Protocol
Algemeen Begeleiding: Animal experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften opgelegd door de Dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986. Dit protocol en de bijbehorende video-protocol zijn voor zowel een standaard UUO en een R-UUO, die kan worden uitgevoerd op vele muisstammen. In de bijbehorende video worden beide procedures uitgevoerd op mannelijke C57BL / 6-muizen van 8 weken. De in de sectie representatieve resultaten gegevens werden verkregen uit mannelijke FVB / n muizen.
Opmerking: Dit protocol en bijbehorende video beschreven hoe een standaard UUO voeren en R-UUO gebruikmaking van de linker ureter, maar dezelfde technieken kunnen gemakkelijk worden toegepast op de juiste ureter.
1. Dierlijke Voorbereiding en Laparotomie
- Voer alle procedures met steriel (geautoclaveerd) instrumenten en verbruiksgoederen.
- Injecteer ketamine hydrochloride (70 mg / kg) en medetomidine hydrochloride (1 mg / kg) intraperitoneaal te verdovende muis. Opmerking: De duur van de resulterende verdoving vlak 4 uur en geen aanvullende verdoving vereist.
- Bevestig de diepte van de anesthesie door het verlies van reflexen bijvoorbeeld, teen knijpen.
- Verwijder al het haar rond de incisie gebied en de voorbereiding van de buikhuid voor een operatie via de toepassing van een verdunde chloorhexidine oplossing.
- Plaats de muis op een verwarmde chirurgische pad in een liggende positie en bevestig de ledematen aan de pad met behulp van low-tack plakband.
- Tijdens de procedure controleren de muis op tekenen van verbrandingen ten gevolge van de verwarmde chirurgische pad. Als het mogelijk is gebruik maken van een niet-elektrische warmtebron.
- Dien analgeticum door een subcutane injectie van buprenorfine hydrochloride (0.06mg / kg) en oog smeermiddel op drogen cornea voorkomen.
- Voeg een middellijn laparotomie en een insnijding van de avasculaire linea alba middels weefsel scheiden schaar om toegang tot de buikholte krijgen.
- Draperen de muis en plaats een colibriretractor in de incisie.
2. Eenzijdige Ureteric Obstructie
- Met behulp van gesteriliseerde wattenstaafjes de linker ureter bloot door het verplaatsen van de darmen naar de rechterkant van de buikholte en bedek ze met vochtige doeken.
- Met behulp van schuine tang isoleren en til de linker urineleider.
- Om een ureteric obstructie te creëren, afbinden van de linker ureter tweemaal met 6 / O zwart gevlochten zijden hechtdraad ergens tussen de blaas en nierbekken. Voor de lange termijn experimenten, gebruiken absorbeerbare hechting voor alle abdominale ingrepen. Als alternatief kan een ligerende clip worden toegepast op de ureter.
- De blaas van de ureter te isoleren, verdelen de ureter tussen de twee hechtingen.
- Vervang de darmen voorzichtig in de peritoneale holte.
- Volg de in paragraaf 4 vermelde stappen - herstel na operaties en Zorg aan de incisie te sluiten en het ombuigen van de anesthesie.
3. Voorbereiding voor Reversible Eenzijdige Ureteric Obstructie
- Bereid een muis voor de operatie en isoleren van de linker ureter zoals beschreven in de stappen 1,1-2,2 hierboven.
- Een ureteric obstructie die kan worden omgekeerd maken ligeren van de linker ureter tweemaal met 6 / O zwart gevlochten zijden hechtdraad dichtbij de blaas. Laat één uiteinde van de bovenste hechtdraad zolang deze wordt gebruikt om de zachte walled plastic buizen verankeren plaats rond de ureter.
- Voeg een langssleuf in een 5 mm lengte van zachte walled plastic buis zodanig dat het open om te worden toegepast op de urineleider kunnen worden gespreid. Elke zachte ommuurde silicone plastic buis met een inwendige diameter van 1 mm en buitendiameter van 2 mm, worden gebruikt.
- Plaats de zachte ommuurde plastic buizenstelsel zachtjes rond de urineleider. Verzeker dat de lange hechtdraad Uit het midden van de spleet in de buis eenmaal is gesloten rond de ureter.
- Plaats een lengte van 6 / O zwart gevlochten zijden hechtdraad rond de zachte ommuurde buis bijvoeging van de urineleider en bindeenmaal. Plaats nu het lange uiteinde van de hechtdraad, die uit het midden van de spleet in de buis, in langsrichting over de buis zodanig dat het ligt bovenop de eerder gebonden hechtdraad.
- Bind de hechtdraad gelegen rond de buis tweemaal om de slang en de lange hechtdraad einde in plaats rond de urineleider te verankeren.
Opmerking: adhesievorming de ureter en de zachte walled plastic buis te voorkomen kan een adhesie reductieoplossing worden toegepast op het gebied rond de buis. - Vervang de darmen voorzichtig in de peritoneale holte.
4. Post-operatief herstel en Zorg
- Sluit het buikvlies met festonsteek met behulp van 5 / O zwart gevlochten zijden hechtdraad en benaderen de huid met behulp van metalen huid clips.
- Om het risico van postoperatieve infectie minimaliseren, breng een antiseptisch zoals jood / alcoholoplossing de buikhuid.
- Gedeeltelijk omgekeerde anesthesie met atipamezolhydrochloride (2 mg / kg) subcutaan. Dien fluïda door een subcutane injectie van 1 ml verwarmd zoutoplossing.
- Toezien op de muis totdat hij bij bewustzijn is.
- Laat de muis te herstellen in een verwarmde doos bij 29 ° C gedurende 24 uur. Bevochtigd voer kunnen ook zijn voorzien om fluïdum en voedingsopname bevorderen.
- Laat de muis te herstellen tot een gewenst niveau van obstructie, kenmerkend 7 dagen induceren.
- Voor de lange termijn herstel experimenten, bieden lopende analgetica. Als de muis te vorderen langer dan 7 dagen, verwijder de huid clips 7 dagen na de operatie.
- Zodra de gewenste obstructie is geïnduceerd, hetzij omgekeerde UUO, zoals hieronder beschreven, of euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en verzamel de nieren voor histopathologisch onderzoek.
5. Omkeerbare Eenzijdige Ureteric Obstructie
- Voor het uitvoeren van een R-UUO bereiden een muis, die de voorbereiding voor R-UUO heeft ondergaan, voor een operatie, zoals beschreven in stap 10,1-1,7.
- Indien aanwezig, neem de skin clips splitsen of verwijderen hechtingen in het peritoneum toegang tot de buikholte krijgen. Opmerking: Als de urineleider werd gehinderd voor een lange termijn experiment huid clips moeten zijn verwijderd 7 dagen na toepassing.
- Bereid de muis en isoleer de linker ureter zoals beschreven in stap 1,8 tot 2,2.
- Met behulp van schuine pincet, gratis de zachte ommuurde plastic slang van elke granulomateuze weefsel dat kan hebben gevormd.
- Snijd de hechtdraad die de plastic slang rond de verstopte urineleider met een scalpel en verwijder de slang.
- Bevestig succesvolle UUO door beoordeling van de aanwezigheid van hydronephrosis in de linker nier, dient de nier ook verschijnen bleek.
- Verdeel de ureter tussen de hechtingen.
- Overgebleven lengte van ureter, aan de nieren, een klein stukje steriel gaas. Dit wordt gebruikt om het urinesediment en dode cellen die wegtrekken uit de ureter een verzamelennd nierbekken wanneer de hechtdraad wordt verwijderd.
- Verdeel de ureter hierboven, maar nabij de hechtdraad en laat de nier uitlekken op het gaas. Laat de onderste hechtdraad, het dichtst bij de blaas, intact. Dit is om te voorkomen dat urine lekt uit de blaas en in de peritoneale holte.
- Zodra de ureter en nierbekken zijn geleegd toepassen lange 6 / O zwart gevlochten zijden hechtdraad aan het einde van de resterende lengte van de ureter. Dit wordt gebruikt om de ureter blaas anastomose later uitgevoerde steun.
- Volg de onderstaande stappen om de resterende duur van de urineleider anastomose in de blaas:
- Draai de ureter, zodat het ligt anterior naar de uitgangspositie en ligt over de nier.
- Plaats één 9 / O polyamide monofilament hechtmateriaal tacking 2 mm van het uiteinde van de ureter, zodat blijkt in de richting van de blaas. Let erop dat de hechting blijft in de gespierde jas en niet de urineleider lumen voeren. De overstag hechtdraad will worden gebruikt om de ureter in de blaas verankeren.
- Om een kanaal door de blaas te maken, langs een 21G naald diagonaal door de blaas, zodat deze uit naar de voorzijde (ventrale) wand van de blaas.
- Rusten een eyed naalden in de schuine kant van de 21G naald. Gebruik de 21G naald om de ogen naald te begeleiden bij de blaas. De ogen naald wordt gebruikt om de ureter maken door de blaas.
- Leid de 9 / O tacking hechtdraad, toegepast op de ureter in stap 5.11.2, door de eerste incisie in de blaas en uit door de blaaswand nabij de ingang. Zodra de ureter wordt door de blaas wordt deze gekoppeld aan de ureter naar de blaas verankeren.
- Plaats de lange 6 / O zwart gevlochten zijden hechtdraad aangebracht op het einde van de ureter in stap 5.10 door de ogen naald.
- Trekken voorzichtig de ogen naald uit de blaas tegelijkertijd voor zorgen dat de urineleider ook wordt getrokken door de blaas.
- Zodra de ureter Uit the blaas verwijder de ogen naald en een klem toepassing op de lange hechting aan het einde van de ureter om terugtrekken terug in de blaas te voorkomen.
- Om de urineleider binnen plaats te verankeren in de blaas, bind de 9 / O polyamide monofilament tack hechtdraad, toegepast in stap 5.11.5.
- Gelden aanvullende enkele 9 / O polyamide monofilament stropdas hechtingen, zoals beschreven in de stappen 5.11.2 en 5.11.5 op twee locaties rond het toegangspunt tot het stevig verankeren van de urineleider in de blaas.
- De achterkant van geopende schaar, drukt de blaaswand weer iets meer van de opkomende urineleider bloot.
- Verdeel de ureter boven de lange hechting aan het einde van de ureter. De ureter moet terugtrekken in het lichaam van de blaas. Het is gebruikelijk om urine stroomt uit de opening in de blaas te observeren, bevestigt de open lumen van de ureter.
- Sluit de uitgang wond in de blaas met een 9 / O polyamide monofilament hechtdraad.
- Plaats voorzichtig de darmen inde peritoneale holte.
- Post-operatieve zorg, zoals beschreven in de stappen 4,1-4,8.
- Laat de muis om te herstellen totdat de nieren wordt gedecomprimeerd, meestal 7 dagen.
- Aan de experimentele eindpunt, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en het verzamelen van de nieren voor histopathologische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het uiterlijk van de nierveranderingen aanzienlijk na ureterale obstructie en wordt bleker en gespannen palpatie met de tijd (Figuur 1). Er is steeds dilatatie van de ureter proximaal van de obstructie en het nierbekken. De nier wordt steeds atrofische de duur van obstructieve nefropathie toeneemt met verlengde obstructie resulteert in een sterke verdunning van de renale cortex en medulla. Naar aanleiding van de omkering van de ureteric obstructie, de kleur van de nier wordt donkerder als de doorbloeding toeneemt en weefseloedeem lost. De dilatatie van de ureter en nierbekken van de nier verdwijnt weliswaar enigszins 'baggy' als gevolg van de lange periode van distensie (figuur 1) kunnen blijven. Het belemmerd de nier is meestal kleiner dan de contralaterale nier als element van weefsel atrofie is onvermijdelijk, hoewel de mate van weefselverlies zal afhangen van de duur van obstructie.
Histologie van de normale niet-gemanipuleerde natieve nier openbaart glomeruli omringd door de compacte tubuli van de tubulointerstitium vele tubuli een waarneembare lumen zichtbaar (figuur 2). Na ureterale obstructie de uitzetting en dilatatie van de ureter en nierbekken (figuur 1) gepaard gaat met een dilatatie van de renale tubuli die gemakkelijk duidelijk histologisch van weefselsecties (tubuli verwijd pijlen in figuur 2). De glomeruli vertonen een normale verschijning in dit model met verwondingen en littekens beperkt tot de tubulointerstitium. Geleidelijke en significante oplossing van het tubulaire distentie en dilatatie volgt de verlichting van ureter obstructie hoewel sommige tubuli verwijd kunnen blijven (Figuur 2).
Figuur 1. Verschijning van inheemse, UUO en R-UUO nieren, het nierbekken en de urineleider. Man FVB muizen onderging eenzijdige ureteric obstructie (UUO) gedurende 7 dagen. Muizen werden ofwel opgeofferd of de UUO werd vervolgens omgedraaid (R-UUO) en de nieren gedecomprimeerd voor 7 dagen voor het offer. Beelden tonen het uiterlijk van de nieren, nierbekken, ureter en blaas van een natief, UUO en R-UUO nier geoogst op het tijdstip van opoffering. In vergelijking met de natieve nier wordt de UUO nier hydronephrotic en bleek van kleur. Naar aanleiding van de-obstructie van de R-UUO nier heeft uitgepakt hoewel het nierbekken en urineleider blijft iets 'baggy'. Merk op dat de R-UUO urineleider is korter dan de UUO en inheemse nieren als gevolg van het verwijderen van de belemmerd gedeelte voorafgaande aan het opnieuw anastomose in de blaas. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger histologie van inheemse, UUO en R-UUO nieren. Man FVB muizen onderging eenzijdige ureteric obstructie (UUO) gedurende 7 dagen. Muizen werden ofwel opgeofferd of de UUO werd vervolgens omgedraaid (R-UUO) en de nieren mogen uitpakken voor 7 dagen voor het offer. Vertegenwoordiger microfoto (vergroting: x200) van H & E gekleurde niersecties van controle niet-gemanipuleerde inheemse nier, UUO nieren en R-UUO nier. De gezonde interstitium van de normale nier is opgebouwd uit normale compact tubuli. Een aantal buisjes met de pijlen aangegeven vertonen significante dilatatie op dag 7 na UUO. Daarentegen wordt tubulaire dilatatie duidelijk verlaagd 7 dagen na omkering van UUO.blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende of tegenstrijdige belangen te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
