En Muse Modell av Irreversible og Reversibel Ensidig ureter Obstruksjon

Protocol

Generell veiledning: Dyreforsøk ble utført i samsvar med de retningslinjer og forskrifter pålagt av Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986. Denne protokollen og den medfølgende video-protokollen er for både en standard UUO og en R-UUO, som kan utføres på mange musestammer. I den medfølgende video, er begge prosedyrer utført på mannlige C57BL / 6 mus i alderen 8 uker. Dataene som presenteres i den representative resultater delen ble hentet fra mannlige FVB / n mus.

MERK: Denne protokollen og medfølgende video detaljer hvordan å utføre en standard UUO og R-UUO utnytte venstre ureter, men de samme teknikkene kan lett brukes til høyre ureter.

1. Animal Forberedelse og Laparotomi

1. Utføre alle prosedyrer med sterile (autoklaveres) instrumenter og forbruksmateriell.
2. Injiser ketamin-hydroklorid (70 mg / kg) og medetomidin hydroklorid (1 mg / kg) intraperitonealt til å bedøvemusen. Merk: Varigheten av den resulterende bedøvelse planet er 4 timer, og ingen tilleggs anestesi er nødvendig.
3. Bekreft anestesidybden ved tap av reflekser f.eks, tå klype.
4. Fjern alle hår rundt innsnitt området og forberede magehuden for kirurgi via anvendelse av en fortynnet klorheksidin løsning.
5. Plasser musen på en oppvarmet kirurgisk pad i liggende stilling og fikse lemmer til puten ved hjelp av lav-tack tape.
6. Under prosedyren overvåke mus for tegn på brannskader som et resultat av den oppvarmede kirurgisk puten. Hvis det er mulig å bruke en ikke-elektrisk varmekilde.
7. Administrere smertestillende etter en subkutan injeksjon av buprenorfinhydroklorid (0.06mg / kg) og gjelder øye smøremiddel for å unngå hornhinnen tørking.
8. Lag en midtlinjen laparotomi og et snitt av de avascular linea alba bruker vev skille saks for å få tilgang til bukhulen.
9. Drapere musen og sette inn en colibrirullen i snittet.

2. Ensidig ureter Obstruksjon

1. Ved hjelp av steriliserte bomulls knopper eksponere den venstre urinleder ved å forskyve tarmen mot høyre side av bukhulen og dekke dem med fuktet gardiner.
2. Ved hjelp av vinklede pinsett isolere og løft venstre ureter.
3. Å skape en ureteric obstruksjon, ligate venstre ureter to ganger med 6 / O svart flettet silke sutur hvor som helst mellom blære og nyrebekken. For langsiktige eksperimenter, bruker absorberbare sutur for alle mage operasjoner. Alternativt kan en ligering klipp brukes til ureter.
4. Å isolere blæren fra ureter, dele ureter mellom de to sting.
5. Erstatte tarmen nøye inn i bukhulen.
6. Følg fremgangsmåten i punkt 4 - postoperative og omsorg for å lukke såret og reversere anestesi.

3. Forberedelse til Reversible Ensidig ureter Obstruksjon

1. Forberede en mus for kirurgi og isolere venstre ureter som beskrevet i trinn 1.1 til 2.2 ovenfor.
2. Å skape en ureteric hindring som kan reverseres, ligate venstre ureter to ganger med 6 / O svart flettet silke sutur nær blæren. La den ene enden av den øvre sutur lenge som dette skal brukes til å feste den myke vegger plastrøret på plass rundt ureter.
3. Foreta en langsgående sliss i en 5 mm lengde av myk vegger plastrør slik at den kan bli spredd åpen for å tillate den å bli brukt til ureter. Alle vegger myk silikon plastrør med en indre diameter på 1 mm og ytre diameter på 2 mm, kan anvendes.
4. Plasser den myke vegger plastrør forsiktig rundt ureter. Sørg for at den lange sutur kommer fra midten av sporet i slangen når den er lukket rundt ureter.
5. Plasser en lengde på 6 / O svart flettet silke sutur rundt den myke vegger rør omslutter urinleder og slipsgang. Nå plasserer den lange ende av suturen, som kommer ut fra midten av slissen i røret, i lengderetningen på tvers av slangen, slik at den ligger oppå den tidligere bundet sutur.
6. Bind suturen plassert rundt røret to ganger for å feste rør og den lange sutur ende på plass rundt ureter.
   Merk: For å forhindre adhesjonsdannelse på urinlederen og den myke vegger plastrør, kan en reduksjon av adhesjonen løsningen påføres til området rundt slangen.
7. Erstatte tarmen nøye inn i bukhulen.

4. postoperative og omsorg

1. Lukk peritoneum med teppe sting bruker 5 / O svart flettet silke sutur og tilnærme huden ved hjelp av metalliske hudklemmer.
2. For å minimalisere risikoen for postoperative infeksjoner, anvende et antiseptikum så som jod / alkoholoppløsning til den abdominale hud.
3. Delvis omvendt anestesi med atipamezol hydroklorid (2 mg / kg) subkutant. Administrere væsker ved en subkutan injeksjon av en ml varmet saltvann.
4. Overvåke musen før den har kommet til bevissthet.
5. Tillat musen for å utvinne i en oppvarmet boks holdt ved 29 ° C i 24 timer. Fuktet mat kan også gis for å oppmuntre væske og ernæring inntaket.
6. La musen for å gjenvinne til å indusere et ønsket nivå av obstruksjon, vanligvis 7 dager.
7. For langsiktige utvinning eksperimenter, gi løpende analgetika. Hvis musen er å bli gjenvunnet i mer enn 7 dager, fjerne hudklemmer 7 dager etter operasjonen.
8. Så snart den ønskede grad av hindringen er blitt indusert, enten reversere UUO, som beskrevet nedenfor, eller avlive musen ved cervikal dislokasjon og samle nyrene for histopatologi analyse.

5. Reversibel Ensidig ureter Obstruksjon

1. Å utføre en R-UUO forberede en mus, som har gjennomgått forberedelse til R-UUO, for kirurgi som beskrevet i trinn 10,1 til 1,7.
2. Hvis den finnes, fjerne hud klipp og dele eller fjerne sting i bukhinnen å få tilgang til bukhulen. Merk: Hvis ureter har blitt hindret for en langsiktig eksperiment hudklemmer burde vært fjernet 7 dager etter søknad.
3. Klargjør mus og isolerer den venstre urinleder som beskrevet i trinn 1.8 til 2.2.
4. Ved hjelp av vinklede tang, frigjøre den myke vegger plastrør fra noen granulomatøs vev som kan ha dannet.
5. Kutt sutur holder plastrør rundt hindret ureter med en skalpell og fjerne slangen.
6. Bekrefte vellykket UUO ved å vurdere for tilstedeværelse av hydronephrosis i den venstre nyre, må nyren også vises blek.
7. Fordel ureter mellom sting.
8. Plasser den gjenværende lengde av ureter, festet til nyren, på en liten del av sterilt gasbind. Dette vil bli brukt for å samle opp urin sediment og døde celler som vil renne fra en ureternd nyrebekken gang sutur fjernes.
9. Fordel ureter over, men nær, suturen og tillate nyrene til å renne ut på gasbind. Forlater den nedre sutur, nærmest blæren, intakt. Dette er for å sikre at ingen urin vil lekke ut fra blæren og inn i bukhulen.
10. Når ureter og nyrebekken har blitt drenert, gjelder en lang 6 / O sort flettet silkesutur til enden av den gjenværende lengde av ureter. Dette vil bli brukt for å hjelpe til ureter til blæren anastomose utført senere.
11. Følg trinnene nedenfor for å anastomose de resterende lengden av ureter i blæren:
    1. Snu ureter, slik at den ligger fremre til sin opprinnelige stilling og ligger over nyrene.
    2. Plasser en enkelt 9 / O polyamid-monofilament sutur slag 2 mm fra enden av ureter, slik at det fremkommer i retning av blæren. Pass på å sikre at sutur forblir i muskel strøk og ikke kommer i ureter lumen. Den slag sutur will brukes til å forankre ureter inn i blæren.
    3. For å opprette en kanal gjennom blæren, passere en 21G nål diagonalt gjennom blæren, slik at det kommer ut mot frontpartiet (ventrale) veggen av blæren.
    4. Hvile en eyed nål i vinkel av 21G nål. Bruk 21G nål for å lede øyet nålen gjennom blæren. Den øyet nålen vil bli brukt for å ta ureter inn i blæren.
    5. Bestå 9 / O slag sutur, påføres ureter i trinn 5.11.2, gjennom det første innsnitt i urinblæren og ut gjennom blæreveggen nær inngangspunktet. Når ureter føres gjennom blæren vil dette bli bundet til å forankre ureter til blæren.
    6. Plasser lang 6 / O sort flettet silkesutur anvendt til enden av ureter i trinn 5.10 gjennom øyne nålen.
    7. Trekke forsiktig øyet nålen ut av blæren og samtidig sikre at urinlederen også er trukket gjennom blæren.
    8. Når ureter kommer fra the blære fjerne øyet nålen og anvende en klemme til den lange sutur ved enden av ureter til å hindre tilbaketrekning inn i blæren.
    9. Å forankre ureter innenfor plass i blæren, knytte 9 / O polyamidmonofilament tack sutur, anvendt i trinn 5.11.5.
    10. Påfør ekstra enkelt 9 / O polyamidmonofilament tie sting som beskrevet i trinn 5.11.2 og 5.11.5 på to steder rundt inngangspunkt til fast anker ureter i blæren.
    11. Bruke baksiden av åpnede saks, push blæreveggen tilbake litt for å eksponere mer av emergent ureter.
    12. Fordel ureter over lange suturen plassert ved enden av ureter. Ureter, må trekke inn i legemet av blæren. Det er vanlig å observere urin som strømmer ut av åpningen i blæren, noe som bekrefter de åpne lumen av ureter.
    13. Lukk exit sår i blæren med en 9 / O polyamidmonofilament sutur.
12. Erstatte nøye tarmen innbukhulen.
13. Gi postoperativ behandling som beskrevet i trinn 4.1 til 4.8.
14. Tillat musen til å gjenopprette til nyren blir dekomprimert, vanligvis 7 dager.
15. Ved den eksperimentelle endepunkt, avlive musen ved cervikal dislokasjon og samle nyrene for histopatologisk analyse.

Representative Results

Utseendet til nyreforandringer markert følgende ureter obstruksjon og det blir blekere og anspent til palpasjon med tid (figur 1). Det er økende dilatasjon av ureter proksimale til hindringen og nyrebekken. Nyrene blir stadig atrofisk som varigheten av obstruktiv nefropati øker med langvarig obstruksjon som fører til en markert tynning av nyrebarken og medulla. Etter reversering av ureter obstruksjon, blir fargen på nyre mørkere som blodstrøm øker og vev ødem løser. Den utvidelse av ureter og nyrebekken i nyrene avtar selv om de kan være litt "pose 'som en følge av langvarig periode på distensjon (figur 1). Den de-hindret nyre er typisk mindre enn den kontralaterale nyre som et element av vevet atrofi er uunngåelig, selv om graden av tap av vev, vil avhenge av varigheten av obstruksjon.

Histologi av den normale ikke-manipulert opprinnelige nyre avslører glomeruli omgitt av de kompakte tubuli i tubulointerstitium med mange rørelementer som har en merkbar lumen åpenbar (figur 2). Etter ureter obstruksjon distensjon og utvidelse av ureter og nyrebekken (figur 1) er ledsaget av økende utvidelse av nyretubuli som er lett synlig på histologi av vevssnitt (utvidede tubuli arrowed i figur 2). Glomeruli vise en normal opptreden i denne modellen med skade og arrdannelse begrenset til tubulointerstitium. Gradvis og betydelig oppløsning av det rørformede distensjon og dilatasjon følger lindring av ureter hindring selv om enkelte rørelementene kan forbli utvidet (figur 2).

Figur 1. Utseende av innfødte, UUO og R-UUO nyrer, nyrebekken og ureter. Mann FVB mus gikk ensidig ureter obstruksjon (UUO) i 7 dager. Mus ble enten avlivet eller UUO ble deretter reversert (R-UUO) og nyrene dekomprimeres i 7 dager før offer. Bildene viser utseendet av nyre, nyrebekken, urinleder og blære av native, UUO og R-UUO nyre innhøstet ved tidspunktet for avlivelse. I forhold til den opprinnelige nyre den UUO nyre vises hydronephrotic og blek i fargen. Etter de-obstruksjon R-UUO nyre har dekomprimeres om nyrebekken og ureter forbli litt "baggy". Legg merke til at R-UUO ureter er kortere enn den UUO og innfødte nyre på grunn av fjerning av hindret del før re-anastomose inn i blæren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Representant histologi av innfødte, UUO og R-UUO nyrer. Mann FVB mus gikk ensidig ureter obstruksjon (UUO) i 7 dager. Mus ble enten avlivet eller UUO ble deretter reversert (R-UUO) og nyrene lov til å dekomprimere i 7 dager før offer. Representative photomicrographs (Forstørrelse: X200) fra H & E farget nyre seksjoner fra kontroll ikke-manipulert innfødte nyre, UUO nyre og R-UUO nyre. Den friske interstitium av normal nyre består av vanlige kompakte tubuli. En rekke tubuli indikerte av piler utvise betydelig utvidelse på dag 7 etter UUO. I motsetning til dette er rørformet dilatasjon markert redusert ved 7 dager etter reversering av UUO.blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-10
Toothed forceps	Fine Science Tools	11021-12
Angled forceps x 2	Fine Science Tools	00649-11
Straight forceps	Fine Science Tools	00632-11
Colibri 3 cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	12565-14
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock	Fine Science Tools	12060-01
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Heat electronic pad	Cozee Comfort	n/a
6/O silk braided suture	Harvard Apparatus	72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1111434
5/O braided silk suture	Harvard Apparatus	51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Becton, Dickinson and Company	305175
1 ml syringe slip tip	Becton, Dickinson and Company	300184
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	Sterilised (Autoclave)
Plain drapes	Guardian	CB03	Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing			Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin	Baxter		Adhesion reduction solution
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323