Protocol
Общее руководство: Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и нормами, установленными животных (научные процедуры) Закона 1986 года этот Протокол и сопровождающие видео на протоколе, как для стандартного ОМО и R-ОМО, которая может быть выполнена на многих линии мышей. В видеосюжета, обе процедуры выполняются на мужчин C57BL / 6 мышей в возрасте 8 недель. Данные, представленные в разделе репрезентативные результаты были получены из мужчин FVB / N мышах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол и сопутствующие сведения о видеозаписи, как выполнять стандартную ОМО и R-UUO использования левого мочеточника, однако те же методы могут быть легко использованы в нужном мочеточника.
1. Подготовка животных и Лапаротомию
- Выполните все процедуры стерильными (автоклавного) Инструменты и расходные материалы.
- Вводят кетамина гидрохлорид (70 мг / кг) и медетомидина гидрохлорид (1 мг / кг) внутрибрюшинно анестезиюмышь. Примечание: продолжительность результате анестезии плоскости 4 ч и не дополнительный анестезия не требуется.
- Подтвердите глубины анестезии потерей рефлексов, например, регулировка развала крайнем случае.
- Удалить все волосы вокруг области разреза и подготовить кожу с брюшка к операции с помощью применения разбавленным раствором хлоргексидина.
- Наведите на хирургическом площадку с подогревом в лежачем положении и зафиксировать конечности на площадку с помощью низкой липкости клейкую ленту.
- Во время процедуры, контролировать мышь на наличие признаков термических ожогов в результате хирургического площадку с подогревом. Если возможно использовать не электрический источник тепла.
- Администрирование анальгетик с помощью подкожной инъекции гидрохлорида бупренорфина (0.06mg / кг) и применить глаз смазки, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Сделайте срединной лапаротомии и разрез бессосудистой белой линии с использованием мягкой ткани, разделяющая ножницы, чтобы получить доступ в брюшную полость.
- Накройте мышь и вставьте Colibriвтягивающее в разрез.
2. Одностороннее мочеточников Обструкция
- Использование стерилизованные ватные палочки подвергайте левого мочеточника путем смещения кишечника к правой стороне брюшной полости и покрывают их с увлажненными шторы.
- Использование угловые щипцы изолировать и поднять левого мочеточника.
- Для создания мочеточника препятствий, лигирования левого мочеточника дважды 6 / вывода черный плетеный шелковой нити в любом месте между мочевым пузырем и почечной лоханки. Для долгосрочных экспериментов, использовать рассасывающиеся нити для всех брюшных операций. Кроме того, ролик лигирования могут быть применены к мочеточника.
- Для выделения мочевой пузырь из мочеточника, разделить мочеточника между двумя швами.
- Тщательно заменить кишечника в брюшную полость.
- Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 4 - послеоперационной реабилитации и уходу, чтобы закрыть разрез и обратить вспять анестезии.
3. Подготовка к Reversiblе Односторонний мочеточников Обструкция
- Подготовьте мышь для хирургии и изолировать левого мочеточника, как описано в шагах от 1,1 до 2,2 выше.
- Чтобы создать препятствие мочеточника, что может быть отменено, лигирования левого мочеточника дважды 6 / вывода черного плетеной шелковой нити близко к пузырь. Оставьте один конец верхней нити тех пор, пока это будет использоваться для закрепления мягкой стеной пластиковые трубы в месте вокруг мочеточника.
- Сделать продольный разрез в 5 мм длины мягкой стеной пластиковых труб таким образом, что он может быть распущенной открыт, чтобы позволить ему быть применены к мочеточника. Любой мягкой стеной силикон пластиковые трубы, с внутренним диаметром 1 мм и наружным диаметром 2 мм, могут быть использованы.
- Поместите мягкую стеной пластиковых труб мягко вокруг мочеточника. Убедитесь, что нить длиной выходит из центра щели в трубке, когда он закрыт вокруг мочеточника.
- Поместите длину 6 / вывода черный плетеный шелковой нити вокруг мягкой стеной трубы ограждающих мочеточник и галстукодин раз. Теперь поместите длинный конец шовного материала, возникающих от центра щели в трубопроводе, в продольном направлении через трубопровод так, что он лежит на верхней части ранее связанного шва.
- Свяжите шва, расположенных вокруг трубы в два раза, чтобы закрепить трубку и длинный конец шва в месте вокруг мочеточника.
Примечание: Чтобы предотвратить образование спаек на мочеточник и мягкой стеной пластиковых труб, раствор снижение адгезии может быть применен к области вокруг трубы. - Тщательно заменить кишечника в брюшную полость.
4. послеоперационной реабилитации и уход
- Закрыть брюшины с одеялом стежка с помощью 5 / вывода черный плетеный шелковый шов и приблизить кожу с помощью металлических зажимов кожи.
- Чтобы свести к минимуму риск послеоперационной инфекции, применяются антисептические, такие как йод / спиртовом растворе в кожу живота.
- Переменная обратной анестезия с Атипамезол гидрохлорида (2 мг / кг) подкожно. Администрирование жидкости с помощью подкожной инъекции 1 мл физиологического раствора нагревают.
- Монитор мыши, пока он не пришел в сознание.
- Разрешить мыши для восстановления в нагретом поле выдерживают при 29 ° С в течение 24 ч. Увлажненный пища также может быть предусмотрено, чтобы стимулировать жидкости и питания потребление.
- Оставьте мышь, чтобы восстановить, чтобы вызвать желаемый уровень обструкции, обычно на 7 дней.
- Для долгосрочных экспериментов по восстановлению, обеспечить текущие анальгетики. Если мышь, чтобы восстановить дольше, чем 7 дней, снимите зажимы кожным 7 дней после операции.
- После того, как желаемый уровень обструкции был вызван, либо в обратном ОМО, как описано ниже, или усыпить мышь смещением шейных позвонков и собирать почки для анализа патоморфологическую.
5. Реверсивный Односторонний мочеточников Обструкция
- Для выполнения R-UUO подготовить мышь, которая претерпела подготовку к R-ОМО, для хирургии, как описано в шагах 10,1 до 1,7.
- Если присутствует, удалить зажимы кожи и разделить или удалить швы в брюшине, чтобы получить доступ к брюшной полости. Примечание: Если мочеточник был затруднен в течение длительного эксперимента кожи клипов, должен быть удален 7 дней после применения.
- Подготовьте мышь и изолировать левого мочеточника, как описано в шагах от 1,8 до 2,2.
- Использование угловых щипцов, освободить мягкую стеной пластиковых труб из любого гранулематозного ткани, которая может быть сформирована.
- Отрежьте нить проведении пластиковой трубки вокруг обструкцией мочеточника с помощью скальпеля и удалить трубку.
- Подтверждение успешного ОМО путем оценки на наличие гидронефроз в левой почке, почки должны также появляются бледно.
- Разделите мочеточника между швами.
- Поместите оставшуюся длину мочеточника, прикрепленный к почке, на маленьком кусочке стерильной марлей. Эта информация будет использоваться для сбора осадка мочи и отмершие клетки, которая будет вытекать из мочеточника ай почечной лоханки раз шва удаляется.
- Разделите выше мочеточника, но рядом, шовный и позволяют почек для слива на марлю. Оставьте нижний шов, ближе к мочевому пузырю, без изменений. Это делается для того, чтобы моча не будет течь из мочевого пузыря и в брюшную полость.
- После того, как мочеточник и почечной лоханки были осушены, применить длинный 6 / вывода черного плетеный шелковый шов до конца оставшегося длины мочеточника. Это будет использоваться, чтобы помочь в мочеточник анастомоза мочевого пузыря, осуществляемом позже.
- Следуйте инструкциям ниже, чтобы анастомозируют оставшуюся длину мочеточника в мочевой пузырь:
- Включите мочеточник таким образом, что она лежит впереди в исходное положение и лежит над почек.
- Поместите одной 9 / вывода полиамида мононити TACKING швом 2 мм от конца мочеточника таким образом, что она выходит в направлении мочевого пузыря. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что шва остается в мышечной оболочки и не входит в мочеточник просвет. Лавировать шов Вильл быть использованы для закрепления мочеточник в мочевой пузырь.
- Чтобы создать канал через мочевой пузырь, пройти 21g иглу диагонали через мочевой пузырь таким образом, что он выходит в сторону передней (вентральной) стенки мочевого пузыря.
- Отдых в глазами иглу в скоса иглы 21G. Используйте 21G иглу, чтобы вести глазами иглу через мочевой пузырь. Глазами иглы будет использоваться, чтобы взять мочеточник через мочевой пузырь.
- Пропустите прихватки шва 9 / вывода, применяется мочеточника в шаге 5.11.2, через первый разрез в мочевом пузыре и выходит через стенку мочевого пузыря, примыкающей к точке входа. После того, как мочеточник проходит через мочевой пузырь, это будет связано с якорь мочеточник в мочевой пузырь.
- Поместите длинный 6 / вывода черного плетеный шелковый шов, приложенное к концу мочеточника на этапе 5,10 глазами через иглу.
- Осторожно снять глазами иглу из мочевого пузыря в то время гарантируя, что мочеточник и протягивают через мочевой пузырь.
- После того, как мочеточник выходит из гое мочевого пузыря удалить иглу глазами и применить зажим с длинной нити в конце мочеточника, чтобы предотвратить отвод назад в мочевой пузырь.
- Для привязки мочеточника в месте в мочевом пузыре, связать 9 / вывода полиамида мононити липкости шва, нанесенный на стадии 5.11.5.
- Применить дополнительные односпальные 9 / вывода полиамидные мононити галстук швов, как описано в шагах 5.11.2 и 5.11.5 в двух местах вокруг точки входа, чтобы твердо закрепить мочеточника в мочевом пузыре.
- Используя спину открытых ножниц, нажмите стенки мочевого пузыря немного назад, чтобы выставить больше, выходящего мочеточника.
- Разделить выше длинного шва, расположенного на конце мочеточника мочеточника. Мочеточника следует убрать в теле мочевого пузыря. Это обычно наблюдается мочи течет из отверстия в мочевом пузыре, подтверждающие открытые просвет мочеточника.
- Закройте выходное отверстие в мочевом пузыре с 9 / вывода полиамид мононити шва.
- Осторожно вставьте кишечника вбрюшной полости.
- Послеоперационного ухода, как описано в шагах от 4,1 до 4,8.
- Разрешить мыши, чтобы оправиться, пока почки не распакованы, как правило, 7 дней.
- В экспериментальной конечной точки, усыпить мышь смещением шейных позвонков и собирать почки для гистопатологического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Появление изменений в почках заметно после мочеточника препятствий, и она становится бледнее и напряженной при пальпации времени (рис 1). Существует увеличение дилатация мочеточника проксимальнее обструкции и почечной лоханки. Почек становится все более атрофический, как продолжительность обструктивных нефропатии возрастает при длительном обструкции вследствие значительного утончения почечной коры и мозгового вещества. После разворота мочеточника препятствий, цвет почек становится темнее по мере увеличения потока крови и отек тканей решает. Дилатация мочеточника и почечной лоханки почки спадает, хотя они могут оставаться немного 'мешковатые ", как следствие длительного периода растяжения (рис 1). Де-затруднен почек, как правило, меньше, чем в контралатеральной почки, как элемент атрофии тканей неизбежно хотя степень потери ткани будет зависеть от продолжительности обструкции.
Гистология обычных не манипулировать родной почки показывает клубочки, окруженные компактных канальцев тубулоинтерстиция со многими трубочки, имеющие заметный просвет очевидной (рис 2). После мочеточника обструкции вздутие и дилатации мочеточника и почечной лоханки (рис 1) сопровождается повышением дилатацию почечных канальцев, что легко видно, гистологического исследования срезов тканей (расширенные канальцы стрелками на рисунке 2). Клубочки обладают нормальный вид в этой модели с травмой и рубцов приурочены к тубулоинтерстиция. Постепенное и значительное разрешение трубчатого живота и растяжения следует облегчение мочеточника препятствий, хотя некоторые канальцы могут оставаться расширенными (рисунок 2).
Рисунок 1. Внешний вид родных, ОМО и R-ОМО почек, почечной лоханки и мочеточника. Мужской FVB мышей прошли в одностороннем порядке мочеточника препятствий (ОМО) в течение 7 дней. Мыши были либо уничтожены или UUO затем обратное (R-ОМО) и почки декомпрессии в течение 7 дней до жертвоприношения. Изображения иллюстрируют появление почек, почечной лоханки, мочеточников и мочевого пузыря родного, ОМО и R-ОМО почки собирают во время жертвоприношения. По сравнению с нативной почки почки UUO появляется гидронефротической и бледный цвет. После де-обструкции почек R-UUO уже распакованы, хотя почечной лоханки и мочеточника остаются слегка "мешковатые". Обратите внимание, что мочеточник R-UUO короче ОМО и родной почки из-за удаления закупоренной части перед повторным анастомоза в мочевой пузырь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Представитель гистология родных, ОМО и R-ОМО почек. Мужской FVB мышей прошли в одностороннем порядке мочеточника препятствий (ОМО) в течение 7 дней. Мыши были либо уничтожены или UUO затем обратное (R-UUO) и почки разрешается распаковывать в течение 7 дней до умерщвления. Представитель микрофотографии (увеличение: х200), Н & Е окрашенные срезы почек от управления, не манипулировать родной почки, ОМО почек и R-ОМО почки. Здоровым интерстиций нормальной почки состоит из нормальных компактных канальцев. Количество трубок, обозначенных стрелками демонстрируют значительное дилатацию на 7 день после ОМО. В отличие от этого, трубчатые расширение заметно снижается в течение 7 дней после разворота ОМО.пустой "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих или противоречивых интересов раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
