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Medicine

Un modèle murin d'irréversible et réversible unilatérale obstruction urétérale

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52559

Protocol

Directives générales: expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements imposés par les animaux (Scientific Procedures) de Loi 1986. Ce protocole et le protocole de vidéo qui l'accompagne sont à la fois un UUO standard et un R-UUO, qui peut être effectuée sur plusieurs souches de souris. Dans la vidéo d'accompagnement, les deux procédures sont effectuées sur des souris C57BL / 6 mâles âgées de 8 semaines les souris. Les données présentées dans la section des résultats représentatifs ont été obtenus auprès de sexe masculin souris FVB / n.

NOTE: Ce protocole et accompagner détails de la vidéo comment effectuer une UUO standard et R-UUO utilisant l'uretère gauche, mais les mêmes techniques peuvent facilement être appliqués à l'uretère droit.

1. Préparation des animaux et la laparotomie

  1. Effectuer toutes les procédures avec les instruments et consommables stériles (autoclave).
  2. Injecter chlorhydrate de kétamine (70 mg / kg) et du chlorhydrate de médétomidine (1 mg / kg) par voie intraperitoneale à anesthésierla souris. Remarque: La durée de l'anesthésie plan résultant est de 4 heures et pas d'anesthésie supplémentaire ne est nécessaire.
  3. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par la perte des réflexes, par exemple pincement de l'orteil.
  4. Retirez tous les cheveux entourant la zone d'incision et de préparer la peau pour la chirurgie abdominale via l'application d'une solution diluée de chlorhexidine.
  5. Placez la souris sur un bloc chirurgical chauffé dans une position couchée et fixer les membres à l'aide de ruban adhésif pad à faible adhérence.
  6. Durant la procédure, surveiller la souris les signes de brûlures thermiques en raison du tampon chirurgical chauffé. Si possible, utilisez une source de chaleur non-électrique.
  7. Administrer un analgésique par injection sous-cutanée de chlorhydrate de buprénorphine (0,06 mg / kg) et appliquer du lubrifiant oculaire pour éviter un dessèchement de la cornée.
  8. Faire une laparotomie médiane et une incision de la linea alba avasculaire l'aide de ciseaux de tissu de séparation pour accéder à la cavité péritonéale.
  9. Drapé de la souris et insérer un colibrirétracteur dans l'incision.

2. unilatérale obstruction urétérale

  1. Utilisation de bourgeons de coton stérilisés exposer l'uretère gauche en déplaçant les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale et les couvrir avec des rideaux humides.
  2. En utilisant des pinces angulaires isoler et soulever l'uretère gauche.
  3. Pour créer une obstruction urétérale, ligaturer l'uretère gauche deux fois avec 6 / O noir tressé de soie suture ne importe où entre la vessie et du bassinet du rein. Pour les expériences à long terme, utiliser suture absorbable pour toutes les chirurgies abdominales. En variante, une pince de ligature peut être appliquée à l'uretère.
  4. Pour isoler la vessie de l'uretère, diviser l'uretère entre les deux points de suture.
  5. Replacez soigneusement les intestins dans la cavité péritonéale.
  6. Suivez les étapes énumérées à la section 4 - récupération post-opératoire et des Soins de fermer l'incision et d'inverser l'anesthésie.

3. Préparation pour Reversible unilatérale obstruction urétérale

  1. Préparer une souris pour la chirurgie et d'isoler l'uretère gauche comme indiqué dans les étapes 1.1 à 2.2 ci-dessus.
  2. Pour créer une obstruction urétérale qui peut être inversée, ligaturer l'uretère gauche deux fois avec 6 / O noir tressé de soie suture près de la vessie. Laissez une extrémité de la suture supérieure tant que ce sera utilisé pour ancrer le tube en plastique à paroi souple en place autour de l'uretère.
  3. Faire une fente longitudinale sur une longueur de 5 mm de tube en plastique à paroi souple de manière à pouvoir être évasée ouverte pour lui permettre d'être appliqué à l'uretère. De préférence un tube en plastique à paroi souple en silicone, avec un diamètre interne de 1 mm et un diamètre externe de 2 mm, peut être utilisé.
  4. Placez le tube en plastique à paroi souple doucement autour de l'uretère. Se assurer que le fil de suture longue émerge du centre de la fente dans le tube une fois qu'il est fermé autour de l'uretère.
  5. Placez une longueur de 6 / O noire tressée suture de soie autour du tube à paroi souple enfermant l'uretère et cravateune fois. Maintenant, placer l'extrémité longue du fil de suture, émergeant du centre de la fente dans le tube, longitudinalement à travers le tube de telle sorte qu'il se trouve au-dessus de la suture attachée précédemment.
  6. Attacher le fil de suture autour du tube situé à deux reprises pour ancrer le tube et l'extrémité de fil de suture longue en place autour de l'uretère.
    Remarque: Pour éviter la formation d'adhérences sur l'uretère et le tube en plastique à paroi souple, d'une solution de réduction de l'adhérence peut être appliqué à la zone autour du tube.
  7. Replacez soigneusement les intestins dans la cavité péritonéale.

4. récupération post-opératoire et des Soins

  1. Fermez le péritoine avec point de feston utilisant 5 / O noire tressée suture de soie et de se rapprocher de la peau à l'aide des clips métalliques de la peau.
  2. Pour minimiser le risque d'infection post-opératoire, appliquez un antiseptique comme solution d'iode / alcool pour la peau abdominale.
  3. Partiellement anesthésie inverse avec le chlorhydrate d'atipamézole (2 mg / kg) sous-cutanée. Administrer des fluides par une injection sous-cutanée de 1 ml de solution saline chauffée.
  4. Surveiller la souris jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance.
  5. Laisser la souris pour récupérer dans une boîte chauffée maintenue à 29 ° C pendant 24 heures. Nourriture humide peut également être fournie pour encourager l'apport hydrique et de la nutrition.
  6. Laissez la souris pour récupérer pour induire un niveau souhaité de l'obstruction, généralement sept jours.
  7. Pour les expériences de reconstitution à long terme, fournir des analgésiques en cours. Si la souris est à récupérer pendant plus de sept jours, retirez les clips de la peau 7 jours après la chirurgie.
  8. Une fois le niveau de l'obstruction désiré a été induite, soit inverser la UUO, comme décrit ci-dessous, ou euthanasier la souris par dislocation cervicale et de recueillir les reins pour l'analyse de l'histopathologie.

5. réversible unilatérale obstruction urétérale

  1. Pour effectuer une R-UUO préparer une souris, qui a subi une préparation pour le R-UUO, pour une chirurgie tel que décrit dans les étapes 1De 0,1 à 1,7.
  2. Se il est présent, retirez les clips de la peau et de diviser ou de retirer les points de suture dans le péritoine pour accéder à la cavité abdominale. Remarque: Si l'uretère a été obstrué pendant long terme clips de la peau de l'expérience aurait dû être retiré sept jours suivant l'application.
  3. Préparer la souris et isoler l'uretère gauche de la manière décrite dans les étapes 1,8 à 2,2.
  4. En utilisant des pinces angulaires, libérer le tube en plastique à paroi souple de tout tissu de granulation qui peuvent avoir formé.
  5. Couper le fil de suture en tenant le tuyau plastique autour de l'uretère obstrué avec un scalpel et retirer le tube.
  6. Confirmez succès UUO en évaluant la présence d'hydronéphrose dans le rein gauche, le rein devrait également apparaître pâle.
  7. Diviser l'uretère entre les sutures.
  8. Passer la longueur restante de l'uretère, le rein attaché à, sur un petit morceau de gaze stérile. Il sera utilisé pour recueillir le sédiment urinaire et les cellules mortes qui se écouler de l'uretère unee bassinet une fois la suture sont enlevés.
  9. Diviser l'uretère ci-dessus, mais à proximité, la suture et permettre le rein se écouler sur la gaze. Laissez la suture inférieure, plus proche de la vessie, intacte. Il se agit de se assurer qu'aucune fuite urine provenant de la vessie et dans la cavité peritoneale.
  10. Une fois l'uretère et bassinet du rein ont été drainés, appliquez une longue 6 / O noire tressée suture de soie à la fin de la durée restante de l'uretère. Il sera utilisé pour aider l'uretère anastomose de la vessie réalisée plus tard.
  11. Suivez les étapes ci-dessous pour anastomoser la longueur restante de l'uretère dans la vessie:
    1. Mettre l'uretère tel qu'il se trouve en avant de sa position d'origine et se trouve sur le rein.
    2. Placer un unique 9 / O polyamide monofilament pointage suture 2 mm de l'extrémité de l'uretère de telle sorte qu'il émerge dans la direction de la vessie. Veillez à ce que la suture reste dans la couche musculaire et ne entre pas dans la lumière de l'uretère. Le wil pointage de suturel être utilisé pour ancrer l'uretère dans la vessie.
    3. Pour créer un canal à travers la vessie, passer une aiguille de 21G en diagonale à travers la vessie de telle sorte que sa sortie vers l'avant (ventrale) paroi de la vessie.
    4. Reste une aiguille à chas dans le biseau de l'aiguille 21G. Utilisez l'aiguille de 21G pour guider l'aiguille yeux à travers la vessie. L'aiguille à chas sera utilisé pour prendre l'uretère à travers la vessie.
    5. Faire passer le fil de suture 9 adhésivité / O, appliqué à l'uretère à l'étape 5.11.2, à travers la première incision dans la vessie et à travers la paroi de la vessie adjacente au point d'entrée. Une fois l'uretère est passé à travers la vessie ce sera liée à ancrer l'uretère à la vessie.
    6. Placer la longue 6 / O noire tressée suture de soie appliqué à la fin de l'uretère à l'étape 5.10 borgne à travers l'aiguille.
    7. Retirer délicatement l'aiguille yeux hors de la vessie tout en garantissant que l'uretère est également tiré à travers la vessie.
    8. Une fois l'uretère se dégage de the vessie retirer l'aiguille yeux et appliquer une pince à suture long à la fin de l'uretère pour empêcher la rétraction en arrière dans la vessie.
    9. Pour ancrer au sein de l'uretère dans la vessie, attacher le 9 / O polyamide monofilament amure suture, appliquée à l'étape 5.11.5.
    10. Appliquer sutures monofilament de liaison supplémentaires simples 9 / O de polyamide comme décrit dans les étapes 5.11.2 et 5.11.5 à deux endroits à travers le point d'entrée pour ancrer fermement l'uretère dans la vessie.
    11. Avec le dos de ciseaux ouverts, pousser la paroi de la vessie légèrement en arrière pour exposer davantage de l'uretère émergente.
    12. Diviser l'uretère-dessus de la longue suture située à l'extrémité de l'uretère. L'uretère doit se rétracter dans le corps de la vessie. Il est habituel d'observer l'urine se écoulant hors de l'ouverture dans la vessie, ce qui confirme la lumière de l'uretère ouverts.
    13. Fermez la sortie des plaies dans la vessie avec un polyamide suture monofilament 9 / O.
  12. Replacez soigneusement les intestins enla cavité péritonéale.
  13. Fournir des soins post-opératoire comme indiqué dans les étapes 4.1 à 4.8.
  14. Laisser la souris pour récupérer jusqu'à ce que le rein est décompressé, généralement sept jours.
  15. Au point de fin expérimentale, euthanasier la souris par dislocation cervicale et de recueillir les reins pour l'analyse histopathologique.

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Representative Results

L'apparition des modifications rénales nettement suivante obstruction urétérale et il devient plus pâle et tendu à la palpation avec le temps (Figure 1). Il est de plus en plus la dilatation de l'urètre proximal à l'obstruction et le bassinet du rein. Le rein devient de plus en plus atrophique que la durée de néphropathie obstructive augmente avec obstruction prolongée entraîne un amincissement notable de la moelle et le cortex rénal. Après le renversement de l'obstruction de l'uretère, la couleur du rein devient plus sombre que le débit augmente de sang et décide de l'oedème des tissus. La dilatation de l'uretère du rein et du bassinet du rein disparaît bien qu'ils puissent rester légèrement "bouffant" en raison de la période prolongée de distension (figure 1). L'obstruction de-rein est typiquement plus petit que le rein controlatéral comme un élément de l'atrophie du tissu est inévitable, bien que le degré de perte de tissu dépend de la durée de l'obstruction.

L'histologie du rein natif non manipulée normale révèle glomérules entourées par les tubules compactes du compartiment tubulo-interstitiel de nombreux tubules ayant une lumière visible évidente (figure 2). Suite à une obstruction urétérale la distension et la dilatation de l'uretère et du bassinet du rein (Figure 1) est accompagnée par une augmentation de la dilatation des tubules rénaux qui est facilement évident histologie sur des coupes de tissus (tubules dilatés indiquée par une flèche sur la figure 2). Le glomérules présentent un aspect normal dans ce modèle avec des blessures et des cicatrices confiné à la tubulo-interstitiel. La résolution progressive et significative de la distension tubulaire et la dilatation suit la levée de l'obstacle urétéral si certains tubules peuvent rester dilatés (Figure 2).

Figure 1 Figure 1. Apparition de UUO, et R-UUO reins, du bassin et de l'uretère rénales indigènes. FVB souris mâles subi une obstruction urétérale unilatérale (UUO) pendant 7 jours. Les souris ont été sacrifiées soit ou UUO a ensuite été inversés (R-UUO) et les reins décompressés pendant 7 jours avant sacrifice. Images illustrent l'apparition du rein, du bassinet, de l'uretère et de la vessie d'un, et R-UUO UUO rein natif récolté au moment du sacrifice. En comparaison avec le rein natif du rein UUO apparaît hydronéphrotique et de couleur pâle. Après de-obstruction du rein R-UUO a décompressé si le bassinet du rein et l'uretère restent légèrement «ample». Notez que l'uretère R-UUO est plus courte que la UUO et le rein natif raison de l'élimination de la partie obstruée avant de re-anastomose dans la vessie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. histologie, représentant de UUO et R-UUO reins indigènes. FVB souris mâles subi une obstruction urétérale unilatérale (UUO) pendant 7 jours. Les souris ont été sacrifiées soit ou UUO a ensuite été inversés (R-UUO) et les reins autorisés à décompresser pendant 7 jours avant le sacrifice. Photomicrographies représentatives (grossissement: x200) de H & E colorées sections de rein à partir du rein natif de contrôle non manipulé, UUO reins et R-UUO rein. Le interstitium santé du rein normal est composé de tubes compacts normaux. Un certain nombre de tubules indiqués par les flèches présentent une dilatation significative au jour 7 suivant une UUO. En revanche, dilatation tubulaire est nettement réduite à 7 jours suivant la reprise de UUO.blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Disclosures

Les auteurs ne ont pas des intérêts concurrents ou de divulguer contradictoires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt Dissecting Scissors Fine Science Tools 14072-10
Spring Scissors – straight Fine Science Tools 15000-10
Toothed forceps Fine Science Tools 11021-12
Angled forceps x 2 Fine Science Tools 00649-11
Straight forceps Fine Science Tools 00632-11
Colibri 3 cm wire retractor Fine Science Tools 17000-03
Castroviejo needle holder with lock Fine Science Tools 12565-14
Wound clip applicator Fine Science Tools 12031-07
7 mm wound clips Fine Science Tools 12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock Fine Science Tools 12060-01
OPMI pico microscope Carl Zeiss S100
Heat electronic pad Cozee Comfort n/a
6/O silk braided suture Harvard Apparatus 72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture B-Braun G1111434
5/O braided silk suture Harvard Apparatus 51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G Becton, Dickinson and Company 305175
1 ml syringe slip tip Becton, Dickinson and Company 300184
Wypall paper swabs Kimberley-Clark L40 Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds Johnson and Johnson n/a Sterilised (Autoclave)
Plain drapes Guardian CB03 Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% Allergan Ltd 21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride Pfizer Animal Health Vm 42058/4165 100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride Orion Pharma Vm 06043/4003 1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride Alsto Animal Health Vm 00063/4002 0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride Orion Pharma Vm 06043/4004 5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin Baxter Adhesion reduction solution
NaCl 0.9% Baxter FKE1323

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References

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Hesketh, E. E., Vernon, M. A., Ding, More

Hesketh, E. E., Vernon, M. A., Ding, P., Clay, S., Borthwick, G., Conway, B., Hughes, J. A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction. J. Vis. Exp. (94), e52559, doi:10.3791/52559 (2014).

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