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अपरिवर्तनीय और प्रतिवर्ती एकतरफा ureteric रुकावट के एक murine मॉडल

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52559
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1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh

Protocol

सामान्य मार्गदर्शन: पशु प्रयोगों पशु द्वारा लगाए गए दिशा-निर्देशों और नियमों के अनुसार (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के इस प्रोटोकॉल और कई पर प्रदर्शन किया जा सकता है, जो साथ वीडियो प्रोटोकॉल एक मानक UUO और एक आर-UUO दोनों के लिए कर रहे हैं, में प्रदर्शन किया गया माउस उपभेदों। साथ वीडियो में, दोनों प्रक्रियाओं पुरुष C57BL / 6 चूहों आयु वर्ग के 8 सप्ताह पर प्रदर्शन कर रहे हैं। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत आंकड़ों पुरुष FVB / एन चूहों से प्राप्त किया गया।

नोट: इस प्रोटोकॉल और कैसे एक मानक UUO प्रदर्शन और आर-UUO बाईं मूत्रवाहिनी का उपयोग करने के लिए वीडियो विवरण के साथ, लेकिन एक ही तकनीक आसानी से सही मूत्रवाहिनी के लिए लागू किया जा सकता है।

1. पशु तैयारी और Laparotomy

  1. बाँझ (autoclaved) यंत्र और उपभोग्य के साथ सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।
  2. Anesthetize को intraperitoneally ketamine हाइड्रोक्लोराइड (70mg / किग्रा) और medetomidine हाइड्रोक्लोराइड (1mg / किग्रा) इंजेक्षनमाउस। नोट: जिसके परिणामस्वरूप संवेदनाहारी विमान की अवधि चार घंटा है और कोई पूरक संज्ञाहरण की आवश्यकता है।
  3. सजगता जैसे, पैर के अंगूठे चुटकी के नुकसान से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
  4. चीरा क्षेत्र के आसपास के सभी बाल निकालें और एक पतला chlorhexidine समाधान के आवेदन के माध्यम से सर्जरी के लिए पेट की त्वचा तैयार करते हैं।
  5. एक लापरवाह स्थिति में एक गर्म शल्य पैड पर माउस रखें और कम कील चिपकने वाला टेप का उपयोग पैड करने के अंगों को ठीक।
  6. प्रक्रिया के दौरान, गर्म शल्य पैड का एक परिणाम के रूप में थर्मल जलता के संकेत के लिए माउस की निगरानी। यदि संभव हो तो एक गैर-बिजली के गर्मी स्रोत का उपयोग करें।
  7. Buprenorphine हाइड्रोक्लोराइड (0.06mg / किग्रा) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा एनाल्जेसिक प्रशासन और corneal सुखाने को रोकने के लिए नेत्र स्नेहक लागू होते हैं।
  8. एक midline laparotomy और peritoneal गुहा के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए ऊतक को अलग कैंची का उपयोग avascular LINEA अल्बा के एक चीरा बनाओ।
  9. माउस कपड़ा और एक COLIBRI डालनेचीरा में प्रतिकर्षक।

2. एकतरफा ureteric बाधा

  1. निष्फल कपास की कलियों का प्रयोग उदर गुहा के सही पक्ष की ओर से आंतों विस्थापित द्वारा छोड़ा मूत्रवाहिनी बेनकाब और सिक्त पर्दे के साथ उन्हें कवर।
  2. कोणीय संदंश अलग और बाएं मूत्रवाहिनी लिफ्ट का उपयोग करना।
  3. एक ureteric रुकावट पैदा करने के लिए, कहीं भी मूत्राशय और गुर्दे श्रोणि के बीच 6 / ओ काली लट रेशम सीवन के साथ दो बार छोड़ दिया मूत्रवाहिनी ligate। लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए, सभी पेट की सर्जरी के लिए absorbable सीवन का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एक ligating क्लिप मूत्रवाहिनी के लिए लागू किया जा सकता है।
  4. मूत्रवाहिनी से मूत्राशय को अलग-थलग करने के लिए, दो टांके के बीच मूत्रवाहिनी विभाजित करते हैं।
  5. ध्यान से पेरिटोनियल गुहा में आंतों की जगह।
  6. धारा 4 में सूचीबद्ध चरणों का पालन - पोस्ट ऑपरेटिव वसूली और देखभाल चीरा को बंद करने और संज्ञाहरण रिवर्स करने के लिए।

Reversibl के लिए 3. तैयारीई एकतरफा ureteric बाधा

  1. सर्जरी के लिए एक माउस को तैयार है और कदम से ऊपर 1.1-2.2 में विस्तृत रूप में छोड़ दिया मूत्रवाहिनी अलग।
  2. उलट हो सकता है कि एक ureteric रुकावट पैदा करने के लिए, मूत्राशय के करीब 6 / ओ काली लट रेशम सीवन के साथ दो बार छोड़ दिया मूत्रवाहिनी ligate। इस मूत्रवाहिनी के आसपास जगह में मुलायम घिरी प्लास्टिक टयूबिंग लंगर के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जब तक कि ऊपरी सिवनी के एक छोर छोड़ दें।
  3. यह यह मूत्रवाहिनी के लिए लागू किया जा करने की अनुमति के लिए खुला splayed जा सकता है कि इस तरह के नरम घिरी प्लास्टिक टयूबिंग की एक 5mm लंबाई में एक अनुदैर्ध्य भट्ठा बनाओ। 1mm और 2mm की बाहरी व्यास की एक आंतरिक व्यास के साथ किसी भी नरम घिरी सिलिकॉन प्लास्टिक टयूबिंग, इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. मूत्रवाहिनी के आसपास धीरे नरम घिरी प्लास्टिक टयूबिंग रखें। यह मूत्रवाहिनी के आसपास बंद कर दिया है एक बार लंबे सिवनी ट्यूबिंग में भट्ठा के केंद्र से उभर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  5. मूत्रवाहिनी enclosing मुलायम घिरी ट्यूबिंग लगभग 6 / ओ काली लट रेशम सीवन की लंबाई प्लेस और टाईवंस। अब अनुलंबीय यह पहले से बंधे सिवनी के शीर्ष पर स्थित है कि इस तरह के ट्यूबिंग के पार, ट्यूबिंग में भट्ठा के केंद्र से उभर, सिवनी की लंबी अंत जगह है।
  6. ट्यूबिंग और मूत्रवाहिनी के आसपास जगह में लंबे सिवनी अंत लंगर के लिए दो बार ट्यूबिंग के आसपास स्थित सिवनी बाँधो।
    नोट: मूत्रवाहिनी और मुलायम घिरी प्लास्टिक टयूबिंग पर आसंजन गठन को रोकने के लिए, एक आसंजन कमी समाधान ट्यूबिंग के आसपास के क्षेत्र के लिए लागू किया जा सकता है।
  7. ध्यान से पेरिटोनियल गुहा में आंतों की जगह।

4. पोस्ट ऑपरेटिव वसूली और देखभाल

  1. 5 / ओ काली लट रेशम सीवन का उपयोग कर कंबल सिलाई के साथ पेरिटोनियम बंद करो और धातु त्वचा क्लिप का उपयोग त्वचा अनुमानित।
  2. पोस्ट ऑपरेटिव संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए, पेट की त्वचा के लिए आयोडीन / शराब समाधान के रूप में एक एंटीसेप्टिक ऐसे लागू होते हैं।
  3. Subcutaneously atipamezole हाइड्रोक्लोराइड (2mg / किग्रा) के साथ आंशिक रूप रिवर्स संज्ञाहरण। 1 मिलीलीटर की एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा तरल पदार्थ प्रशासन खारा गरम।
  4. यह चेतना बरामद किया है जब तक माउस मॉनिटर।
  5. माउस के 24 घंटे के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर रखा एक गर्म बॉक्स में ठीक करने के लिए अनुमति दें। सिक्त भोजन भी तरल पदार्थ और पोषण सेवन को प्रोत्साहित करने के लिए प्रदान किया जा सकता है।
  6. रुकावट के एक वांछित स्तर, आम तौर पर 7 दिनों के लिए प्रेरित करने के लिए ठीक करने के लिए माउस छोड़ दें।
  7. लंबी अवधि वसूली प्रयोगों के लिए, चल रही दर्दनाशक दवाओं प्रदान करते हैं। माउस अब से 7 दिनों के लिए ठीक किया जा रहा है, त्वचा क्लिप सर्जरी के बाद 7 दिनों हटा दें।
  8. रुकावट के वांछित स्तर प्रेरित किया गया है, या तो नीचे वर्णित के रूप में, UUO रिवर्स, या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize और ऊतकविकृतिविज्ञानी विश्लेषण के लिए गुर्दे इकट्ठा।

5. प्रतिवर्ती एकतरफा ureteric बाधा

  1. चरणों में वर्णित के रूप में एक आर-UUO सर्जरी के लिए, आर UUO के लिए तैयार करने आया है जो एक माउस, तैयार करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए एक0.1-1.7।
  2. अगर मौजूद है, त्वचा क्लिप को हटाने और विभाजित या उदर गुहा के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए पेरिटोनियम में टांके हटा दें। नोट: मूत्रवाहिनी एक लंबे समय तक प्रयोग त्वचा क्लिप के लिए बाधित कर दिया गया है, तो आवेदन के बाद 7 दिनों हटा दिया गया है चाहिए।
  3. माउस को तैयार है और चरणों 1.8-2.2 में वर्णित के रूप में छोड़ दिया मूत्रवाहिनी अलग।
  4. कोणीय संदंश का प्रयोग, गठन हो सकता है जो किसी भी granulomatous ऊतक से नरम घिरी प्लास्टिक टयूबिंग मुक्त।
  5. एक स्केलपेल के साथ बाधित मूत्रवाहिनी के आसपास प्लास्टिक टयूबिंग पकड़े सिवनी काटें और ट्यूबिंग को हटा दें।
  6. बाएं गुर्दे में hydronephrosis की उपस्थिति के लिए आकलन करके सफल UUO की पुष्टि करें, गुर्दे भी पीला दिखाई देनी चाहिए।
  7. टांके के बीच मूत्रवाहिनी फूट डालो।
  8. बाँझ धुंध के एक छोटे से टुकड़े पर, गुर्दे से जुड़ी मूत्रवाहिनी के शेष लंबाई, रखें। इस मूत्रवाहिनी एक से पलायन होगा कि मूत्र तलछट और मृत कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगाएन डी सीवन एक बार गुर्दे श्रोणि निकाल दिया जाता है।
  9. इसके बाद के संस्करण मूत्रवाहिनी फूट डालो, लेकिन निकट, सिवनी और गुर्दे की धुंध पर पलायन करने की अनुमति देते हैं। मूत्राशय के लिए निकटतम, अक्षत, कम सिवनी छोड़ दें। यह कोई मूत्र मूत्राशय से और peritoneal गुहा में रिसाव जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए है।
  10. मूत्रवाहिनी और गुर्दे श्रोणि सूखा किया गया है एक बार, मूत्रवाहिनी की शेष लंबाई के अंत के लिए एक लंबा 6 / ओ काली लट रेशम सीवन लागू होते हैं। यह बाद में प्रदर्शन किया मूत्राशय सम्मिलन के लिए मूत्रवाहिनी सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  11. मूत्राशय में मूत्रवाहिनी की शेष लंबाई anastomose करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें:
    1. यह अपनी मूल स्थिति के लिए पूर्वकाल निहित है और गुर्दे के ऊपर स्थित है कि इस तरह के मूत्रवाहिनी मुड़ें।
    2. यह मूत्राशय की दिशा में उभर रहे हैं कि इस तरह के मूत्रवाहिनी के अंत से एक भी 9 / ओ पॉलियामाइड monofilament tacking सिवनी 2 मिमी रखें। सिवनी पेशी कोट में रहता है और मूत्रवाहिनी लुमेन में प्रवेश नहीं करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना। tacking सिवनी wilएल मूत्राशय में मूत्रवाहिनी लंगर के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    3. मूत्राशय के माध्यम से एक चैनल बनाने के लिए, यह मूत्राशय के ललाट (उदर) दीवार की ओर से बाहर निकालता है कि इस तरह के मूत्राशय के माध्यम से तिरछे एक 21G सुई से गुजरती हैं।
    4. 21G सुई के उठाव में एक आंखों सुई आराम करें। मूत्राशय के माध्यम से आंखों सुई मार्गदर्शन करने के लिए 21G सुई का प्रयोग करें। आंखों सुई मूत्राशय के माध्यम से मूत्रवाहिनी लेने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    5. 9 / ओ tacking सिवनी दर्रा, मूत्राशय में और बाहर प्रवेश बिंदु से सटे मूत्राशय की दीवार के माध्यम से पहली चीरा के माध्यम से, कदम 5.11.2 में मूत्रवाहिनी के लिए आवेदन किया। मूत्रवाहिनी मूत्राशय के माध्यम से पारित हो जाने के बाद इस मूत्राशय से मूत्रवाहिनी लंगर के लिए करार हो जाएगा।
    6. आंखों सुई के माध्यम से कदम 5.10 में मूत्रवाहिनी के अंत करने के लिए आवेदन लंबे समय 6 / ओ काली लट रेशम सीवन रखें।
    7. ध्यान से मूत्रवाहिनी भी मूत्राशय के माध्यम से खींच लिया है कि यह सुनिश्चित करने whilst के मूत्राशय से बाहर आंखों सुई वापस ले लें।
    8. मूत्रवाहिनी वें से उभर एक बारई मूत्राशय आंखों सुई को हटाने और वापस मूत्राशय में त्याग को रोकने के लिए मूत्रवाहिनी के अंत में लंबे समय से सिवनी के लिए एक क्लैंप लागू होते हैं।
    9. मूत्राशय में जगह के भीतर मूत्रवाहिनी लंगर के लिए, कदम 5.11.5 में लागू 9 / ओ पॉलियामाइड monofilament कील सिवनी, टाई।
    10. मजबूती से मूत्राशय के भीतर मूत्रवाहिनी लंगर के लिए प्रवेश बिंदु के आसपास दो स्थानों पर चरणों 5.11.2 और 5.11.5 में वर्णित के रूप में अतिरिक्त एकल 9 / ओ पॉलियामाइड monofilament टाई टांके लागू करें।
    11. खोला कैंची के पीछे का उपयोग आकस्मिक मूत्रवाहिनी के अधिक बेनकाब करने के लिए वापस थोड़ा मूत्राशय दीवार धक्का।
    12. मूत्रवाहिनी के अंत में स्थित लंबे समय सिवनी से ऊपर मूत्रवाहिनी फूट डालो। मूत्रवाहिनी मूत्राशय के शरीर में वापस लेना चाहिए। यह मूत्रवाहिनी के खुले लुमेन, पुष्टि मूत्राशय में खोलने से बाहर बहने मूत्र निरीक्षण करने के लिए सामान्य है।
    13. एक 9 / ओ पॉलियामाइड monofilament सीवन के साथ मूत्राशय में घाव से बाहर निकलें बंद करें।
  12. ध्यान में आंतों की जगहपेरिटोनियल गुहा।
  13. चरणों 4.1-4.8 में विस्तृत रूप में पोस्ट ऑपरेटिव केयर प्रदान करें।
  14. गुर्दा 7 दिनों आम तौर पर, decompressed है जब तक माउस को ठीक करने के लिए अनुमति दें।
  15. प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize और histopathological विश्लेषण के लिए गुर्दे इकट्ठा।

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Representative Results

गुर्दे परिवर्तन की उपस्थिति स्पष्ट रूप से ureteric रुकावट के बाद और यह पीला और समय के साथ टटोलने का कार्य करने के लिए तनाव (चित्रा 1) हो जाता है। रुकावट और गुर्दे श्रोणि को मूत्रवाहिनी समीपस्थ की बढ़ती फैलने है। गुर्दे वृक्क छाल और मज्जा के एक चिह्नित thinning में जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक रुकावट के साथ प्रतिरोधी नेफ्रोपैथी बढ़ जाती है की अवधि के रूप में तेजी से एट्रोफिक हो जाता है। Ureteric रुकावट के पलटने के बाद, गुर्दे का रंग रक्त प्रवाह बढ़ता है और ऊतक शोफ हल के रूप में गहरा हो जाता है। वे लंबे समय तक बढ़ाव की अवधि (चित्रा 1) का एक परिणाम के रूप में थोड़ा 'बैगी' रह सकती है, हालांकि गुर्दे की मूत्रवाहिनी और गुर्दे श्रोणि के फैलने उतरे। ऊतक के नुकसान की डिग्री बाधा की अवधि पर निर्भर करेगा हालांकि ऊतक शोष का एक तत्व अनिवार्य है के रूप में डे-बाधित गुर्दे प्रतिपक्षी गुर्दे की तुलना में आम तौर पर छोटा होता है।

सामान्य गैर चालाकी से देशी गुर्दे के ऊतक विज्ञान कई नलिकाओं स्पष्ट (चित्रा 2) लुमेन एक नमूदार होने के साथ tubulointerstitium की कॉम्पैक्ट नलिकाओं से घिरा ग्लोमेरुली का पता चलता है। Ureteric रुकावट मूत्रवाहिनी और गुर्दे श्रोणि (चित्रा 1) के बढ़ाव और फैलने के बाद (फैली हुई नलिकाओं चित्रा 2 में arrowed) ऊतक वर्गों के ऊतक विज्ञान पर आसानी से स्पष्ट है कि गुर्दे की नलिकाओं के फैलने में वृद्धि के साथ है। ग्लोमेरुली tubulointerstitium तक ही सीमित चोट और scarring के साथ इस मॉडल में एक सामान्य उपस्थिति दिखा रहे हैं। कुछ नलिकाओं (चित्रा 2) फैली हुई रह सकती है, हालांकि ट्यूबलर बढ़ाव और फैलने की क्रमिक और महत्वपूर्ण संकल्प ureteric रुकावट के राहत निम्नानुसार है।

चित्रा 1 चित्रा देशी, UUO और आर-UUO गुर्दे, गुर्दे श्रोणि और मूत्रवाहिनी की 1. सूरत। नर FVB चूहों 7 दिनों के लिए एकतरफा ureteric बाधा (UUO) कराना पड़ा। चूहे या तो बलिदान किया गया या UUO तो (आर-UUO) उलट गया था और गुर्दे बलिदान से पहले 7 दिनों के लिए decompressed। छवियाँ बलिदान के समय में काटा एक देशी, UUO और आर-UUO गुर्दे के गुर्दे, गुर्दे श्रोणि, मूत्रवाहिनी और मूत्राशय की उपस्थिति दर्शाते हैं। देशी गुर्दे की तुलना में UUO गुर्दे रंग में hydronephrotic और पीला दिखाई देता है। गुर्दे श्रोणि और मूत्रवाहिनी थोड़ा 'बैगी' बने हुए हैं, हालांकि डे-बाधा के बाद आर-UUO गुर्दे decompressed गया है। आर-UUO मूत्रवाहिनी के कारण मूत्राशय में-सम्मिलन फिर से करने से पहले बाधित हिस्से को हटाने के लिए UUO और देशी गुर्दे की तुलना में कम है कि नोटिस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. देशी, UUO और आर-UUO गुर्दे के प्रतिनिधि ऊतक विज्ञान। नर FVB चूहों 7 दिनों के लिए एकतरफा ureteric बाधा (UUO) कराना पड़ा। चूहे या तो बलिदान किया गया या UUO तो (आर-UUO) उलट गया था और गुर्दे बलिदान से पहले 7 दिनों के लिए दबाव हटाना करने की अनुमति दी। प्रतिनिधि photomicrographs: एच एंड ई की (आवर्धन X200) नियंत्रण गैर चालाकी से देशी गुर्दे, UUO गुर्दे और आर-UUO गुर्दे से गुर्दे वर्गों दाग। सामान्य गुर्दे के स्वस्थ interstitium सामान्य कॉम्पैक्ट नलिकाओं के शामिल है। तीर द्वारा संकेत नलिकाओं का एक नंबर UUO अगले दिन 7 में महत्वपूर्ण फैलने दिखा रहे हैं। इसके विपरीत, ट्यूबलर फैलने स्पष्ट रूप से UUO के पलटने के बाद 7 दिनों में कम हो जाता है।"रिक्त> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा या खुलासा करने के हितों के परस्पर विरोधी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt Dissecting Scissors Fine Science Tools 14072-10
Spring Scissors – straight Fine Science Tools 15000-10
Toothed forceps Fine Science Tools 11021-12
Angled forceps x 2 Fine Science Tools 00649-11
Straight forceps Fine Science Tools 00632-11
Colibri 3 cm wire retractor Fine Science Tools 17000-03
Castroviejo needle holder with lock Fine Science Tools 12565-14
Wound clip applicator Fine Science Tools 12031-07
7 mm wound clips Fine Science Tools 12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock Fine Science Tools 12060-01
OPMI pico microscope Carl Zeiss S100
Heat electronic pad Cozee Comfort n/a
6/O silk braided suture Harvard Apparatus 72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture B-Braun G1111434
5/O braided silk suture Harvard Apparatus 51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G Becton, Dickinson and Company 305175
1 ml syringe slip tip Becton, Dickinson and Company 300184
Wypall paper swabs Kimberley-Clark L40 Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds Johnson and Johnson n/a Sterilised (Autoclave)
Plain drapes Guardian CB03 Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% Allergan Ltd 21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride Pfizer Animal Health Vm 42058/4165 100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride Orion Pharma Vm 06043/4003 1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride Alsto Animal Health Vm 00063/4002 0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride Orion Pharma Vm 06043/4004 5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin Baxter Adhesion reduction solution
NaCl 0.9% Baxter FKE1323

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References

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Hesketh, E. E., Vernon, M. A., Ding, … More

Hesketh, E. E., Vernon, M. A., Ding, P., Clay, S., Borthwick, G., Conway, B., Hughes, J. A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction. J. Vis. Exp. (94), e52559, doi:10.3791/52559 (2014).

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