Protocol
Genel Rehberlik: Hayvan deneyleri Hayvanlar dayattığı kurallara ve yönetmeliklere uygun (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 Bu protokol ve çok sayıda yapılabilir eşlik eden video protokol standart UUO ve R-UUO hem içindir, yapılmıştır fare suşları. Eşlik eden video, hem prosedürler erkek C57BL / 6 fareler yaş 8 hafta yapılmaktadır. Örnek sonuçlar bölümünde sunulan veriler erkek FVB / N farelerden elde edilmiştir.
NOT: Bu protokol ve nasıl bir standart UUO gerçekleştirmek ve R-UUO sol üreter kullanan video ayrıntılarını eşlik, ancak aynı teknikler kolayca sağ üreter uygulanabilir.
1. Hayvan Hazırlama ve laparotomi
- Steril (otoklav) araçların ve sarf malzemeleri ile tüm prosedürleri uygulayın.
- Uyuşturmak için intraperitonal ketamin hidroklorür (70 mg / kg) ve medetomidin hidroklorür (1 mg / kg) enjekteFare. Not: Elde edilen anestezik düzlemin süresi 4 saat olan ve hiçbir ek anestezi gereklidir.
- Refleksler, örneğin, ayak tutam kaybı ile anestezi derinliği onaylayın.
- Kesi alanı çevreleyen tüm saç çıkarın ve bir seyreltik klorheksidin solüsyonu uygulaması yoluyla ameliyat için karın cildi hazırlar.
- Sırtüstü pozisyonda ısıtılmış cerrahi pad üzerinde fare koyun ve düşük yapışma yapıştırıcı bant kullanarak pad bacaklarda düzeltmek.
- İşlem sırasında, ısıtılmış ameliyat pedin bir sonucu olarak termal yanıklar belirtileri için fare izler. Mümkünse bir elektrikli olmayan ısı kaynağı kullanın.
- Buprenorfin hidroklorür (0.06mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile analjezik yönetme ve kornea kurumasını önlemek için göz yağ uygulanır.
- Bir orta hat laparotomi ve periton boşluğuna erişmek için doku ayıran makas kullanarak avasküler linea alba bir kesi yapmak.
- Fareyi asmak ve bir colibri eklemekkesi içine toplayıcı.
2. Tek taraflı Üreterik İkaz
- Sterilize pamuk tomurcukları kullanılarak karın boşluğunun sağ tarafına doğru bağırsakları yerinden bıraktığı üreter ortaya çıkarmak ve nemli örtüler ile bunları kapatın.
- Açılı forseps izole ve sol üreter kaldırın kullanma.
- Bir üreter tıkanıklığı oluşturmak için, her yerde mesane ve böbrek pelvis arasındaki 6 / Ç siyah örgü ipek sütür ile iki kez sol üreter Arter. Uzun süreli deneyler için, tüm karın ameliyatları için emilebilir sütür kullanın. Seçenek olarak ise, bir linear klip üreter uygulanabilir.
- Üreter gelen mesane izole etmek için, iki sütür arasındaki üreter bölün.
- Dikkatle periton boşluğuna bağırsak değiştirin.
- Bölüm 4'te listelenen adımları izleyin - Post-Operatif Kurtarma ve Bakım kesi kapatın ve anestezi ters.
Reversibl 3. Hazırlıke Tek Taraflı Üreterik İkaz
- Ameliyat için fare hazırlayın ve Adımlar yukarıda 1,1-2,2 ayrıntılı olarak sol üreter izole.
- Tersine bir üreter tıkanıklığı oluşturmak için, mesaneye yakın 6 / Ç siyah örgü ipek sütür ile iki kez sol üreter Arter. Bu üreter çevresinde yer yumuşak duvarlı plastik boru sabitlemek için kullanılacak uzun üst ameliyat dikiş ipliğinin bir ucu boş.
- O üreter uygulanacak izin vermek için açık yayvan olabilir, öyle ki, yumuşak çeperli plastik bir boru 5 mm uzunluğunda, uzunlamasına bir yarık olun. 1 mm ve 2 mm dış çaplı bir iç çapa sahip herhangi bir yumuşak duvarlı silikon plastik boru, kullanılabilir.
- Üreter etrafında yavaşça yumuşak duvarlı plastik boru yerleştirin. O üreter etrafında kapalı bir kez uzun dikiş boru yarık merkezinden çıkan emin olun.
- Üreter çevreleyen yumuşak duvarlı boru yaklaşık 6 / Ç siyah örgülü ipek sütür uzunluğu yerleştirin ve kravatbir kez. Şimdi uzunlamasına bir önceki bağlı dikiş üstünde uzandığı şekilde boru boyunca, boru yarık merkezinden çıkan, ameliyat dikiş ipliğinin, uzun ucuna yerleştirin.
- Boru ve üreter etrafında yerinde uzun dikiş ucunu tutturmak için iki kez tüp etrafında bulunan dikiş kravat.
Not: üreter ve yumuşak duvarlı plastik boru üzerinde yapışma oluşumunu önlemek için, bir yapışma azaltma çözümü boru çevresi uygulanabilir. - Dikkatle periton boşluğuna bağırsak değiştirin.
4. Post-Operatif Kurtarma ve Bakım
- 5 / Ç siyah örgü ipek sütür kullanarak battaniye dikiş ile periton kapatın ve metalik deri klipleri kullanarak cilt yaklaşmaktadır.
- Post-operatif enfeksiyon riskini en aza indirmek için, karın deriye iyot / alkol çözeltisi gibi bir antiseptik gibi uygulayın.
- Subkutan atipamezol hidroklorür (2mg / kg) ile kısmen ters anestezi. 1 ml 'lik bir deri altından enjeksiyon ile sıvıları yönetme tuz ısıtıldı.
- Bu bilinci kurtarıldı kadar fare izleyin.
- Fare, 24 saat için 29 ° C'da tutulan bir ateşli kutusuna geri izin verin. Nemlendirilmiş Gıda da sıvı ve beslenme alımını teşvik sağlanabilir.
- Tıkanma arzu edilen düzeyde bir, tipik olarak 7 gün uyarılması için geri fare bırakın.
- Uzun vadeli iyileşme deneyleri için, devam eden analjezikler sağlanması. Fare daha uzun 7 gün süre ile, elde edilecek olan ise, cilt klipleri cerrahi sonrası 7 gün çıkarın.
- Tıkanıklığı, istenen seviyede indüklenmiş sonra, ya da aşağıda tarif edildiği gibi, UUO ters ya da servikal bozma ile fare ötenazi ve histopatoloji analizi için böbrek toplar.
5. Döner Tek Taraflı Üreterik İkaz
- Adımlarda açıklandığı gibi R-UUO ameliyat öncesi, R UUO hazırlık görmüş bir fare hazırlamak gerçekleştirmek için 10,1-1,7.
- Varsa, cilt klipleri kaldırmak ve bölmek veya karın boşluğuna erişmek için periton sütür kaldırın. Not: üreter uzun vadeli deney cilt klipleri için engel olmuşsa uygulama aşağıdaki 7 gün kaldırılmış olmalıdır.
- Fareyi hazırlayın ve adımlar 1,8-2,2 açıklandığı gibi sol üreter izole.
- Açılı forseps kullanarak, oluşmuş olabilecek granülomatöz doku yumuşak duvarlı plastik boru ücretsiz.
- Bir neşter ile üreter etrafında plastik boru tutan dikiş kesin ve tüp çıkarın.
- Sol böbrekte hidronefroz varlığı için değerlendirerek başarılı UUO onaylayın, böbrek de soluk görünmelidir.
- Sütür arasındaki üreter bölün.
- Steril gazlı bez küçük bir parçası üzerinde, böbrek bağlı üreter kalan uzunluğu, yerleştirin. Bu üreter a akacak idrar sediment ve ölü hücreleri toplamak için kullanılacaknd dikiş kez renal pelvis kaldırılır.
- Yukarıdaki üreter bölün, ancak yakın, dikiş ve böbrek gazlı bez üzerine süzülmesini bekleyin. Mesaneye yakın, sağlam, düşük dikiş bırakın. Bu hiçbir idrar kesesinden ve periton boşluğuna sızıntı olmasını sağlamak için.
- Üreter ve renal pelvis boşaldıktan sonra, üreter kalan uzunluğu sonuna uzun bir 6 / Ç siyah örgü ipek sütür uygulayın. Bu daha sonra yapılan mesane anastomoz üreter yardımcı olmak için kullanılır.
- Mesane içine üreter kalan uzunluğunu anastomoz için aşağıdaki adımları izleyin:
- Bu orijinal konumuna anterior uzaklıkta ve böbrek üzerinde yer alır, öyle ki üreter getirin.
- Mesane yönünde ortaya şekilde üreter sonunda tek bir 9 / Ç poliamid monofilament sütür teyel 2 mm yerleştirin. Dikiş kas kat kalır ve üreter lümeni girmemesini sağlamak için özen gösterin. teyel dikiş will mesane üreter sabitlemek için kullanılır.
- Mesane ile kanal oluşturmak için, mesane ön (ventral) duvara doğru çıkar şekilde mesane ile çapraz bir 21G iğne geçmek.
- 21G iğne konik bir gözlü iğne dinlendirin. Mesane yoluyla gözlü iğne rehberlik 21G iğne kullanın. gözlü iğne mesane ile üreter almak için kullanılacaktır.
- 9 / Ç teyel dikiş geçmek, mesane ve dışarı giriş noktasına komşu mesane duvarı üzerinden ilk kesiden adım 5.11.2 yılında üreter başvurdu. Üreter mesane geçirilir sonra bu mesaneye üreter çapa bağlı olacaktır.
- Gözlü iğne ile adım 5.10 üreter sonunda uygulanan uzun 6 / Ç siyah örgü ipek sütür yerleştirin.
- Dikkatle üreter de mesane yoluyla çekilir sağlamak iken mesane dışına gözlü iğneyi çıkartın.
- Üreter th çıkan keze mesane gözlü iğneyi çıkarın ve geri mesane içine geri çekilmesini önlemek için üreter sonunda uzun dikiş için bir kelepçe uygulayın.
- Mesane yerde içinde üreter çapa, adım 5.11.5 uygulanan 9 / Ç poliamid monofilament tack dikiş, kravat.
- Sıkıca mesane içinde üreter demirlemek için giriş noktası yaklaşık iki noktada adım 5.11.2 ve 5.11.5 açıklandığı gibi ek tek 9 / Ç poliamid monofilament sütür kravat uygulayın.
- Açılan makas arka kullanarak, acil üreter daha ortaya çıkarmak için hafifçe geri mesane duvarı itin.
- Üreter sonunda bulunan uzun dikiş üzerinde üreter bölün. Üreter mesane vücuda geri çekilmelidir. Bu üreter açık lümen teyit mesane açıklığından dışarı akan idrar gözlemlemek olağandır.
- 9 / Ç poliamid monofilament sütür ile mesane yara çıkış kapatın.
- Dikkatle içine bağırsakları yerinePeriton boşluğu.
- Adımlar 4,1-4,8 ayrıntılı olarak post-operatif bakım sağlayın.
- Böbrek 7 gün tipik, sıkıştırılmış kadar fare kurtarmak için izin verin.
- Deneysel son noktada, servikal dislokasyon ile fare euthanize ve histopatolojik analiz için böbrekleri toplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Böbrek görünümü değişir belirgin üreter tıkanıklığı takip ve soluk ve zaman palpasyonla gergin (Şekil 1) olur. Tıkanma ve böbrek pelvis üreter proksimalinde artan dilatasyon vardır. böbrek böbrek korteks ve medulla belirgin bir incelme elde uzamış tıkanma ile obstrüktif nefropati artar süresi olarak giderek atrofik hale gelir. Üreter tıkanıklığı iptali sonrasında, böbrek kan akımı artar renk ve doku ödemi giderir da koyulaşır. Onlar uzun süreli şişkinlik döneminde (Şekil 1) bir sonucu olarak biraz 'şalvar' kalabilir, ancak böbrek üreter ve renal pelvis dilatasyonu azalır. Doku kaybı derecesi, engelin süresine bağlı olacaktır doku atrofisi olan bir eleman kaçınılmazdır gibi de engel böbrek böbreği daha tipik olarak daha küçüktür.
Normal olmayan manipüle yerli böbrek Histoloji birçok tübüller belirgin (Şekil 2) lümen bir ayırt sahip tubulointerstitium kompakt tübüllere çevrili glomerüller ortaya koymaktadır. Üreter Obstrüksiyon üreter ve renal pelvis (Şekil 1) distansiyonu ve dilatasyon sonrasında (dilate tübüllerin Şekil 2'de ok) doku kesitlerinin histoloji kolayca belirgindir böbrek tübül dilatasyon artırarak eşlik ediyor. glomerüller tubulointerstitium sınırlı yaralanma ve yara izi ile bu modelde normal görünüm sergilerler. Bazı tübüller (Şekil 2) dilate kalabilir ama tübüler distansiyon ve dilatasyon kademeli ve önemli çözünürlük üreter tıkanıklığının rahatlama izler.
Şekil yerli, UUO ve R-UUO böbrekler, renal pelvis ve üreter 1. Görünüm. Erkek FVB fareler 7 gün boyunca tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) uygulandı. Fareler ya kurban edildi veya UUO sonra (R-UUO) tersine döndü ve böbrekler kurban öncesi 7 gün sıkıştırılmış. Çıkan kurban sırasında toplanmış bir yerli, UUO ve R-UUO böbrek, böbrek, renal pelvis, üreter, mesane görünümünü göstermektedir. Yerli böbrek ile karşılaştırıldığında UUO böbrek renkli hidronefrotik ve soluk görünür. Renal pelvis ve üreter biraz 'şalvar' kalır rağmen de-tıkanma sonrasında R-UUO böbrek sıkıştırılmış etti. R-UUO üreter nedeniyle mesane içine-anastomoz yeniden önce tıkalı kısmın kaldırılması UUO ve yerli böbrek daha kısa olduğuna dikkat edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. yerli, UUO ve R-UUO böbreklerin Temsilcisi histoloji. Erkek FVB fareler 7 gün boyunca tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) uygulandı. Fareler ya kurban edildi veya UUO sonra (R-UUO) tersine döndü ve böbrekler kurban öncesi 7 gün basıncı azaltmak için izin verdi. Temsilci fotomikrografikler: H & E (Büyütme x200), kontrol dışı manipüle yerli böbrek, böbrek UUO ve R-UUO böbrek böbrek bölümleri boyandı. Normal böbrek sağlıklı interstisyel, normal, kompakt tübül oluşur. Oklarla gösterilen tübüllerin bir dizi UUO aşağıdaki 7. günde önemli genişleme gösterir. Bunun aksine, boru şekilli dilatasyon belirgin UUO tersine takip eden 7 gün sonra azalır."Boş> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip ya da ifşa etmek çıkarları çatışan var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
