Protocol
Allmänt Råd: Djurförsök har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som införts av de djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986. Detta protokoll och tillhörande video-protokollet är både en standard UUO och en R-UUO, vilket kan utföras på många musstammar. I den medföljande videon, är båda förfarandena utförs på manliga C57BL / 6 möss åldern 8 veckor. De data som presenteras i avsnittet representativa resultat erhölls från manliga FVB / n möss.
OBS: Detta protokoll och tillhörande video detaljer hur du utför en standard UUO och R-UUO utnyttja vänstra urinledaren, men samma teknik kan lätt appliceras på rätt urinledaren.
1. Djur Förberedelse och Laparotomi
- Utför alla procedurer med sterila (autoklaveras) instrument och förbrukningsvaror.
- Injicera ketaminhydroklorid (70 mg / kg) och medetomidin-hydroklorid (1 mg / kg) intraperitonealt till sövamusen. Obs: varaktighet resultenarkos planet är 4 tim och ingen extra anestesi krävs.
- Bekräfta anestesidjupet genom förlust av reflexer, t.ex., tå nypa.
- Ta bort allt hår kring snittet området och förbereda bukhuden för kirurgi genom tillämpning av en utspädd klorhexidin lösning.
- Placera musen på en uppvärmd kirurgisk dyna i ryggläge och fixa benen till dynan med hjälp lätthäftande tejp.
- Under förfarandet, övervaka musen för tecken på brännskador som ett resultat av den uppvärmda kirurgiska dynan. Om möjligt använda en icke-elektrisk värmekälla.
- Administrera analgetikum genom en subkutan injektion av buprenorfinhydroklorid (0,06 mg / kg) och tillämpa öga smörjmedel för att förhindra korneal torkning.
- Gör en mittlinjen laparotomi och ett snitt av avaskulär linea alba använder vävnads separera sax för att få tillgång till bukhålan.
- Häng med musen och infoga en colibrisårhaken i snittet.
2. Ensidig ureteric Obstruktion
- Använda steriliserade bomullspinnar exponera den vänstra urinledaren genom att förskjuta tarmarna mot höger sida av bukhålan och täck dem med fuktiga draperier.
- Använda vinklade pincett isolera och lyft den vänstra urinledaren.
- För att skapa en ureteric obstruktion, underbinda den vänstra urinledaren två gånger med 6 / O svart flätat silkesutur någonstans mellan urinblåsan och njurbäckenet. För långsiktiga experiment använder absorber sutur för alla buken. Alternativt kan en ligeringsklämmor appliceras på urinledaren.
- För att isolera blåsan från urinledaren, dela urinledaren mellan de två suturer.
- Försiktigt ersätta tarmarna in i bukhålan.
- Följ stegen som anges i avsnitt 4 - postoperativ återhämtning och vård för att stänga snittet och vända anestesi.
3. Förberedelse för Reversible Ensidig ureteric Obstruktion
- Förbered en mus för kirurgi och isolera den vänstra urinledaren som beskrivs i steg 1,1-2,2 ovan.
- För att skapa en ureteric obstruktion som kan vändas, underbinda den vänstra urinledaren två gånger med 6 / O svart flätat silkesutur nära urinblåsan. Lämna en ände av den övre suturen länge detta kommer att användas för att förankra den mjuka väggar plaströr på plats runt urinledaren.
- Gör en längsgående slits i en 5 mm längd av mjuk walled plaströr, så att den kan utspärrade öppen för att tillåta att den kan appliceras på urinledaren. Varje mjuk walled silikon plaströr, med en inre diameter av 1 mm och yttre diameter av 2 mm, kan användas.
- Placera den mjuka muromgärdade plaströr försiktigt runt urinledaren. Kontrollera att den långa suturen kommer ut ur centrum av slitsen i röret när den är stängd runt urinledaren.
- Placera en längd av 6 / O svart flätat silkesutur runt mjuka muromgärdade slangen omsluter urinledaren och slipsgång. Placera nu den långa änden av suturen, som kommer ut från centrum av slitsen i slangen, längs över slangen så att den ligger på toppen av tidigare bundna sutur.
- Bind suturen ligger runt slangen två gånger för att förankra slangen och den långa suturen änden på plats runt urinledaren.
Obs: För att förhindra vidhäftning bildning på urinledaren och den mjuka muromgärdade plaströr, kan en minskning vidhäftningslösning appliceras på området runt slangen. - Försiktigt ersätta tarmarna in i bukhålan.
4. postoperativ återhämtning och vård
- Stäng bukhinnan med filt stygn med hjälp 5 / O svart flätat silkesutur och närma huden med metalliska hud klipp.
- För att minimera risken för postoperativ infektion, applicera ett antiseptikum, såsom jod / alkohollösningen till bukhuden.
- Delvis omvända anestesi med atipamezolhydroklorid (2 mg / kg) subkutant. Administrera fluider genom en subkutan injektion av 1 ml värmt saltlösning.
- Övervaka musen tills den har återhämtat medvetandet.
- Låt musen för att återhämta sig i en uppvärmd låda hålls vid 29 ° C under 24 timmar. Fuktad mat kan också ges för att uppmuntra vätska och näringsintag.
- Låt musen för att återhämta sig för att inducera en önskad nivå av obstruktion, typiskt 7 dagar.
- För långsiktiga återhämtningsförsök, ger pågående analgetika. Om musen är att återvinna mer än 7 dagar, ta bort klippen huden 7 dagar efter operation.
- När väl den önskade graden av obstruktion har inducerats, antingen vända UUO, såsom beskrivs nedan, eller avliva musen genom cervikal dislokation och samla njurar för histopatologisk analys.
5. Vändbar Ensidig ureteric Obstruktion
- För att utföra en R-UUO förbereda en mus, som har genomgått en förberedelse för R-UUO, för operation som beskrivs i steg 10,1-1,7.
- Om de är närvarande, ta bort klämmorna hud och dela eller avlägsna suturerna i peritoneum för att få tillträde till bukhålan. Obs: Om urinledaren har försvårat för ett långsiktigt experiment hud klipp borde ha tagits bort 7 dagar efter ansökan.
- Förbered musen och isolera den vänstra urinledaren som beskrivs i steg 1,8-2,2.
- Använda vinklade pincett, befria den mjuka muromgärdade plastslang från någon granulomatös vävnad som kan ha bildats.
- Skär suturen håller plaströr runt blockeurinledaren med en skalpell och ta bort slangen.
- Bekräfta lyckad UUO genom en bedömning med avseende på närvaron av hydronefros i vänster njure, bör njuren också vara bleka.
- Dela upp i urinledaren mellan suturer.
- Placera resterande längden av urinledaren, fäst till njuren, på en liten bit av steril gasväv. Detta kommer att användas för att samla in urinsediment och döda celler som kommer att rinna ur urinledaren and njurbäcken gång suturen avlägsnas.
- Dividera urinledaren ovan, men nära, suturen och tillåta njuren rinna ut på gasväven. Lämna den nedre suturen, närmast urinblåsan, intakt. Detta för att säkerställa att ingen urin kommer att läcka från blåsan och in i bukhålan.
- När urinledaren och njurbäcken har tömts, applicera en lång 6 / O svart flätad silkessutur till slutet av den återstående längden av urinledaren. Detta kommer att användas för att hjälpa urinledaren till urinblåsan anastomos utförs senare.
- Följ stegen nedan för att anastomos den kvarvarande urinledaren till urinblåsan:
- Vrid urinledaren så att det ligger anterior till sitt ursprungliga läge och ligger över njuren.
- Placera ett enda 9 / O polyamid enfibertråd slående sutur 2 mm från änden på urinledaren, så att den framträder i riktningen av blåsan. Var noga med att se till att suturen kvar i muskel päls och inte kommer in i urinledaren lumen. Slag sutur will användas för att förankra urinledaren i blåsan.
- För att skapa en kanal genom urinblåsan, passera en 21G nål diagonalt genom urinblåsan så att det kommer ut i riktning mot den främre (ventrala) väggen i urinblåsan.
- Vila en eyed nål i fasningen på 21G nål. Använd 21G nål för att styra eyed nål genom urinblåsan. Den eyed Nålen kommer att användas för att ta urinledaren genom blåsan.
- Passera 9 / O häftning sutur, appliceras på urinledaren i steg 5.11.2, genom den första snittet i blåsan och ut genom blåsväggen intill inkörsport. När urinledaren ledes genom blåsan detta kommer att knytas till förankra urinledaren till urinblåsan.
- Placera den långa 6 / O svart flätad silkessutur anbringas på änden av urinledaren i steg 5,10 genom synat nålen.
- Försiktigt dra tillbaka eyed nålen ur blåsan och samtidigt säkerställa att urinledaren är också dras genom urinblåsan.
- När urinledaren framgår av the blåsan avlägsna synat nål och applicera en klämma till den långa suturen vid änden av urinledaren för att förhindra tillbakadragning tillbaka in i urinblåsan.
- För att förankra urinledaren inom plats i blåsan, knyta 9 / O polyamid monofilament please sutur, tillämpas i steg 5.11.5.
- Applicera ytterligare enkel 9 / O polyamid monofilament slips suturer som beskrivs i steg 5.11.2 och 5.11.5 på två platser runt inkörsport till fast förankra urinledaren inom blåsan.
- Använda baksidan av öppnade sax, skjuta blåsväggen tillbaka något för att exponera mer av den framväxande urinledaren.
- Dela upp i urinledaren ovanför den långa sutur ligger i slutet av urinledaren. Den urinledaren bör dras tillbaka in i kroppen av blåsan. Det är vanligt att observera urin strömmar ut ur öppningen i blåsan, vilket bekräftar de öppna lumen av urinledaren.
- Stäng utgångs lindad i blåsan med en 9 / O polyamid monofilamentsutur.
- Försiktigt ersätta tarmarna inperitonealhålan.
- Ge postoperativ vård som beskrivs i steg 4,1-4,8.
- Låt musen för att återhämta sig förrän njuren dekomprimeras, typiskt 7 dagar.
- Vid den experimentella slutpunkt, euthanize musen genom cervikal dislokation och samla njurar för histopatologisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utseendet på njurförändringar markant efter ureteric obstruktion och det blir blekare och spänd för palpation med tiden (Figur 1). Det finns en ökande dilatation av urinledaren proximala till hindret och njurbäckenet. Njuren blir allt atrofisk som varaktigheten av obstruktiva nefropati ökar med långvarig obstruktion resulterar i en markant gallring av njurbarken och medulla. Efter återföring av ureteric obstruktion, färgen på njuren blir mörkare när blodflödet ökar och vävnadsödem beslutar. Den dilatation av urinledaren och njurbäckenet i njuren avtar även om de kan förbli något "baggy" som en följd av den period av långvarig buk (Figur 1). Den de-hindras njure är typiskt mindre än den kontra njuren som en del av vävnadsatrofi är oundvikligt även om graden av vävnadsförlust beror på hur länge hindret.
Histologi av den normala icke-manipulerade infödda njure avslöjar glomeruli omgivna av de kompakta tubuli i tubulointerstitium med många tubuli har en urskiljbar lumen uppenbar (Figur 2). Efter ureteric obstruktion av buk och utvidgning av urinledaren och njurbäckenet (Figur 1) åtföljs av ökad dilatation av njurtubuli som är lätt uppenbart på histologi av vävnadssnitt (vidgade tubuli pil i figur 2). Glomeruli uppvisar ett normalt utseende i denna modell med skador och ärrbildning begränsad till tubulointerstitium. Gradvis och betydande upplösning av tubulär dilatation och dilatation följer lindring av ureteric obstruktion men vissa tubuli kan förbli dilaterade (Figur 2).
Figur 1. Utseende av inhemska, UUO och R-UUO njurar, njurbäcken och urinledare. Man FVB möss gick unilateral ureteric obstruktion (UUO) under 7 dagar. Möss antingen offrades eller UUO därefter vänt (R-UUO) och njurarna expand 7 dagar före offer. Bilder visar utseendet på njuren, njurbäckenet, urinledare och urinblåsa av en infödd, UUO och R-UUO njure skördas vid tidpunkten för offret. I jämförelse med den infödda njuren för UUO njuren verkar hydronephrotic och blek i färgen. Efter de-obstruktion R-UUO njure har expand även njurbäckenet och urinledaren förbli något "baggy". Observera att R-UUO urinledaren är kortare än UUO och infödda njure på grund av avlägsnandet av den blocke delen före åter anastomos i urinblåsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant histologi av inhemska, UUO och R-UUO njurar. Man FVB möss gick unilateral ureteric obstruktion (UUO) under 7 dagar. Möss antingen offrades eller UUO därefter vänt (R-UUO) och njurarna tillåts att expandera under 7 dagar före avlivning. Representativa mikrofotografier (Förstoring: x200) av H & E färgade njursektioner från kontroll ej manipuleras infödda njure, UUO njure och R-UUO njure. Den hälso interstitium av den normala njur består av normala kompakta tubuli. Ett antal tubuli indikeras av pilarna uppvisar signifikant dilatation vid dag 7 efter UUO. Däremot är tubulär dilatation minskas markant vid 7 dagar efter återföring av UUO.blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande eller motstridiga intressen att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
