Protocol
Diretrizes gerais: Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e normas impostas pelos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Este protocolo eo protocolo de vídeo que acompanha são tanto para a UUO padrão e um R-UUO, que pode ser realizada em muitos linhagens de camundongos. No vídeo acompanhante, ambos os processos são realizados em ratos machos C57BL / 6 machos com idade de 8 semanas. Os dados apresentados na seção de resultados representativos foram obtidos a partir do sexo masculino FVB / n camundongos.
NOTA: Este protocolo de acompanhamento e detalhes de vídeo como executar uma UUO padrão e R-UUO utilizando o uréter esquerdo, no entanto, as mesmas técnicas podem ser facilmente aplicados para a uréter direito.
1. Preparação Animal e Laparotomia
- Realizar todos os procedimentos com instrumentos esterilizados (autoclavados) e bens de consumo.
- Injectar cloridrato de cetamina (70 mg / kg) e cloridrato de medetomidina (1mg / kg) por via intraperitoneal para anestesiaro mouse. Nota: A duração do plano anestésico resultante é de 4 h e sem anestesia suplementar se necessário.
- Confirme a profundidade da anestesia, pela perda de reflexos, por exemplo, toe pitada.
- Retirar todos os pêlos ao redor da área da incisão e preparar a pele para a cirurgia abdominal através da aplicação de uma solução diluída de clorexidina.
- Posicione o mouse sobre uma almofada cirúrgica aquecida em decúbito dorsal e corrigir os membros para a almofada com fita adesiva de baixa aderência.
- Durante o procedimento, o rato para monitorizar sinais de queimaduras como resultado de a almofada cirúrgico aquecido. Se possível usar uma fonte de calor não-elétrico.
- Administrar analgésico por uma injecção subcutânea de cloridrato de buprenorfina (0,06 mg / kg) e aplicar lubrificante olho para evitar a secagem da córnea.
- Adicione uma laparotomia mediana e uma incisão das avascular linea alba, utilizando tesouras de tecidos de separação para obter o acesso para a cavidade peritoneal.
- Armar o mouse e inserir um colibriretractor na incisão.
2. Unilateral Ureteric Obstrução
- Usando cotonetes esterilizados expor o ureter esquerdo, deslocando o intestino para o lado direito da cavidade abdominal e cobri-los com cortinas umedecidos.
- Utilizando uma pinça em ângulo isolar e levantar o ureter esquerdo.
- Para criar uma obstrução ureteral, ligadura do ureter esquerdo duas vezes com 6 / O trançado preto de seda de sutura em qualquer lugar entre a bexiga e pelve renal. Para experimentos de longa duração, use fio absorvível para todas as cirurgias abdominais. Alternativamente, um agrafo de ligação pode ser aplicado para o ureter.
- Para isolar a bexiga do ureter, dividir o ureter entre as duas suturas.
- Recolocar cuidadosamente os intestinos para a cavidade peritoneal.
- Siga os passos listados na Secção 4 - recuperação pós-operatória e Cuidados para fechar a incisão e reverter a anestesia.
3. Preparação para Reversible Unilateral Ureteric Obstrução
- Prepare um mouse para a cirurgia e isolar o ureter esquerdo, conforme detalhado nos Passos 1,1-2,2 acima.
- Para criar uma obstrução ureteral que pode ser revertida, ligar o uréter esquerdo duas vezes com 6 / S preto sutura de seda trançada próximo da bexiga. Deixar uma extremidade superior do fio de sutura desde que este vai ser utilizado para o ancorar a tubagem de plástico de paredes suaves no lugar em torno do ureter.
- Adicione uma fenda longitudinal em um 5 mm de comprimento de tubagem de plástico de paredes suaves de tal forma que ele pode ser espalmada aberta para permitir que seja aplicada para o ureter. Qualquer um tubo de plástico de silicone macio paredes, com um diâmetro interno de 1 milímetro e diâmetro externo de 2 milímetros, podem ser usados.
- Coloque o tubo de plástico macio murada suavemente ao redor do ureter. Certifique-se de que o tempo de sutura sai do centro da fenda no tubo, uma vez que é fechada em torno do ureter.
- Coloque um comprimento de 6 / S trançada preta sutura de seda em torno da tubagem de parede macia que envolve o ureter e amarraruma vez. Agora colocar a extremidade longa do fio de sutura, que emerge a partir do centro da fenda no tubo, longitudinalmente através do tubo de tal forma que ela se encontra na parte superior do fio previamente atadas.
- Ate a sutura localizados em torno da tubagem de duas vezes para ancorar a tubagem e a extremidade longa sutura no lugar em torno do ureter.
Nota: Para evitar a formação de aderências no ureter e o tubo de plástico com paredes moles, uma solução de redução de aderência pode ser aplicada à área em torno da tubagem. - Recolocar cuidadosamente os intestinos para a cavidade peritoneal.
4. Recuperação Pós-Operatória e Cuidados
- Feche o peritônio com ponto cobertor usando 5 / O preto trançado fio de seda e aproximar a pele com pele clips metálicos.
- Para minimizar o risco de infecção pós-operatória, aplicar um anti-séptico tal como a solução de iodo / álcool para a pele abdominal.
- Pouco anestesia reversa com cloridrato de atipamezol (2 mg / kg) por via subcutânea. Administrar fluidos por uma injecção subcutânea de 1 mL de solução salina aquecida.
- Monitore o rato até que ele se recuperou a consciência.
- Permitir que o rato para recuperar numa caixa aquecida mantida a 29 ° C durante 24 horas. Alimento humedecido também pode ser fornecida para estimular a ingestão de fluidos e da nutrição.
- Deixar o rato para recuperar para induzir um nível desejado de obstrução, normalmente 7 dias.
- Para as experiências de recuperação a longo prazo, fornecer analgésicos em curso. Se o mouse está a ser recuperado para mais de 7 dias, retire os grampos da pele 7 dias após a cirurgia.
- Uma vez que tenha sido induzida a nível desejado de obstrução, ou inverter a UUO, como descrito abaixo, ou a eutanásia por deslocamento cervical do rato e recolher os rins para exame histopatológico.
5. reversível Unilateral Ureteric Obstrução
- Para executar um R-UUO preparar um rato, o qual foi submetido a preparação de R-UUO, para a cirurgia tal como descrito nos passos 10,1-1,7.
- Se estiver presente, remover os agrafos para pele e dividir ou remover as suturas no peritoneu para ganhar acesso à cavidade abdominal. Nota: Se o ureter foi obstruído por um longo prazo clips experimento pele deveria ter sido removido sete dias após a aplicação.
- Prepare o rato e isolar o uréter esquerdo tal como descrito nos passos 1,8 a 2,2.
- Usando fórceps angulares, libertar o tubo de plástico de paredes a partir de qualquer tecido macio granulomatosa que se tenha formado.
- Cortar o fio de sutura que prende o tubo de plástico em torno do ureter obstruída com um bisturi e remover o tubo.
- Confirmar UUO bem sucedida por meio da avaliação da presença de hidronefrose no rim esquerdo, o rim também deve aparecer pálido.
- Divida o ureter entre as suturas.
- Inserir o comprimento restante de ureter, ligado ao rim, em um pequeno pedaço de gaze estéril. Isto irá ser utilizado para recolher o sedimento urinário e células mortas que escoará de um ureternd pelve renal uma vez que a sutura é removida.
- Dividir o ureter acima, mas próximo, o fio de sutura e permitir que o rim para drenar para a gaze. Deixar a sutura inferior, mais próxima da bexiga, intacta. Isto é para garantir que não irá vazar urina da bexiga e para dentro da cavidade peritoneal.
- Uma vez que o ureter e pelve renal ter sido drenado, aplicar um longo 6 / S preto sutura de seda trançada para o fim do comprimento restante do ureter. Isto irá ser utilizado para auxiliar a anastomose do ureter bexiga realizada mais tarde.
- Siga os passos abaixo para anastomosar o comprimento restante do ureter na bexiga:
- Ligue o ureter de tal modo que passa anteriormente à sua posição original e encontra-se sobre o rim.
- Coloque um único 9 de E / S de poliamida monofilamento aderência sutura 2 mm da extremidade do ureter tal que emerge na direcção da bexiga. Tome cuidado para garantir que a sutura permanece no revestimento muscular e não entra no lúmen ureter. O wil aderência sutural ser utilizados para ancorar o ureter na bexiga.
- Para criar um canal através da bexiga, passar uma agulha 21G diagonalmente através da bexiga tal que ele sai para a frontal (ventral) da parede da bexiga.
- Descanse uma agulha de olhos no bisel da agulha 21G. Utilizar a agulha 21G para guiar a agulha de olhos através da bexiga. A agulha de olhos irá ser utilizado para tomar o ureter através da bexiga.
- Passe o 9 / O aderência sutura, aplicado para o ureter no passo 5.11.2, através da primeira incisão na bexiga e para fora através da parede da bexiga adjacente ao ponto de entrada. Uma vez que o ureter é passado através da bexiga este vai ser amarrado para ancorar o ureter para a bexiga.
- Coloque a longo 6 / S preto sutura de seda trançada aplicada à extremidade do ureter no passo 5.10, através da agulha de olhos.
- Retirar cuidadosamente a agulha olhos para fora da bexiga, garantindo simultaneamente que o ureter é também puxado através da bexiga.
- Uma vez que o ureter emerge thbexiga e remover a agulha olhos e aplicar um grampo para a sutura longa no final do ureter para impedir a retracção de volta para dentro da bexiga.
- Para ancorar o ureter dentro lugar na bexiga, amarrar o 9 / O poliamida sutura monofilamento aderência, aplicado na etapa 5.11.5.
- Aplicar solteiro 9 / O poliamida pontos adicionais tie monofilamento conforme descrito nas etapas 5.11.2 e 5.11.5 em dois locais ao redor do ponto de entrada para ancorar firmemente o ureter dentro da bexiga.
- Usando a parte traseira de tesouras abertas, empurrar a parede da bexiga ligeiramente para trás para expor mais do ureter emergente.
- Dividir o ureter acima da sutura longa localizado na extremidade do ureter. O ureter deve ser retraída para dentro do corpo da bexiga. É normal observar urina flui para fora da abertura na bexiga, confirmando o lúmen aberto do ureter.
- Feche a saída de feridas na bexiga com uma sutura de monofilamento de poliamida 9 de E / S.
- Recolocar cuidadosamente os intestinos paraa cavidade peritoneal.
- Fornecer cuidados pós-operatórios, conforme detalhado em passos 4,1-4,8.
- Permitir que o mouse para se recuperar até o rim é descomprimido, tipicamente 7 dias.
- No ponto final experimental, sacrificar o mouse por deslocamento cervical e recolher os rins para análise histopatológica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A aparência das alterações renais marcadamente após obstrução ureteral e torna-se mais pálida e tenso para a palpação com o tempo (Figura 1). Há cada vez mais a dilatação do ureter proximal à obstrução e da pelve renal. O rim torna-se cada vez mais atrófica como a duração da nefropatia obstrutiva aumenta com a obstrução prolongada resultando em um desbaste significativo do córtex e na medula renal. Após a reversão da obstrução ureteral, a cor do rim torna-se mais escura que aumenta o fluxo de sangue e resolve edema de tecido. A dilatação do ureter e pelve renal do rim diminui embora possam permanecer ligeiramente "flácido 'como uma consequência do período de distensão prolongada (Figura 1). O rim obstruído-de é tipicamente menor do que o rim contralateral como um elemento de atrofia do tecido é inevitável, embora o grau de perda de tecido dependerá da duração da obstrução.
Histologia do rim nativo não manipulado glomérulos normais revela rodeados pelos túbulos compactas do túbulo-intersticial com muitos túbulos tendo um lúmen discernível evidente (Figura 2). Seguindo obstrução ureteral a distensão e dilatação do ureter e da pélvis renal (Figura 1) é acompanhada pelo aumento da dilatação dos túbulos renais, que é facilmente evidente na histologia de secções de tecido (túbulos dilatados com setas na Figura 2). Os glomérulos exibem uma aparência normal neste modelo com lesões e cicatrizes confinado ao túbulo-intersticial. Resolução gradual e significativa de distensão e dilatação tubular segue o alívio de obstrução ureteral embora alguns túbulos pode permanecer dilatada (Figura 2).
Figura 1. Aparência de UUO, e R-UUO rins, pelve renal nativas e ureter. Camundongos FVB machos foram submetidos à obstrução ureteral unilateral (UUO) durante 7 dias. Os ratos foram quer sacrificados ou a UUO foi então invertida (R-UUO) e os rins descomprimido durante 7 dias antes do sacrifício. Imagens ilustram a aparência do rim, pelve renal, bexiga e ureter de um, UUO e R-UUO rim nativo colhidas no momento de sacrifício. Em comparação com o rim nativo do rim UUO aparece hydronephrotic e de cor pálida. Na sequência de-obstrução do rim R-UUO tem descomprimido embora a pelve renal e ureter ficar ligeiramente 'folgado'. Observe que o ureter R-UUO é mais curto do que o UUO e rim nativo devido a remoção da porção obstruída antes de voltar a anastomose na bexiga. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. histologia Representante nativas, UUO e R-UUO rins. Camundongos FVB machos foram submetidos à obstrução ureteral unilateral (UUO) durante 7 dias. Os ratos foram quer sacrificados ou a UUO foi então invertida (R-UUO) e os rins permitido para descomprimir durante 7 dias antes do sacrifício. Fotomicrografias representativas (Ampliação: X200) de H & E manchada secções de rim de controle não-manipulados rim nativo, UUO rim e R-UUO rim. O interstício do rim saudável normal é composta de túbulos compactos normais. Um número de túbulos indicadas pelas setas apresentam uma dilatação significativa no dia 7 após a UUO. Em contraste, a dilatação tubular é marcadamente reduzida aos 7 dias após a reversão do UUO.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm qualquer ameaça ou conflito de interesses para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
