Protocol
Allgemeine Hinweise: Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften durch die Tiere verhängt (Scientific Procedures) Act 1986 Dieses Protokoll und das dazugehörige Video-Protokoll sind für einen Standard- UUO und einem R-UUO, die auf vielen durchgeführt werden durchgeführt Mausstämme. In der dazugehörige Video sind beide Verfahren auf die männliche C57BL / 6 Mäusen im Alter von 8 Wochen durchgeführt. Die in der repräsentative Ergebnisse Abschnitt präsentierten Daten wurden von männlichen FVB / n Mäusen erhalten.
Hinweis: Dieses Protokoll und die Video-Informationen begleiten, wie eine Standard UUO zuführen und R-UUO Verwendung der linken Ureter, jedoch können die gleichen Techniken leicht auf der rechten Harnleiter angewendet werden.
1. Vorbereitung der Tiere und Laparotomie
- Führen Sie alle mit sterilem (autoklaviert) Instrumente und Verbrauchsmaterialien.
- Injizieren Ketaminhydrochlorid (70 mg / kg) und Medetomidin Hydrochlorid (1 mg / kg) intraperitoneal anästhesiertdie Maus. Anmerkung: Die Dauer des resultierenden Anästhesieebene 4 h und keine zusätzliche Anästhesie erforderlich.
- Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch Verlust von Reflexen zB Zeh Prise.
- Entfernen Sie alle Haare rund um den Schnittbereich und bereiten die Bauchhaut für die Operation durch die Auftragung einer verdünnten Lösung Chlorhexidin.
- Platzieren Sie die Maus auf einem beheizten Operations Pad in Rückenlage und mit Low-Tack Klebeband fixieren die Gliedmaßen auf das Pad.
- Während der Prozedur überwacht die Maus auf Anzeichen von Verbrennungen aufgrund des erwärmten chirurgischen Pad. Wenn möglich, verwenden Sie eine nicht-elektrische Wärmequelle.
- Verabreichen analgetische durch eine subkutane Injektion von Buprenorphin-Hydrochlorid (0,06 mg / kg) und wenden Augensalbe korneale Trocknen zu verhindern.
- Machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt und einen Einschnitt der avaskulären Linea alba mit Trenngewebe Schere, um den Zugriff auf die Bauchhöhle zu gewinnen.
- Hängen Sie die Maus und legen Sie eine colibriRetraktors in die Inzision.
2. Einseitige Ureterobstruktion
- Mit sterilisierten Wattestäbchen Setzen Sie das linke Harnleiter durch Verschieben der Darm auf die rechte Seite der Bauchhöhle und sie mit feuchten Tücher.
- Mit abgewinkelten Pinzette isolieren und heben Sie den linken Ureter.
- Um eine Ureterobstruktion erstellen, zu ligieren die linke Harnleiter zweimal mit 6 / A schwarz geflochtenen Seidennaht irgendwo zwischen der Blase und Nierenbecken. Für Langzeitversuche, verwenden resorbierbares Nahtmaterial für alle Bauchoperationen. Alternativ kann eine Ligaturklammer zum Harnleiter angewendet werden.
- Um die Blase aus dem Harnleiter zu isolieren, teilen Sie die Harnleiter zwischen den beiden Nähten.
- Die Eingeweide vorsichtig wieder in die Bauchhöhle.
- Befolgen Sie die in Abschnitt 4 aufgeführten Schritte - postoperative Wiederherstellung und Pflege der Schnitt zu schließen und umgekehrt die Anästhesie.
3. Vorbereitung ReversiblE Einseitige Ureterobstruktion
- Bereiten Sie eine Maus für die Chirurgie und zu isolieren, die linke Harnleiter wie in den Schritten 1,1-2,2 oben beschrieben.
- Um eine Ureterobstruktion, die rückgängig gemacht werden kann erstellen, zu ligieren die linke Harnleiter zweimal mit 6 / A schwarz geflochtenen Seidenfaden in der Nähe der Blase. Verlassen das eine Ende des oberen Fadens solange dies wird verwendet, um den weichen Kunststoffschlauch walled der richtigen Stelle um den Harnleiter zu verankern.
- Einen Längsschlitz in einem 5 mm Länge der weichen Kunststoffschlauch walled so dass er offen, damit es auf den Harnleiter eingesetzt werden gespreizt werden. Jede weiche walled Silikonkunststoffschlauch mit einem Innendurchmesser von 1 mm und Außendurchmesser von 2 mm, können verwendet werden.
- Setzen Sie den weichen ummauerten Kunststoffschlauch sanft um den Harnleiter. Sicherzustellen, daß die langen Naht taucht von der Mitte des Schlitzes in dem Rohr, sobald es um den Harnleiter geschlossen.
- Legen Sie eine Länge von 6 / A-schwarzen geflochtenen Seidenfaden um die weichen, isolierter Rohr Einschließen des Harnleiters und Krawatteeinmal. Nun das lange Ende des Nahtmaterials, die sich aus der Mitte des Schlitzes in der Röhre, in Längsrichtung über den Schlauch, so dass sie auf der Oberseite des zuvor gebundenen Naht liegt.
- Binden Sie die Naht um den Schlauch befindet zweimal, um den Schlauch und den langen Nahtende in Position um den Harnleiter zu verankern.
Hinweis: Um die Bildung von Adhäsionen an der Harnleiter und der weichen Wandkunststoffschlauch zu verhindern, kann ein Haftreduktionslösung auf den Bereich um den Schlauch aufgetragen werden. - Die Eingeweide vorsichtig wieder in die Bauchhöhle.
4. Postoperative Erholung und Pflege
- Schließen Sie das Bauchfell mit Zierstich mit 5 / A-schwarzen geflochtenen Seidennaht und annähernd die Haut mit metallischen Hautklammern.
- Um das Risiko einer postoperativen Infektion zu minimieren, setzen ein Antiseptikum, wie Iod / Alkohol-Lösung auf die Bauchhaut.
- Teilweise umgekehrten Anästhesie mit Atipamezol Hydrochlorid (2 mg / kg) subkutan verabreicht. Verwalten Flüssigkeiten durch eine subkutane Injektion von 1 ml Kochsalzlösung erwärmt.
- Überwachen Sie die Maus, bis er das Bewusstsein wieder.
- Lassen Sie die Maus, um in einem beheizten Box bei 29 ° C für 24 Stunden gehalten erholen. Angefeuchtet Essen kann auch vorgesehen sein, um Flüssigkeit und Nahrungsaufnahme fördern.
- Lassen Sie die Maus, um zu erholen, um einen gewünschten Grad der Behinderung, in der Regel 7 Tage zu induzieren.
- Für langfristige Erholung Experimente liefern laufenden Analgetika. Wenn die Maus für mehr als 7 Tagen wiederhergestellt werden, entfernen Sie die Hautklammern 7 Tage nach der Operation.
- Sobald der gewünschte Grad der Verstopfung induziert worden ist, entweder die Rückwärts UUO, wie unten beschrieben, oder euthanize die Maus durch zervikale Dislokation und sammeln die Nieren für histopathologische Analyse.
5. Reversible Einseitige Ureterobstruktion
- So führen Sie eine R-UUO bereiten eine Maus, die Vorbereitung auf die R-UUO unterzogen wurde, für eine Operation wie in den Schritten 10,1-1,7.
- Falls vorhanden, entfernen Sie die Hautklammern und teilen oder entfernen Sie die Fäden in das Bauchfell, um den Zugang zur Bauchhöhle zu gewinnen. Hinweis: Wenn die Harnleiter wurde für ein Langzeitversuch Hautklammern behindert worden war, sollte entfernt 7 Tage nach der Anwendung haben.
- Bereiten Sie die Maus und isolieren Sie die linke Harnleiter wie in den Schritten 1,8 bis 2,2 beschrieben.
- Mit abgewinkelten Pinzette, müssen Sie den weichen ummauerten Kunststoffschlauch von jedem Granulationsgewebe, die sich gebildet haben können.
- Schneiden Sie den Faden Halten der Kunststoffschlauch um den verstopften Ureter mit einem Skalpell und den Schlauch zu entfernen.
- Bestätigen erfolgreiche UUO durch die Beurteilung für das Vorhandensein von Hydronephrose in der linken Niere, sollte die Nieren auch erscheinen blass.
- Teilen Sie den Harnleiter zwischen den Nähten.
- Legen Sie die Restlänge der Harnleiter in die Niere angeschlossen ist, auf einem kleinen Stück steriler Gaze. Dies wird verwendet, um den Urinsediment und toten Zellen, die aus dem Harnleiter ein Ablass sammeln werdennd Nierenbecken, sobald das Nahtmaterial entfernt wird.
- Teilen Sie den Harnleiter oben, aber in der Nähe, die Naht und lassen Sie die Niere auf die Gaze zu entleeren. Verlassen Sie die untere Naht, am nächsten an der Blase, intakt. Dies ist, um sicherzustellen, daß kein Urin aus der Blase und in die Bauchhöhle austreten.
- Sobald die Harnleiter und Nierenbecken wurden abgelassen, gelten ein lang 6 / A-schwarzen geflochtenen Seidennaht bis zum Ende der Restlänge des Harnleiters. Dies wird verwendet, um den Harnleiter zu Blasen Anastomose später durchgeführt unterstützen.
- Gehen Sie folgendermaßen vor, um die verbleibende Länge der Harnleiter in die Blase anastomosieren:
- Drehen des Harnleiters, daß er liegt vor in ihre ursprüngliche Position und liegt über die Niere.
- Legen Sie eine einzelne 9 / A-Polyamid-Monofilament Heftnaht 2 mm vom Ende des Harnleiters, dass er in Richtung der Blase entsteht. Achten Sie darauf, dass der Faden bleibt in der Muskelschicht und nicht in die Harnröhre Lumen. Die Heftnaht will verwendet werden, um den Harnleiter in die Blase zu verankern.
- Um einen Kanal durch die Blase zu erstellen, übergeben Sie eine 21G Nadel diagonal durch die Blase, so dass er in Richtung der vorderen (ventralen) Wand der Blase verlässt.
- Seien Sie ein Augen Nadel in der Schräge der 21G Nadel. Verwenden Sie die 21G Nadel, um die Augen Nadel durch die Blase zu führen. Die gemusterte Nadel verwendet, um den Harnleiter durch die Blase zu tragen.
- Passieren die 9 / O Heftnaht aufgebracht, um den Harnleiter in Schritt 5.11.2, durch den ersten Einschnitt in der Harnblase und durch die Blasenwand angrenzend an die Eintrittsstelle. Sobald der Harnleiter durch die Blase geleitet wird dies gebunden werden, um die Harnröhre in die Blase zu verankern.
- Legen Sie die lange 6 / A-schwarzen geflochtenen Seidenfaden durch die Augen Nadel in Schritt 5.10 bis zum Ende des Harnleiters angewendet.
- Die Augen Nadel vorsichtig herausziehen aus der Blase gleichzeitig sicherzustellen, dass der Harnleiter wird auch durch die Blase gezogen.
- Sobald die Harnleiter geht aus the Blase entfernen gemustert Nadel und Anwendung einer Klammer an der langen Naht am Ende des Harnleiters Zurückziehen wieder in die Blase zu verhindern.
- Um den Harnleiter im Ort in der Blase zu verankern, das Ja-9 / A-Polyamid-Monofilament Heftnaht im Schritt 5.11.5 angewendet.
- Bewerben zusätzlichen Einzel 9 / A-Polyamid-Monofilament Krawatte Nähten wie in den Schritten 5.11.2 und 5.11.5 an zwei Standorten rund um den Einstieg beschrieben fest zu verankern den Harnleiter in die Blase.
- Mit der Rückseite geöffnet Schere, drücken Sie die Blasenwand ein wenig zurück, um mehr des austretenden Harnleiter aus.
- Unterteilen den Harnleiter über dem lang Naht am Ende des Harnleiters angeordnet. Der Harnleiter ist in den Körper der Blase zurückzuziehen. Es ist üblich, um Urin aus der Öffnung in der Blase fließt, zu beobachten, was bestätigt, das freie Lumen des Harnleiters.
- Schließen Sie die Ausgabe in der Blase aufgewickelt mit einem 9 / A-Polyamid-Monofilament Naht.
- Die Eingeweide vorsichtig wieder indie Bauchhöhle.
- Geben post-operative Betreuung wie in Schritten von 4,1 bis 4,8 beschrieben.
- Lassen Sie die Maus, um zu erholen, bis die Nieren dekomprimiert, in der Regel 7 Tage.
- Bei der experimentellen Endpunkt, einschläfern die Maus durch Genickbruch und sammeln die Nieren zur histopathologischen Analyse.
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Representative Results
Das Aussehen der Nierenveränderungen deutlich folgende Ureterobstruktion und es wird heller und angespannt Palpation mit der Zeit (Abbildung 1). Es gibt zunehmende Ausdehnung des Ureters proximal der Obstruktion und des Nierenbeckens. Die Niere wird zunehmend atrophische wie die Dauer obstruktiver Nephropathie steigt mit längerer Obstruktion was zu einer deutlichen Verdünnung der Nierenrinde und Medulla. Nach der Auflösung des Ureterobstruktion, wird die Farbe der Niere dunkler Blutfluss erhöht und Gewebsödeme verrechnet. Die Erweiterung der Harnleiter und Nierenbecken der Niere nachlässt, obwohl sie etwas "ausgebeult" als Folge der Periode verlängert Distension (Figur 1) zu bleiben. Die de-verstopft Niere ist typischerweise kleiner als die kontralaterale Niere als Element Gewebeatrophie unvermeidlich obwohl der Grad der Gewebeverlust hängt von der Dauer der Blockierung ab.
Histologie des normalen unmanipulierten nativen Nieren zeigt Glomeruli durch die kompakte Tubuli Tubulointerstitium umgeben mit vielen Röhren mit einer erkennbaren Lumens deutlich (Abbildung 2). Nach Ureterobstruktion die Ausdehnung und Erweiterung der Harnleiter und Nierenbecken (Abbildung 1) wird durch die Erhöhung Erweiterung der Nierentubuli, die leicht erkennbar ist der Histologie von Gewebeschnitten (erweiterte Tubuli in Abbildung 2 Pfeil) begleitet. Die Glomeruli zeigen eine normale Erscheinung in diesem Modell mit Verletzungen und Narbenbildung zu Tubulointerstitium beschränkt. Schrittweise und signifikante Auflösung des rohrförmigen Ausdehnung und Erweiterung folgt das Relief Ureterobstruktion obwohl einige Tubuli kann erweitert (Abbildung 2) zu bleiben.
Abbildung 1. Aussehen von nativen, UUO und R-UUO Nieren, Nierenbecken und Harnleiter. Männlich FVB Mäusen unter einseitige Ureterobstruktion (UUO) für 7 Tage. Die Mäuse wurden entweder getötet oder UUO wurde dann umgekehrt (R-UUO) und die Nieren für 7 Tage vor der Tötung dekomprimiert. Bilder illustrieren die Darstellung der Niere, des Nierenbeckens, der Harnleiter und Blase eines nativen, UUO und R-UUO Niere bei der Opferung gesammelt. Im Vergleich zum nativen Nieren die UUO Nieren erscheint hydronephrotischen und blass in der Farbe. Nach de-Obstruktion der R-UUO Niere dekomprimiert wenn das Nierenbecken und Harnleiter bleiben leicht "baggy". Beachten Sie, dass die R-UUO Harnleiter ist kürzer als die UUO und native Niere durch Entfernung des verengten Teils vor der erneuten Anastomose in die Blase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Representative Histologie der nativen, UUO und R-UUO Nieren. Männlich FVB Mäusen unter einseitige Ureterobstruktion (UUO) für 7 Tage. Die Mäuse wurden entweder getötet oder UUO wurde dann umgekehrt (R-UUO) und die Nieren gestattet, für 7 Tage vor der Tötung dekomprimieren. Vertreter Mikroaufnahmen (Vergrößerung: x200) von H & E gefärbten Nierenschnitte von Steuer nicht manipulierten nativen Niere, UUO Nieren- und R-UUO Niere. Die gesunde Interstitium der normalen Niere normaler kompakter Röhren besteht. Eine Anzahl von Röhren durch die Pfeile zeigen signifikante Dilatation am Tag 7 folgende UUO. Im Gegensatz dazu Rohr Dilatation deutlich um 7 Tagen nach Auflösung von UUO reduziert.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konkurrenz oder widerstreitende Interessen offen zu legen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
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