Protocol
Guida Generale: Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti imposti dagli Animali (Procedure Scientifiche) Act 1986. Questo protocollo e il protocollo video che accompagna sono sia un UUO standard e un R-UUO, che può essere eseguita su molti ceppi di topi. Nel video che accompagna, entrambe le procedure sono effettuate su maschi C57BL / 6 topi di età compresa tra 8 settimane. I dati presentati nella sezione risultati rappresentativi sono stati ottenuti da maschi FVB / n topi.
NOTA: Questo protocollo e accompagnamento dettagli video come eseguire un UUO standard R-UUO utilizzando dell'uretere sinistro, ma le stesse tecniche possono essere facilmente applicati al dell'uretere destra.
1. Preparazione animali e laparotomia
- Eseguire tutte le procedure con (autoclave) gli strumenti e materiali di consumo sterili.
- Iniettare ketamina cloridrato (70 mg / kg) e cloridrato medetomidina (1mg / kg) per via intraperitoneale per anestetizzareil mouse. Nota: La durata del piano anestetico risultante è 4 ore e non necessita di anestesia supplementare.
- Confermare la profondità dell'anestesia dalla perdita di riflessi, per esempio pizzico punta.
- Rimuovere tutti i capelli che circonda l'area di incisione e preparare la pelle per la chirurgia addominale mediante applicazione di una soluzione diluita di clorexidina.
- Posizionare il mouse su un tappetino riscaldato chirurgica in posizione supina e fissare gli arti al pad con bassa aderenza del nastro adesivo.
- Durante la procedura, monitorare il mouse per segni di ustioni a causa del pad chirurgica riscaldato. Se possibile utilizzare una fonte di calore non elettriche.
- Amministrare analgesico da una iniezione sottocutanea di buprenorfina cloridrato (0.06mg / kg) e applicare il lubrificante occhio per evitare l'essiccazione della cornea.
- Effettuare una laparotomia mediana e una incisione delle alba avascolare Linea usando forbici tessuto separazione per ottenere l'accesso alla cavità peritoneale.
- Proietta il mouse e inserire un colibririavvolgitore nella incisione.
2. unilaterale Ureteric Ostruzione
- Usando bastoncini di cotone sterilizzati esporre dell'uretere sinistro spostando l'intestino verso il lato destro della cavità addominale e coprirli con teli inumiditi.
- Utilizzando pinze ad angolo isolano e sollevare dell'uretere sinistro.
- Per creare una ostruzione ureterale, legare dell'uretere sinistro due volte con 6 / O nera intrecciata sutura di seta ovunque tra la vescica e pelvi renale. Per gli esperimenti a lungo termine, di utilizzare suture assorbibili per tutti gli interventi chirurgici addominali. In alternativa, una clip di legatura può essere applicato dell'uretere.
- Per isolare la vescica dal dell'uretere, dividere l'uretere tra i due punti di sutura.
- Ricollocare accuratamente l'intestino nella cavità peritoneale.
- Seguire le istruzioni di cui alla sezione 4 - recupero post-operatorio e cura per chiudere l'incisione e invertire la anestesia.
3. Preparazione Reversible unilaterale Ureteric Ostruzione
- Preparare un mouse per la chirurgia e isolare dell'uretere sinistro come descritto nei passaggi 1,1-2,2 sopra.
- Per creare una ostruzione ureterale che può essere invertito, legare l'uretere sinistro due volte con 6 / O nero intrecciato sutura di seta vicino alla vescica. Lasciare una estremità della sutura superiore finché questo sarà utilizzato per ancorare il tubo di plastica morbida murato in luogo intorno dell'uretere.
- Effettuare una feritoia longitudinale in una lunghezza di 5 mm di tubazione di plastica morbida murata tale che possa essere strombato aperto per permettere di essere applicato al dell'uretere. Qualsiasi tubazione di plastica morbido silicone murata, con un diametro interno di 1 mm e diametro esterno di 2 mm, può essere utilizzato.
- Posizionare il tubo di plastica murato morbida dolcemente intorno l'uretere. Assicurarsi che il lungo sutura emerge dal centro della fessura nel tubo una volta chiuso attorno dell'uretere.
- Mettere una lunghezza di 6 / O nera intrecciata sutura di seta attorno al tubo murato morbido che racchiude l'uretere e cravattauna volta. Ora posizionare l'estremità lunga della sutura, emergente dal centro della fessura nel tubo, longitudinalmente attraverso il tubo in modo da giacere sopra della sutura precedentemente legato.
- Legare la sutura si trova attorno al tubo per due volte per ancorare il tubo e la fine lunga sutura sul posto intorno al uretere.
Nota: Per evitare la formazione di adesione su dell'uretere e il tubo di plastica morbida murata, una soluzione di riduzione adesione può essere applicato alla zona attorno al tubo. - Ricollocare accuratamente l'intestino nella cavità peritoneale.
4. Post-Operative recupero e cura
- Chiudere il peritoneo con punto coperta con 5 / O nera intrecciata sutura di seta e approssimare la pelle con clip pelle metallica.
- Per minimizzare il rischio di infezioni post-operatorie, applicare tale antisettico come soluzione di iodio / alcool alla pelle addominale.
- Parzialmente anestesia indietro con cloridrato atipamezolo (2 mg / kg) per via sottocutanea. Somministrare fluidi da una iniezione sottocutanea di 1 ml di soluzione salina riscaldato.
- Monitorare il mouse fino a che non ha recuperato la coscienza.
- Lasciare il mouse per recuperare in una scatola riscaldata mantenuto a 29 ° C per 24 ore. Cibo umido può essere fornita anche per incoraggiare l'assunzione di liquidi e la nutrizione.
- Lasciare il mouse per recuperare per indurre un livello desiderato di ostruzione, tipicamente 7 giorni.
- Per gli esperimenti di recupero a lungo termine, fornire analgesici in corso. Se il mouse è da recuperare per più di 7 giorni, rimuovere le clip di pelle 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Una volta che il livello desiderato di ostruzione è stata indotta, sia invertire la UUO, come descritto di seguito, o eutanasia il mouse per dislocazione cervicale e raccogliere i reni per l'analisi istopatologica.
5. reversibile unilaterale Ureteric Ostruzione
- Per eseguire un R-UUO preparare un topo, che ha subito la preparazione per la R-UUO, per la chirurgia come descritto ai punti 10,1-1,7.
- Se presente, rimuovere i fermagli pelle e dividere o rimuovere le suture nel peritoneo per accedere alla cavità addominale. Nota: Se l'uretere è stato ostacolato per un lungo periodo clip pelle esperimento avrebbe dovuto essere rimosso 7 giorni dopo l'applicazione.
- Preparare il mouse e isolare dell'uretere sinistro come descritto nei punti 1,8-2,2.
- Utilizzando pinze ad angolo, liberare il tubo di plastica morbida murato da qualsiasi tessuto granulomatoso che si possono formare.
- Tagliare la sutura tenendo il tubo di plastica intorno l'uretere ostruito con un bisturi e rimuovere il tubo.
- Conferma successo UUO valutando la presenza di idronefrosi nel rene sinistro, il rene dovrebbe apparire pallido.
- Dividete l'uretere tra le suture.
- Posizionare la lunghezza rimanente dell'uretere, attaccato al rene, su un piccolo pezzo di garza sterile. Questo verrà utilizzato per raccogliere il sedimento urinario e cellule morte che si scarica dal dell'uretere unnd pelvi renale volta la sutura viene rimosso.
- Dividere l'uretere sopra, ma vicino, la sutura e consentire il rene di drenare sulla garza. Lasciare la sutura inferiore, più vicino alla vescica, intatta. Questo per garantire che nessun urina fuoriuscire dalla vescica e nella cavità peritoneale.
- Una volta che l'uretere e pelvi renale sono state drenato applicare una lunga 6 / O nero intrecciato sutura di seta alla fine della lunghezza rimanente dell'uretere. Questo sarà usato per aiutare l'uretere per anastomosi vescica eseguita successivamente.
- Seguire i passi di seguito per anastomosi la durata residua del uretere nella vescica:
- Ruotare l'uretere tale che si trova anteriormente alla sua posizione originale e si trova sopra il rene.
- Inserire un singolo 9 / O poliammide monofilamento incollamento sutura 2 mm dal terminale dell'uretere tale che emerge nella direzione della vescica. Fare attenzione al fine di garantire che la sutura rimane nella tunica muscolare e non entra il lume uretere. Il wil virata sutural essere utilizzato per ancorare l'uretere nella vescica.
- Per creare un canale attraverso la vescica, passare un ago 21G diagonalmente attraverso la vescica tale che esce verso il frontale (ventrale) parete della vescica.
- Resto un ago eyed nella smussatura dell'ago 21G. Utilizzare l'ago 21G per guidare l'ago occhi attraverso la vescica. L'ago occhi sarà usato per prendere l'uretere attraverso la vescica.
- Passare il 9 / O incollamento sutura, applicato al dell'uretere nel passaggio 5.11.2, attraverso la prima incisione nella vescica e fuori attraverso la parete della vescica adiacente al punto di ingresso. Una volta che l'uretere viene fatto passare attraverso la vescica sarà legato per ancorare l'uretere alla vescica.
- Posizionare la lunga 6 / O intrecciato nero sutura di seta applicata all'estremità dell'uretere nel passaggio attraverso l'ago 5.10 occhi.
- Sfilare delicatamente l'ago occhi fuori della vescica assicurando al contempo che l'uretere è anche tirato attraverso la vescica.
- Una volta che l'uretere emerge da the vescica rimuovere l'ago occhi e applicare un morsetto alla lunga sutura alla fine dell'uretere per impedire retrazione nella vescica.
- Per ancorare l'uretere all'interno posto nella vescica, legare il 9 / O poliammide monofilamento tack sutura, applicato in fase 5.11.5.
- Applicare unici aggiuntivi 9 / O poliammide suture monofilamento cravatta come descritto nei punti 5.11.2 e 5.11.5 a due posizioni intorno al punto di ingresso per ancorare saldamente l'uretere all'interno della vescica.
- Utilizzando la parte posteriore di forbici aperte, spingere la parete della vescica leggermente indietro per esporre più dell'uretere emergente.
- Dividere dell'uretere sopra lungo sutura situato all'estremità dell'uretere. L'uretere deve rientrare nel corpo della vescica. Si è soliti osservare urine scorre fuori dall'apertura nella vescica, confermando il lume aperte dell'uretere.
- Chiudere l'uscita avvolto nella vescica con una poliammide sutura monofilamento 9 / O.
- Ricollocare accuratamente l'intestino inla cavità peritoneale.
- Fornire assistenza post-operatoria, come descritto nei passaggi 4,1-4,8.
- Lasciare che il mouse per recuperare fino a quando il rene viene decompresso, tipicamente 7 giorni.
- Al punto finale sperimentale, eutanasia il mouse dislocazione cervicale e raccogliere i reni per l'analisi istopatologica.
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Representative Results
L'aspetto delle modifiche renali marcatamente seguente ostruzione degli ureteri e diventa pallido e teso alla palpazione con il tempo (Figura 1). Vi è una crescente dilatazione dell'uretere prossimale all'ostruzione e pelvi renale. Il rene diventa sempre atrofica come la durata della nefropatia ostruttiva aumenta con ostruzione prolungata con conseguente notevole assottigliamento della corteccia renale e midollare. Dopo l'inversione di ostruzione ureterale, il colore del rene diventa più scura, come flusso di sangue aumenta e si risolve edema dei tessuti. La dilatazione dell'uretere e renali bacino del rene scompare anche se possono rimanere leggermente 'larghi' a seguito del periodo di distensione prolungato (Figura 1). Il rene de-ostruito è tipicamente più piccolo del rene controlaterale come elemento di atrofia del tessuto è inevitabile anche se il grado di perdita di tessuto dipenderà dalla durata di ostruzione.
Istologia del normale renale nativa non manipolata rivela glomeruli circondate dai tubuli compatte del tubulointerstitium con molti tubuli avente un lume discernibile evidente (Figura 2). Dopo l'ostruzione ureterale distensione e dilatazione della pelvi renale e dell'uretere (Figura 1) è accompagnato aumentando dilatazione dei tubuli renali che è facilmente evidente istologico di sezioni di tessuto (tubuli dilatati indicato dalla freccia nelle figura 2). Il glomeruli presentano un aspetto normale in questo modello con lesioni e cicatrici limitato al tubulointerstitium. Risoluzione graduale e significativa della distensione tubulare e dilatazione segue il sollievo di ostruzione ureterale se alcuni tubuli possono restare dilatato (Figura 2).
Figura 1. Aspetto di UUO, e R-UUO reni, pelvi renale nativi e uretere. Maschio topi FVB subito ostruzione ureterale unilaterale (UUO) per 7 giorni. I topi sono stati sacrificati sia o UUO stato poi invertito (R-UUO) ed i reni decompressi per 7 giorni prima sacrificio. Immagini illustrano l'aspetto del rene, pelvi renale, dell'uretere e della vescica di un nativo, UUO e R-UUO rene raccolte al momento del sacrificio. In confronto al rene nativo rene UUO appare hydronephrotic e di colore pallido. A seguito de-ostruzione del rene R-UUO ha decompresso se pelvi renale e dell'uretere rimangono leggermente 'larghi'. Si noti che l'uretere R-UUO è più breve del UUO e rene nativo dovuto alla rimozione della parte ostruito prima di ri-anastomosi nella vescica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. istologia rappresentante di nativi, UUO e R-UUO reni. Maschio topi FVB subito ostruzione ureterale unilaterale (UUO) per 7 giorni. I topi sono stati sacrificati sia o UUO stato poi invertito (R-UUO) ed i reni permesso di decompressione per 7 giorni prima del sacrificio. Microfotografie Rappresentante (Ingrandimento: X200) di H & E macchiato sezioni del rene dal controllo non manipolato rene nativo, UUO rene e R-UUO rene. L'interstizio sano del rene normale comprende normali tubuli compatti. Un certo numero di tubuli indicate dalle frecce presentano dilatazione significativa al giorno 7 dopo UUO. Al contrario, la dilatazione tubolare è notevolmente ridotto a 7 giorni dopo l'inversione di UUO.blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti o conflittuali interessi da dichiarare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
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