Summary
الماوس الأسلاك الشريان الفخذي نموذج إصابة عودة التضيق يمثل تحديا تقنيا. في هذا البروتوكول نقدم لك مجموعة من التفاصيل التقنية الأساسية ضرورية لأداء بنجاح إصابة سلك للحث على neointima متسقة لدراسات عودة التضيق.
Abstract
أمراض القلب والأوعية الدموية الناجمة عن تصلب الشرايين هو السبب الرئيسي للوفاة في العالم المتقدم. تضييق التجويف السفينة، بسبب تطور وحة تصلب الشرايين أو تمزق لويحات المعمول بها، يقطع تدفق الدم العادي مما يؤدي إلى حالة مرضية مختلفة مثل احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية. في إجراءات عيادة اللف مثل الاوعية الدموية تتم عادة لإعادة فتح التجويف. ومع ذلك، هذه العلاجات يضر حتما جدار الوعاء الدموي وكذلك بطانة الأوعية الدموية مما اثار ردا الشفاء المفرطة وتطوير لوحة neointimal الذي يمتد في التجويف مما تسبب في عودة التضيق سفينة (إعادة تضييق). يبقى عودة التضيق سببا رئيسيا من أسباب فشل العلاج اللف لتصلب الشرايين. وهكذا، النماذج الحيوانية قبل السريرية للعودة التضيق هي ذات أهمية حيوية للتحقيق في الآليات المرضية في جسم المريض وكذلك نهج متعدية للتدخلات الأوعية الدموية. بين عدة experime الفئراننماذج ntal، يتم قبول إصابة سلك الشريان الفخذي على نطاق واسع باعتباره الأنسب لإجراء دراسات من عودة التضيق بعد قسطرة لأنه يشبه الإجراء الاوعية الدموية الذي يصيب كل من البطانة وجدار الوعاء الدموي. ومع ذلك، العديد من الباحثين يجدون صعوبة في الاستفادة من هذا النموذج بسبب درجة عالية من الصعوبة التقنية. هذا هو في المقام الأول لأن الأسلاك المعدنية يحتاج إلى إدراجها في الشريان الفخذي، وهو ما يقرب من ثلاث مرات أرق من السلك، لتوليد إصابة كافية للحث على neointima بارزة. هنا، نحن تصف تفاصيل الجراحية الضرورية للتغلب على نحو فعال الصعوبات التقنية الرئيسية لهذا النموذج. وذلك باتباع الإجراءات المقدمة، أداء الماوس إصابة الفخذ سلك الشريان يصبح أسهل. مرة واحدة إطلاع، ويمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في غضون 20 دقيقة.
Protocol
بيان الأخلاق: ملاحظة: جميع إجراءات تتوافق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (مطبعة الأكاديميات القومية، الطبعة 8، 2011)، والبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ويسكونسن. تم تنفيذ جميع العمليات الجراحية تحت التخدير الأيزوفلورين (من خلال استنشاق، معدل التدفق 2 مل / دقيقة)، وبذلت كل الجهود للحد من المعاناة. الموت الرحيم كانت الحيوانات في غرفة شغل تدريجيا مع CO 2.
1. تحريض التخدير العام والجلد شق
- استخدام الذكور C57BL / 6 الفئران مع عصر 12-16 أسابيع ووزن 23-28 ز. تخدير الحيوان قبل الأيزوفلورين من خلال جهاز تخدير الدائرة المغلقة. تأكيد التخدير السليم عن طريق معسر اصبع القدم. تطبيق بعض الدموع الاصطناعية مرهم على العينين لمنع جفاف.
- ضع الماوس في موقف ضعيف مع الطرف الأيسر هند خطف قليلا وSL مفصل الركبةاستعرضوا ightly. حلق الشعر في جميع أنحاء المنطقة اليسرى الفخذ العليا وتطهير الجلد مع الكلورهيكسيدين، تطبيق ثلاث مرات باستخدام قطن معقم تطبيقها يميل. استخدام حبة تعقيم الساخن للحفاظ على أدوات معقمة أثناء الجراحة.
- وضع ثنى الشاش المعقم على الساق اليسرى. جعل 1.5 سم على التوالي، الطولي شق الجلد على الفخذ الأيسر وسطي من مفصل الركبة إلى أعلى الفخذ (الشكل 1A).
2. التعرض للفخذي الشريان والفروع
ملاحظة: يبين الشكل 1B تشريح الأوعية الدموية الإجمالي في أعلى الفخذ. الشريان الفخذي السطحي (SFA) ويمكن ملاحظة من خلال مجهر تشريح عندما يتم شق الجلد بشكل صحيح على طول خط الوسط من الفخذ وسطي.
- فتح اللفافة رقيقة تغمر SFA مع ملاقط غرامة ثم حلقة SFA مع النايلون 9-0 خياطة.
ملاحظة: في هذه العملية، يتم وضع العصب الفخذي بسهولة كمابيئة تطوير متكاملة، ولكن الوريد الفخذي المجاورة يتطلب اهتماما وثيقا لجدارها رقيقة بحيث perforates بسهولة وينزف. تقنية رئيسية هي التركيز على الشريان نفسه؛ طالما يتم تشريح خارج بالقرب من الشريان، أي ضرر الوريد عرضي يمكن تجنبها. - بمجرد يحلق في SFA، مع الاستمرار على خياطة مع ملقط البعوض وتسحبه إلى الأسفل قليلا. هذه المناورة يجعل المزيد من تشريح أسهل، ولكن لتجنب إتلاف الشرايين لا سحب بقوة أيضا.
- مواصلة تشريح الشريان قريب لفضح وحلقة الشريان الفخذي مشترك (CFA) مع 9-0 النايلون خياطة.
ملاحظة: عادة، حلقات وCFA في القاصي وأشر إلى الشريان الشرسوفي (الشكل 1B) غير كافية لسلك الإدراج. عقد خياطة حلقة CFA مع ملقط البعوض في نفس الطريق. - سحب الخيط حلقة CFA صعودا وخياطة حلقة SFA الأسفل للكشف عن والتشعب من SFA والشريان الفخذي العميق (DFA). وزارة الشؤون الخارجية، الفرع الرئيسي للCFA،يذهب في اتجاه عضلة الفخذ (الشكل 1B).
ملاحظة: سيتم إدراج سلك من DFA في وقت لاحق. - حلقة DFA بمزيد من الحذر لأن متشابكة الوريد مجاور تحت الشريان. في حالة نزف الدم من الوريد، وهو ضغط بسيط 30- إلى 60 ثانية مع الشاش وعادة ما يكفي لإنتاج الارقاء.
- بمجرد يحلق في DFA مع النايلون 9-0 خياطة، تأكد من أن جميع الحلقات خياطة الثلاثة هي في المواضع الصحيحة الخاصة بهم (الشكل 2A).
- المضي قدما في تشريح DFA بشكل أقصى للligate الشريان عند نقطة أقصى حد ممكن من التشعب. قطع خياطة إضافية ولكن ترك مدة معينة بحيث طرفي يمكن عقد مع ملقط البعوض، والتي استقرار DFA جعل الإدراج سلك أسهل.
3. خلق إصابة سلك
- إدراج عبر الأسلاك DFA
- توتر الغرز CFA، SFA، وزارة الشؤون الخارجية لإنشاء مرقئ مؤقت.
- جعل ثقب صغير في DFومع microscissors. إدراج نصائح من microtweezers المنحني لتمدد حفرة كبيرة بما يكفي لسلك بقطر 0.015 بوصة (الشكل 2B يدل على الفرق بين حجم الشريان وسلك).
- قبل إحداث ثقب في DFA، وتخفيف خياطة حلقة CFA وبلطف المشبك / ضغط على DFA عدة مرات مع microtweezers مملة ذات الرؤوس. هذه المناورة توسع قطر الشرايين بشكل ملحوظ لتخفيف الإدراج الأسلاك. تبليل السلك تماما مع PBS المهم للالإدراج السلس أيضا.
- عندما إحداث ثقب في DFA، لا اقتصاص جدران الشرايين، ولكن تأكد على شكل حرف V صغير ارتشف وقرصة رفرف مع microtweezers حادة ذات الرؤوس للتلاعب.
- أدخل السلك من خلال ثقب كاف-تمدد عضلة على DFA. بلطف مضي قدما في سلك نحو الشريان الحرقفي في حين تخفيف حلقة خياطة في جميع أنحاء CFA. 5-8 ملم يكفي لتغطية جميع طول CFA في معظم الحالات (الشكل 2C
- ترك سلك داخل لمدة 1 دقيقة
- بعد إدخال السلك إلى طول الأمثل، وترك الأمر لمدة 1 دقيقة لتنهك جدران الشرايين. بلل السلك والشرايين مع برنامج تلفزيوني لمنع جفاف. يمكن وضعها خياطة آخر 9-0 النايلون حول الداني DFA إلى نقطة الأسلاك الإدراج خلال هذه الفترة الانتظار. وسيتم استخدام هذا الخيط في وقت لاحق لإغلاق ثقب في DFA بعد إزالة الأسلاك.
- استرداد سلك واستئناف تدفق الدم
- عقد السلك مع ملقط سفينة القسطرة، وتسحبه إلى الوراء بلطف. يجب استرجاع السلك بسلاسة. للتغلب على أي مقاومة، والناجمة عادة عن طريق تمسك السلك إلى جدار الشرايين، والانسحاب السلك مع دوران طيف مفيد. مرة أخرى، يمكن أن مناورة قوية تؤدي إلى فقدان الحيوان.
- After استرجاع السلك، ligate في DFA عند نقطة التشعب مع النايلون 9-0 خياطة. لا ligate قريبة جدا من التشعب، الذي من شأنه أن يعرض للخطر تدفق الدم إلى SFA.
- تخفيف SFA وCFA الحلقات خياطة لاستئناف تدفق الدم الطبيعي. لاحظ أن CFA يتم توسيع جيدا من قبل سلك الإدراج (الشكل 2D).
4. الجلد اختتام وبعد العملية الجراحية العناية
- ينزف السيطرة. ناز طفيفة يمكن وقفها من قبل ضغط بسيط؛ فإن بعض تنزف الشرايين الرئيسية تتطلب غرز مع خياطة 11-0 النايلون. وهذه الشرايين خياطة ينتج في نهاية المطاف في انسداد الشرايين.
- إغلاق الجرح الجلد مع دباسات الجلد (عادة 3-4 المواد الغذائية). إبقاء المنطقة الجرح تعقيمها من خلال تطبيق الكلورهيكسيدين الحل الجراحي.
- تطبيق العلاجات بعد الجراحة. السيطرة على الألم من الفأرة مع الحقن تحت الجلد البوبرينورفين. الحفاظ على الماوس على لوحة ظاهرة الاحتباس حتى استعاد أنه SUFficient الوعي للحفاظ على الاستلقاء القصية. منزل في قفص نظيفة دون صحبة الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أربعة أسابيع بعد الجراحة، حصاد الشريان الفخذي، أصيب الأسلاك وجعل عينة كتلة على البارافين لتحليل تشكيل neointima. لحث التخدير العام كما هو موضح أعلاه. فتح الصدر فورا وإدراج فراشة إبرة عيار 20 إلى البطين الأيسر. ربط خط لزجاجة التسريب. أداء نضح التثبيت عن طريق ضخ بالتنقيط من برنامج تلفزيوني تليها بارافورمالدهيد 4٪ (عادة 10-20 مل، لكل منهما). يتم وضع زجاجة ضخ حوالي 140 سم أعلى من مستوى القلب بحيث يتم perfused لهذا الحيوان في pressure.Wait الفسيولوجية لمدة 20 دقيقة ثم إخراج CFA-المصابين الأسلاك وإصلاحه في بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. جعل كتلة البارافين للعينة باستخدام تقنيات النسيجية القياسية وإعداد المقاطع العرضية من سمك 5 ميكرون لتلطيخ النسيجي.
سوف الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ تسمح التصور واضح لتشكيل neointima داخل F-جرح سلكالشريان emoral (الشكل 3A، الشريان الفخذي، أصيب البرقية، 3B، الشريان الفخذي لم يصب). استخدم برنامج مناسب لقياس منطقة التجويف (LA)، ومنطقة الصفيحة المرنة الداخلية (IEL)، والصفيحة المرنة (ثعبان البحر) المنطقة الخارجية من المقطع العرضي (الشكل 3C). حساب مساحة البطانية بطرح منطقة التجويف من منطقة IEL. حساب مساحة وسائل الإعلام من خلال طرح منطقة IEL من منطقة ثعبان البحر. ويستخدم البطانية نسبة مساحة منطقة / وسائل الإعلام لمقارنة تشكيلات neointima بين المجموعات التجريبية المختلفة.
الشكل 1: الرسوم التوضيحية تخطيطي من الجلد شق والأوعية الدموية تشريح. (A) شق الجلد المناسب حوالي 1.5 سم في الطول، وعلى طول خط الوسط من أعلى الفخذ وسطي. (ب) البحث عن الشريان الفخذي السطحي أولا، الشريان الفخذي مشترك المقبل، وأخيرا،الشريان الفخذي العميق. تشريح كل الشريان بعناية دون الإضرار الوريد المجاورة.
الشكل 2: سلك الإجراءات الإصابات. ويتعرض (A) الشريان الفخذي مشترك (السهم)، والشريان الفخذي السطحي (السهم منقط)، والفخذ الشريان (رأس السهم) عميق ويحلق مع الغرز. (B) لاحظ الفرق بين حجم الشرايين و0.015 بوصة الأسلاك. يتم إدخال (C) وسلك طريق الشريان الفخذي العميق. إبقاء الأسلاك داخل لمدة 1 دقيقة لجدار الشرايين فوق طاقتها. يتم استئناف (D) تدفق الدم. يتم توسيع جيدا الشريان الفخذي مشترك بعد إصابة الأسلاك (السهم). شريط يشير 1 مم.
شخصية3: الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ الشرايين الفخذية-المصابين الأسلاك ولم يصب. (A) والمقطع العرضي للشريان الفخذي جرح سلك يكشف سميكة، neointima الخلوية عالية البلاك. (B) والمقطع العرضي للشريان الفخذي لم يصب يوضح الهياكل جدران الشرايين سليمة دون أي تشكيل neointima. (C) والأخضر خط يحدد منطقة التجويف، الخط الأصفر يحدد الصفيحة المرنة الداخلية، والخط الأزرق يحدد الصفيحة المرنة الخارجية. شريط يشير 100 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراء إصابة السلك هو ينطبق على جميع سلالات من الفئران طالما هياكلها التشريحية متشابهة. 4 في هذه الورقة، كنا الذكور C57BL / 6 الفئران مع عصر 12-16 أسابيع. وكما تعلمنا من الدراسات الأولية لدينا، الشرايين الفخذية من الفئران الذين تقل أعمارهم عن 10 أسابيع وغالبا ما تكون صغيرة بحيث سلك الإدراج هو تحد كبير. من ناحية أخرى، والأسلاك الإدراج في الفئران الأكبر سنا من 16 أسبوعا هو أسهل من الناحية الفنية ولكنه يميل أن يؤدي إلى مزيد من تضخم neointimal متغير. إناث الفئران تميل إلى تكبد تشكيل neointimal أقل من الذكور. على الرغم من أن الإجراء إصابة الأسلاك لا يمكن أن يؤديها على جانبي الشرايين الفخذية، ونحن نفضل الجانب الأيسر بسبب الوصول التشريحية لمشغلي اليد اليمنى.
بين جميع نماذج الماوس من عودة التضيق بعد قسطرة، الشرايين إصابة سلك يقلد الغالب عن كثب الاوعية الدموية عن طريق تعرية البطانية وجدار الوعاء الدموي overstreching. 2،5،6 يوجدهما الشرايين الرئيسية المستهدفة للإصابة السلك: الشرايين الفخذية والشرايين السباتية. من الناحية الفنية، والأسلاك الإدراج هو الأسهل بالنسبة الشرايين السباتية لأنها أوسع من شرايين الفخذ. ومع ذلك، تشكيل neointima يميل إلى أن يكون أقل قوة في الشرايين السباتية من ذلك في شرايين الفخذ، على الأرجح بسبب تعرية أقل فعالية. تستخدم بعض المؤلفين جهاز اليدوية لخلق تعرية البطانية أكثر عدوانية في الشرايين السباتية. 7 من ناحية أخرى، والاستفادة من الفخذ نموذج إصابة سلك الشريان هو أنه لا يمكن أن يؤديها مع المصنعة متجانس، والأسلاك المتاحة تجاريا للحث على neointimal تضخم في بطريقة استنساخه.
لجعل اصابة في سلك الناجحة في الماوس الشرايين الفخذية، والمفتاح هو أن تعمل تحت المجهر تشريح مع التكبير كافية واستخدام الأدوات الجميلة - microtweezers وmicroscissors على وجه الخصوص. Microtweezers مع نصائح حادة مفيدة لdissecر من الأنسجة المحيطة بها الشريان بينما هم مع نصائح حادة مفيدة لوضع حلقة خياطة حول الشريان وتمدد حفرة مدخل الأسلاك التي أدلى بها بضع الشريان حاد مع microscissors.
تسلخ التشريحية للشريان هو مفتاح آخر. حول البرانية الشرايين يوجد طائرة رقيقة حيث يمكن إجراء تشريح للخروج بسهولة وسلاسة. العثور على الطائرة أولا، ثم المضي قدما في تشريح. أيضا، في محاولة لتشريح خارج الوريد المجاور فقط في موقع خياطة حلقات لتجنب الضرر الوريد، والتي هي السبب الرئيسي لنزيف في هذا الإجراء. على الرغم من أن في طريقة الأصلي ويحلق الشريان والوريد معا، 4 نجد أن الشريان حلقات فقط يعطي تحكم أفضل لكل من الارقاء والأسلاك الإدراج.
الإدراج السلك هو الجزء الأكثر صعوبة من هذا الإجراء. سلك 0.015 بوصة هو ما يقرب من ثلاث مرات أكثر سمكا من DFA، الشريان الوصول. التقنيات الأساسية هناهي: معلقا على DFA نفسه قبل بضع الشريان. إحداث ثقب مدخل صغير الذي يتسع تدريجيا مع نصائح microtweezer. وتجنب قوية الإدراج الأسلاك - وترد تفاصيل تلك التقنيات في قسم البروتوكول. بينما في طريقة يدوكائين الأصلي يتم تطبيقها على تمدد الشريان قبل الأسلاك الإدراج 4، نجد أنه لا لزوم لها.
تشكيل Neointima بعد إصابة الفخذ سلك الشريان تقدم مع مرور الوقت، قمم في 3-4 أسابيع بعد الإصابة، ويبقى مستقرا عند 8 أسابيع. 4،8 الكتاب تنتظر عادة لمدة 4 أسابيع على أساس البيانات الأولية لدينا أن كمية neointima في 3 أسابيع عموما أقل من المبلغ في 4 أسابيع بعد الإصابة الأسلاك (لا تظهر البيانات).
ومن المثير للاهتمام، والردود على إصابة الشرايين تختلف بين سلالات الماوس المختلفة. وفقا لعدة تقارير التحقيق الاختلافات بين سلالات الفئران بعد الفخذي أو السباتي إصابة الشريان، تعرض الفئران FVB / N أعلى عموالاتحاد الوطني للعمال من تشكيل neointima، تليها 129 / SVJ، C3H / HEJ، BALB / C، وC57BL / 6 على التوالي. 4،9،10 ينبغي النظر هذه الخصائص عند إنشاء خطة تجريبية. يمكن أيضا أن تستخدم نموذج إصابة الفخذ للتحقيق في التغيرات الالتهابية بعد إصابة الأوعية الدموية. وأفادت التقارير تسلل خلية التهابات لزيادة بشكل ملحوظ بعد ثلاثة أيام إصابة 11
وفي الختام، فإن نموذج إصابة الأسلاك باستخدام الماوس الشرايين الفخذية هو مناسبة خاصة للتحقيق عودة التضيق بعد قسطرة، ويمكن إجراء العملية بأمان وسهولة باستخدام طريقة المقدمة هنا. ويمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في غضون 20 دقيقة مرة واحدة واطلع بشكل كامل التقنيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
