8. Foretag en midterlinjen laparotomi og et snit af den avaskulære linea alba hjælp væv adskille saks til at få adgang til bughulen.
  9. Drapere musen og indsætte en colibriretraktoren ind i indsnittet.

2. Ensidig ureteric Obstruktion

  1. Brug steriliserede vatpinde udsætte venstre ureter ved at forskyde tarmene mod højre side af bughulen og dække dem med fugtede gardiner.
  2. Brug vinklede pincet isolere og løft venstre ureter.
  3. Hvis du vil oprette en ureteric obstruktion, ligere venstre ureter to gange med 6 / O sort flettet silke sutur sted mellem blæren og nyrebækken. For langsigtede eksperimenter, brug absorberbar sutur for alle abdominale operationer. Alternativt kan en ligeringsklemme påføres ureter.
  4. For at isolere blæren fra urinlederen, opdele ureter mellem de to suturer.
  5. Sæt forsigtigt tarmene i bughulen.
  6. Følg trinene i afsnit 4 - det postoperative forløb og pleje til at lukke snittet og vende anæstesi.

3. Forberedelse til Reversible Ensidig ureteric Obstruktion

  1. Forbered en mus til operation og isolere venstre ureter som beskrevet i trin 1,1-2,2 ovenfor.
  2. Hvis du vil oprette en ureteric obstruktion, der kan vendes, ligere venstre ureter to gange med 6 / O sort flettet silke sutur tæt til blæren. Efterlad den ene ende af den øvre sutur længe denne vil blive anvendt til at forankre den bløde walled plastrør på plads omkring ureter.
  3. Foretag en langsgående spalte i en 5 mm længde af blødt walled plastrør, således at det kan spredte åben for at tillade det at blive anvendt på urinlederen. Enhver blød walled silicone plastrør med en indvendig diameter på 1 mm og udvendig diameter på 2 mm, kan anvendes.
  4. Placer bløde walled plastrør forsigtigt omkring ureter. Kontroller, at den lange sutur fremgår centrum af spalten i slangen, når den er lukket omkring ureter.
  5. Placer en længde på 6 / O sort flettet silke sutur omkring bløde walled slange omslutter urinlederen og slipsgang. Nu placere den lange ende af suturen, begyndende fra centrum af spalten i røret, i længderetningen på tværs af slangen, således at det ligger oven på den tidligere bundne sutur.
  6. Bind suturen placeret omkring røret to gange for at forankre røret og den lange sutur ende på plads omkring ureter.
    Bemærk: For at undgå adhæsionsdannelse på urinlederen og bløde walled plastrør kan en vedhæftning reduktion opløsning påføres området omkring slangen.
  7. Sæt forsigtigt tarmene i bughulen.

4. postoperative forløb og pleje

  1. Luk bughinden med tæppe søm med 5 / O sort flettet silke sutur og tilnærme huden ved hjælp af metalliske hud klip.
  2. For at minimere risikoen for postoperativ infektion, anvende en antiseptisk såsom iod / alkohol-opløsning til den abdominale hud.
  3. Delvis omvendte anæstesi med atipamezolhydrochlorid (2 mg / kg) subkutant. Indgiv væsker ved en subkutan injektion af 1 ml opvarmet saltvand.
  4. Overvåg musen, indtil den er tilbagebetalt bevidsthed.
  5. Lad musen til at komme sig i en opvarmet kasse holdt ved 29 ° C i 24 timer. Fugtet mad kan også gives for at tilskynde væske og ernæring indtag.
  6. Lad musen at komme til at inducere et ønsket niveau af obstruktion, typisk 7 dage.
  7. For langsigtede genopretningsplaner eksperimenter, tilrettelægge løbende analgetika. Hvis musen er, der skal inddrives i mere end 7 dage, fjern skindet clips 7 dage efter operationen.
  8. Når det ønskede niveau af obstruktion er blevet fremkaldt enten vende UUO, som beskrevet nedenfor, eller aflive musen ved cervikal dislokation og indsamle nyrerne for histopatologisk analyse.

5. Vendbar Ensidig ureteric Obstruktion

  1. For at udføre en R-UUO forberede en mus, der har undergået forberedelse til R-UUO, til kirurgi som beskrevet i trin 10,1-1,7.
  2. Hvis der er, fjern skindet klip og opdele eller fjerne suturerne i bughinden at få adgang til bughulen. Bemærk: Hvis urinlederen er blevet blokeret for en langsigtet eksperiment hudclips burde have været fjernet 7 dage efter ansøgning.
  3. Forbered mus og isolere venstre ureter som beskrevet i trin 1,8 til 2,2.
  4. Brug vinklede pincet, befri den bløde walled plastrør fra en granulomatøs væv, som kan have dannet.
  5. Skær suturen plastrøret omkring blokeret ureter bedrift med en skalpel og fjern slangen.
  6. Bekræft vellykket UUO ved vurdering for tilstedeværelse af hydronefrose i venstre nyre, bør nyrerne vises også bleg.
  7. Fordel ureter mellem suturerne.
  8. Placer de resterende længde af ureter, er fastgjort til nyrerne, på et lille stykke af steril gaze. Dette vil blive anvendt til at indsamle urin sediment og døde celler, der vil dræne fra urinlederen ennd nyrebækken gang suturen fjernes.
  9. Opdel ovenfor ureter, men nær, suturen og tillade nyrerne løbe på gaze. Lad nedre sutur, tættest på blæren, intakt. Dette er for at sikre, at ingen urin vil lække fra blæren og ind i bughulen.
  10. Når ureter og nyrebækkenet er blevet drænet, anvende en lang 6 / O sort flettet silkesutur til enden af ​​den resterende længde af ureter. Dette vil blive brugt til at hjælpe ureter til blæren anastomose udført senere.
  11. Følg nedenstående trin for at anastomoserer den resterende længde ureter i blæren:
    1. Drej ureter, således at den ligger forreste til sin oprindelige position og ligger over nyrerne.
    2. Placer et enkelt 9 / O polyamid monofilament klæbende sutur 2 mm fra enden af ​​ureter, således at det fremgår i retning af blæren. Pas at sikre, at suturen forbliver i den muskulære lag og ikke træder ureter lumen. Den klæbende sutur will anvendes til at forankre urinlederen i blæren.
    3. Hvis du vil oprette en kanal gennem blæren, bestå en 21G nål diagonalt gennem blæren, således at det kommer ud mod frontale (ventrale) væg af blæren.
    4. Hvil en eyed nål i smig af 21G nål. Brug 21G nål til at lede øjne nål gennem blæren. Den øjne nål skal bruges til at tage ureter gennem blæren.
    5. Før 9 / O klæbende sutur, påføres ureter i trin 5.11.2, gennem den første indsnit i blæren og ud gennem blærevæggen støder op til indgangspunktet. Når ureter passeres gennem blæren vil være bundet til at forankre ureter til blæren.
    6. Placer lange 6 / O sort flettet silke sutur anvendes til enden af ​​ureter i trin 5.10 gennem øjne nål.
    7. Trække forsigtigt øjne nålen ud af blæren og samtidig sikre, at ureter også trækkes gennem blæren.
    8. Når ureter fremgår the blære fjerne øjne nål og anvende en klemme til den lange sutur i slutningen af ​​urinrøret for at forhindre tilbagetrækning tilbage ind i blæren.
    9. For at forankre ureter i plads i blæren, binde 9 / O polyamid monofilament tack sutur, anvendt i trin 5.11.5.
    10. Anvend ekstra enkelt 9 / O polyamid monofilament slips suturer som beskrevet i trin 5.11.2 og 5.11.5 på to steder i indgang til fast forankring ureter i blæren.
    11. Brug bagsiden af ​​åbnede saks, skub blærevæggen lidt tilbage for at blotlægge mere af den emergente ureter.
    12. Opdel ureter over lang sutur placeret i slutningen af ​​ureter. Ureter skal trække i kroppen af ​​blæren. Det er almindeligt at observere urin flyder ud af åbningen i blæren, hvilket bekræfter de åbne lumen af ​​ureter.
    13. Luk exit viklet i blæren med en 9 / O polyamid monofilament sutur.
  12. Sæt forsigtigt tarmene indbughulen.
  13. Giv postoperativ pleje som beskrevet i trin 4,1-4,8.
  14. Lad musen at komme indtil nyren dekomprimeres, typisk 7 dage.
  15. Ved den eksperimentelle slutpunkt, aflive musen ved cervikal dislokation og indsamle nyrerne til histopatologisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udseendet af nyreforandringer markant efter ureteric obstruktion og det bliver blegere og anspændt til palpation med tiden (figur 1). Der er stigende dilatation af ureter proximalt til obstruktion og nyrebækkenet. Nyrerne bliver mere atrofisk som varigheden af ​​obstruktiv nefropati stiger med langvarig obstruktion resulterer i en markant udtynding af renal cortex og medulla. Efter vending af ureteric obstruktion, farven på nyrerne bliver mørkere som blodgennemstrømningen øges og væv ødem løser. Dilatation af ureter og nyrebækkenet i nyrerne aftager selv om de kan være lidt 'baggy' som følge af den periode af langvarig distension (figur 1). De-blokeret nyre er typisk mindre end den kontralaterale nyre som et element af væv atrofi er uundgåelig selvom graden af ​​tab af væv vil afhænge af varigheden af ​​obstruktion.

Histologi af den normale ikke-manipuleret native nyre afslører glomeruli omgivet af kompakte tubuli tubulointerstitiumet med mange tubuli, der har en mærkbar lumen tydelig (figur 2). Efter ureteric obstruktion af udspiling og dilatation af ureter og nyrebækken (figur 1) er ledsaget af stigende dilatation af de renale tubuli, der er let tydeligt på histologi af vævssnit (forstørrede tubuli pile i figur 2). Glomeruli udviser et normalt udseende i denne model med skade og ardannelse begrænset til tubulointerstitiumet. Gradvis og betydelig opløsning af den rørformede udspiling og dilatation følger lindring af ureteric obstruktion selvom nogle tubuli kan forblive forstørrede (figur 2).

Figur 1 Figur 1. Udseende af indfødte, UUO og R-UUO nyrer, nyrebækken og ureter. Male FVB mus undergik ensidig ureteric obstruktion (UUO) i 7 dage. Mus blev enten aflivet eller UUO blev derefter vendt (R-UUO) og nyrer dekomprimeret i 7 dage før aflivning. Images illustrerer udseendet af nyren, renal pelvis, ureter og blære af et nativt, UUO og R-UUO nyre høstet på tidspunktet for aflivning. I sammenligning med den native nyre vises UUO nyre hydronephrotic og bleg farve. Efter de-obstruktion R-UUO nyre har dekomprimeret selvom nyrebækkenet og ureter fortsat en anelse "baggy". Bemærk, at R-UUO ureter er kortere end UUO og indfødte nyre pga fjernelse af blokeret del forud for re-anastomose ind i blæren. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Repræsentant histologi af indfødte, UUO og R-UUO nyrer. Mandlige FVB mus undergik ensidig ureteric obstruktion (UUO) i 7 dage. Mus blev enten aflivet eller UUO blev derefter vendt (R-UUO) og nyrer lov til at dekomprimere 7 dage før aflivning. Repræsentative fotomikrografier (Forstørrelse: X200) af H & E farvet nyresektioner fra ikke-residenter manipuleret indfødte nyre, UUO nyre og R-UUO nyre. Den sunde interstitium af den normale nyre består af normale kompakte tubuli. En række tubuli angivet med pilene udviser signifikant dilatation på dag 7 efter UUO. I modsætning hertil er rørformet dilatation markant reduceret på 7 dage efter tilbageførsel af UUO.blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende eller modstridende interesser at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt Dissecting Scissors Fine Science Tools 14072-10
Spring Scissors – straight Fine Science Tools 15000-10
Toothed forceps Fine Science Tools 11021-12
Angled forceps x 2 Fine Science Tools 00649-11
Straight forceps Fine Science Tools 00632-11
Colibri 3 cm wire retractor Fine Science Tools 17000-03
Castroviejo needle holder with lock Fine Science Tools 12565-14
Wound clip applicator Fine Science Tools 12031-07
7 mm wound clips Fine Science Tools 12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock Fine Science Tools 12060-01
OPMI pico microscope Carl Zeiss S100
Heat electronic pad Cozee Comfort n/a
6/O silk braided suture Harvard Apparatus 72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture B-Braun G1111434
5/O braided silk suture Harvard Apparatus 51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G Becton, Dickinson and Company 305175
1 ml syringe slip tip Becton, Dickinson and Company 300184
Wypall paper swabs Kimberley-Clark L40 Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds Johnson and Johnson n/a Sterilised (Autoclave)
Plain drapes Guardian CB03 Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% Allergan Ltd 21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride Pfizer Animal Health Vm 42058/4165 100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride Orion Pharma Vm 06043/4003 1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride Alsto Animal Health Vm 00063/4002 0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride Orion Pharma Vm 06043/4004 5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin Baxter Adhesion reduction solution
NaCl 0.9% Baxter FKE1323

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
  2. Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
  3. Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
  4. Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
  5. Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
  6. Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
  7. Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
  8. Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
  9. Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
  10. Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
  11. Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
  12. Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
  13. Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
  14. Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
  15. Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
  16. Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
  17. Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
  18. Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
  19. Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).

Tags

Medicine Mus Ensidig ureteric obstruktion irreversibel Vendbar Nyre Hydronefrose Inflammation fibrose
En murin model af Irreversible og reversibel Ensidig ureteric Obstruktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hesketh, E. E., Vernon, M. A., Ding, More

Hesketh, E. E., Vernon, M. A., Ding, P., Clay, S., Borthwick, G., Conway, B., Hughes, J. A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction. J. Vis. Exp. (94), e52559, doi:10.3791/52559 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter