Protocol
Guía General: Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos y regulaciones impuestas por los Animales (Procedimientos Científicos) Ley de 1986. Este protocolo y el protocolo de vídeo que acompaña son tanto para una OUU estándar y un R-OUU, que se puede realizar en muchos cepas de ratón. En el video que acompaña, ambos procedimientos se llevan a cabo en ratones machos C57BL / 6 ratones de 8 semanas. Los datos presentados en la sección de resultados representativos se obtuvieron de machos FVB / n ratones.
NOTA: Este protocolo y acompañando detalles del video de cómo realizar una OUU estándar y R-OUU utilizando el uréter izquierdo, sin embargo las mismas técnicas pueden ser fácilmente aplicadas al uréter derecho.
1. Preparación de los animales y laparotomía
- Realice todos los procedimientos con instrumentos estériles (en autoclave) y consumibles.
- Inyectar clorhidrato de ketamina (70 mg / kg) y clorhidrato de medetomidina (1 mg / kg) por vía intraperitoneal para anestesiarel ratón. Nota: La duración del plano anestésico resultante es de 4 horas y no se requiere anestesia suplementaria.
- Confirme la profundidad de la anestesia por la pérdida de los reflejos por ejemplo, pizca dedo del pie.
- Eliminar todo el pelo que rodea el área de la incisión y preparar la piel para la cirugía abdominal a través de la aplicación de una solución de clorhexidina diluido.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla quirúrgica climatizada en posición supina y fijar las extremidades a la almohadilla con cinta adhesiva de baja adherencia.
- Durante el procedimiento, supervisar el ratón para detectar signos de quemaduras térmicas como resultado de la almohadilla quirúrgica calentada. Si es posible utilizar una fuente de calor no eléctrico.
- Administrar analgésico mediante una inyección subcutánea de hidrocloruro de buprenorfina (0.06mg / kg) y aplicar lubricante ocular para evitar el secado de la córnea.
- Hacer una laparotomía media y una incisión de la línea alba avascular utilizando tejido que separa las tijeras para obtener acceso a la cavidad peritoneal.
- Coloque el ratón e inserte un colibriretractor en la incisión.
2. Unilateral ureteral Obstrucción
- El uso de bastoncillos de algodón esterilizados exponer el uréter izquierdo desplazando los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal y cubre con paños humedecidos.
- Con unas pinzas en ángulo aislar y levantan el uréter izquierdo.
- Para crear una obstrucción de la uretra, ligar el uréter izquierdo dos veces con 6 / O trenzado negro sutura de seda en cualquier lugar entre la vejiga y pelvis renal. Para los experimentos a largo plazo, el uso de sutura absorbible para todas las cirugías abdominales. Alternativamente, un clip de ligadura se puede aplicar con el uréter.
- Para aislar la vejiga al uréter, divida el uréter entre los dos puntos de sutura.
- Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos a la cavidad peritoneal.
- Siga los pasos que se indican en la Sección 4 - Recuperación Post-Operativo y Cuidado para cerrar la incisión y revertir la anestesia.
3. Preparación para Reversible unilateral ureteral Obstrucción
- Preparar un ratón para la cirugía y aislar el uréter izquierdo tal como se detalla en los pasos 1.1 a 2.2 anteriormente.
- Para crear una obstrucción de la uretra que puede ser revertida, ligar el uréter izquierdo dos veces con 6 / O trenzado negro sutura de seda cerca de la vejiga. Deja un extremo de la sutura superior siempre y cuando este se utiliza para anclar el tubo de plástico de pared suave en su lugar alrededor del uréter.
- Hacer una hendidura longitudinal en una longitud de 5 mm de tubo de plástico de pared blanda, que puede ser extendió abierta para permitir que se aplique con el uréter. Cualquier tubo de plástico blando de silicona amurallada, con un diámetro interno de 1 mm y un diámetro exterior de 2 mm, se puede utilizar.
- Coloque el tubo de plástico de paredes suaves suavemente alrededor del uréter. Asegúrese de que el largo de la sutura emerge desde el centro de la ranura en el tubo una vez que se cierra alrededor del uréter.
- Coloque una longitud de 6 / O trenzado negro sutura de seda alrededor de la tubería de pared suave que encierra el uréter y ataruna vez. Ahora coloque el extremo largo de la sutura, emergiendo desde el centro de la ranura en el tubo, longitudinalmente a través de la tubería de manera que se sitúe en la parte superior de la sutura previamente atado.
- Ate la sutura situado alrededor del tubo dos veces para anclar la tubería y el extremo largo de sutura en su lugar alrededor de la uretra.
Nota: Para evitar la formación de adherencias en el uréter y el tubo de plástico de pared suave, una solución de reducción de la adhesión se puede aplicar a la zona alrededor de la tubería. - Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos a la cavidad peritoneal.
Recuperación y Cuidados 4. Post-Operativo
- Cierre del peritoneo con puntada manta usando 5 / O trenzado negro sutura de seda y aproximar la piel con clips metálicos de la piel.
- Para minimizar el riesgo de infección post-operatoria, aplicar un antiséptico tal como una solución de yodo / alcohol a la piel abdominal.
- Parcialmente anestesia atrás con clorhidrato de atipamezol (2 mg / kg) por vía subcutánea. Administrar fluidos por una inyección subcutánea de 1 ml de solución salina calentada.
- Monitorear el ratón hasta que se haya recuperado la conciencia.
- Deje que el ratón se recupere en una caja climatizada mantenido a 29 ° C durante 24 horas. Comida humedecida también se puede proporcionar para estimular la ingesta de líquidos y la nutrición.
- Deje el ratón para recuperar para inducir un nivel deseado de obstrucción, típicamente de 7 días.
- Para los experimentos de recuperación a largo plazo, proporcionar analgésicos en curso. Si el ratón se ha de recuperar por más de 7 días, retire los clips de la piel 7 días después de la cirugía.
- Una vez que el nivel deseado de obstrucción ha sido inducida, ya sea invertir la OUU, como se describe a continuación, o la eutanasia el ratón por dislocación cervical y recoger los riñones para el análisis de la histopatología.
5. reversible unilateral ureteral Obstrucción
- Para realizar una R-OUU preparar un ratón, que ha sido objeto de preparación para R-OUU, para la cirugía como se describe en los pasos 10,1-1,7.
- Si está presente, quitar los clips de la piel y dividir o eliminar las suturas en el peritoneo para obtener acceso a la cavidad abdominal. Nota: Si el uréter ha sido obstruido por un largo plazo clips piel experimento debería haber sido eliminado 7 días después de la aplicación.
- Preparar el ratón y aislar el uréter izquierdo tal como se describe en los pasos 1.8 a 2.2.
- Con unas pinzas en ángulo, liberar el tubo de plástico de paredes blandas de cualquier tejido granulomatoso que se hayan formado.
- Cortar la sutura sujeta el tubo de plástico alrededor del uréter obstruido con un bisturí y retire el tubo.
- Confirme éxito OUU mediante la evaluación de la presencia de hidronefrosis en el riñón izquierdo, el riñón también debería aparecer pálido.
- Divida el uréter entre las suturas.
- Coloque la longitud restante del uréter, que se adjunta en el riñón, en un pequeño trozo de gasa estéril. Esto será utilizado para recoger el sedimento urinario y las células muertas que drenará desde el uréter unand pelvis renal una vez que la sutura se retira.
- Divida el uréter por encima, pero cerca, la sutura y permitir que el riñón para drenar en la gasa. Deja la sutura inferior, más cercana a la vejiga, intacto. Esto es para asegurar que no tendrá fugas de orina desde la vejiga y en la cavidad peritoneal.
- Una vez que el uréter y pelvis renal han sido drenados, aplicar un largo 6 / O negro sutura de seda trenzada hasta el final de la longitud restante del uréter. Esto se utiliza para ayudar el uréter a la vejiga anastomosis realizada más tarde.
- Siga los pasos de abajo para anastomose la longitud restante de uréter en la vejiga:
- Girar el uréter manera que se sitúe anterior a su posición original y se encuentra sobre el riñón.
- Coloque un solo 9 / O monofilamento de poliamida viradas de sutura 2 mm desde el extremo del uréter tal que emerge en la dirección de la vejiga. Tener cuidado para asegurar que la sutura permanece en la capa muscular y no entra en el lumen del uréter. El wil sutura viradasl se utiliza para anclar el uréter en la vejiga.
- Para crear un canal a través de la vejiga, pasar una aguja 21G en diagonal a través de la vejiga, tales que sale hacia el frontal (ventral) de la pared de la vejiga.
- Descanse una aguja de ojos en el bisel de la aguja 21G. Utilice la aguja 21G para guiar la aguja de ojos a través de la vejiga. La aguja de ojos se utilizará para tomar el uréter a través de la vejiga.
- Pasar el viradas de sutura 9 / O, aplicado con el uréter en el paso 5.11.2, a través de la primera incisión en la vejiga y hacia fuera a través de la pared de la vejiga adyacente al punto de entrada. Una vez que el uréter se pasa a través de la vejiga, esto será atado para anclar el uréter a la vejiga.
- Coloque el largo 6 / O sutura de seda trenzada negro aplicada al extremo del uréter en el paso 5.10 través de la aguja de ojos.
- Retirar cuidadosamente la aguja de ojos fuera de la vejiga garantizando al mismo tiempo que el uréter también se tira a través de la vejiga.
- Una vez que el uréter emerge de The vejiga retire la aguja de ojos y aplicar una abrazadera a la larga de sutura en el extremo del uréter para evitar la retracción de nuevo en la vejiga.
- Para anclar el uréter dentro de lugar en la vejiga, atar el 9 / O de poliamida de sutura monofilamento de pegajosidad, aplicada en el paso 5.11.5.
- Aplicar individuales 9 / O poliamida suturas lazo monofilamento adicionales como se describe en los pasos 5.11.2 y 5.11.5 en dos localidades de todo el punto de entrada para anclar firmemente el uréter en la vejiga.
- Con el dorso de tijeras abiertas, empuje la pared de la vejiga hacia atrás ligeramente para exponer más del uréter emergente.
- Divida el uréter por encima de la sutura larga situada en el extremo del uréter. El uréter debe retraerse en el cuerpo de la vejiga. Es habitual observar orina que fluye fuera de la abertura en la vejiga, lo que confirma el lumen abiertos del uréter.
- Cierre el orificio de salida en la vejiga con un monofilamento de poliamida de sutura 9 / O.
- Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos enla cavidad peritoneal.
- Proporcionar cuidados postoperatorios, como se detalla en los pasos 4.1 a 4.8.
- Deje que el ratón para recuperar hasta que se descomprime el riñón, por lo general 7 días.
- En el punto final experimental, la eutanasia el ratón por dislocación cervical y recoger los riñones para el análisis histopatológico.
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Representative Results
La aparición de los cambios renales notablemente tras obstrucción ureteral y se convierte en más pálido y tenso a la palpación con el tiempo (Figura 1). Hay una creciente dilatación del uréter proximal a la obstrucción y la pelvis renal. El riñón se vuelve cada vez atrófica como la duración de los aumentos de nefropatía obstructiva con obstrucción prolongada que resulta en una marcada adelgazamiento de la corteza renal y médula. A raíz de la inversión de la obstrucción de la uretra, el color del riñón se vuelve más oscuro a medida que aumenta el flujo sanguíneo y resuelve edema tisular. La dilatación del uréter y pelvis renal del riñón disminuye aunque pueden quedar ligeramente 'holgada' como consecuencia del período de distensión prolongada (Figura 1). El riñón de-obstruido es típicamente menor que el riñón contralateral como un elemento de la atrofia del tejido es inevitable aunque el grado de la pérdida de tejido dependerá de la duración de la obstrucción.
Histología de riñón nativo no manipulado normal muestra glomérulos rodeados por los túbulos compactas de la tubulointerstitium con muchos túbulos que tiene un lumen discernible evidente (Figura 2). Tras la obstrucción ureteral la distensión y la dilatación del uréter y pelvis renal (Figura 1) está acompañada por el aumento de la dilatación de los túbulos renales que es fácilmente evidente en la histología de secciones de tejido (túbulos dilatados señalan con flechas en la Figura 2). Los glomérulos presentan una apariencia normal en este modelo con lesiones y cicatrices confinado al tubulointerstitium. Resolución gradual y significativa de la distensión tubular y dilatación sigue el alivio de la obstrucción ureteral aunque algunos túbulos pueden permanecer dilatado (Figura 2).
Figura 1. Aspecto de Uuo, y R-Uuo riñones, pelvis renal y el uréter nativo. Ratones FVB machos se realizó la obstrucción ureteral unilateral (OUU) durante 7 días. Los ratones fueron sacrificados o bien a continuación, la OUU se invirtió (R-OUU) y los riñones descomprimen durante 7 días antes del sacrificio. Imágenes ilustran la apariencia del riñón, pelvis renal, uréter y la vejiga de un, OUU y R-OUU riñón nativo cosechada en el momento del sacrificio. En comparación con el riñón nativo riñón OUU aparece hidronefrótico y de color pálido. Después de-obstrucción del riñón R-OUU ha descomprimido aunque la pelvis renal y el uréter se mantienen ligeramente 'baggy'. Observe que el uréter R-OUU es más corta que la OUU y riñón nativo debido a la eliminación de la parte obstruida antes de volver a la anastomosis en la vejiga. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representante de la histología, Uuo y R-Uuo riñones nativos. Ratones FVB machos se realizó la obstrucción ureteral unilateral (OUU) durante 7 días. Los ratones fueron sacrificados o bien a continuación, la OUU se invirtió (R-OUU) y los riñones permite descomprimir durante 7 días antes del sacrificio. Microfotografías representativas (Ampliación: x200) de H & E manchadas secciones de riñón de control no manipulados riñón nativo, OUU riñón y R-OUU riñón. El intersticio saludable del riñón normal se compone de túbulos compactos normales. Un número de túbulos indicadas por las flechas muestran la dilatación significativa en el día 7 después de la OUU. En contraste, la dilatación tubular se reduce notablemente a los 7 días después de la reversión de la OUU.blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Disclosures
Los autores no tienen competencia o conflictos de intereses a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
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