Summary
Мышь проводная бедренной артерии травмы модель рестеноза является технически сложной задачей. В этом протоколе мы показываем основные технические детали необходимы для успешного выполнения травму проволоки, чтобы вызвать последовательную неоинтима для исследований рестеноза.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания, вызванные атеросклерозом является ведущей причиной смерти в развитых странах мира. Сужение просвета сосуда, в связи с развитием атеросклеротической бляшки или разрыву установленных бляшек, прерывает нормальный поток крови, ведущий к различных заболеваний, таких как инфаркт миокарда и инсульт. В клинике эндоваскулярных процедур, таких как ангиопластика, как правило, выполняется возобновить просвет. Тем не менее, эти процедуры неизбежно к повреждению стенки сосуда, а также эндотелий сосудов, вызывая чрезмерную реакцию заживления и развитие неоинтимальной налета, который простирается в просвете, вызывающих сосудов рестеноза (повторного сужения). Рестеноз остается основной причиной выхода из строя эндоваскулярного лечения атеросклероза. Таким образом, на доклинических моделях животных рестеноза имеют жизненно важное значение для исследования патофизиологических механизмов, а также поступательное подходы к сосудистых вмешательств. Среди нескольких мышей experimental модели, травмы провод бедренной артерии широко применяется в качестве наиболее подходящей для исследования после ангиопластики рестеноза, потому что это напоминает процедуру ангиопластики, что повреждает как эндотелий и стенку сосуда. Тем не менее, многие исследователи испытывают трудности с использованием этой модели из-за его высокой степенью технической сложности. Это в первую очередь потому, что металлический провод должен быть вставлен в бедренную артерию, что примерно в три раза тоньше, чем проволоки, чтобы произвести достаточное, чтобы вызвать повреждение заметную неоинтимы. Здесь мы опишем основные хирургические детали эффективно преодолеть основные технические трудности этой модели. Следуя представленные процедур, выполняя травмы провод бедренной артерии мыши становится легче. После того, как ознакомился, вся процедура может быть завершена в течение 20 мин.
Protocol
О себе Этика:: Примечание Все процедуры соответствуют Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (Пресс национальных академий, 8-е издание, 2011), и протоколы, утвержденной Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в университете штата Висконсин. Все операции проводились под ИФ анестезии (через вдыхание, скорость потока 2 мл / мин), и все усилия были сделаны, чтобы минимизировать страдания. Животные были умерщвлены в камере постепенно наполняется CO 2.
1. Индукция общей анестезии и разрез кожи
- Использование самцов C57BL / 6 мышей в возрасте 12-16 недель и весом 23-28 г. Обезболить животное по изофлуран через аппарат анестезии замкнутой. Подтвердите надлежащего обезболивания, зажимая его палец. Нанесите небольшое количество искусственных слез мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость.
- Наведите в положении лежа на спине с левой задней конечности слегка похищенного и коленного сустава SLightly согнуты. Бритье волос вокруг левой верхней части бедра и дезинфицировать кожу хлоргексидином, применяется три раза, используя стерильные ватные наконечником аппликаторы. Используйте горячую шарик стерилизатор держать инструменты стерилизуются во время операции.
- Поместите стерильную марлевую салфетку над левой ноги. Сделайте 1,5 см прямо, продольный разрез кожи на левой медиальной бедра от коленного сустава до паха (рис 1А).
2. Воздействие на бедренной артерии и Филиалов
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1В показывает валовую сосудистой анатомии в верхней части бедра. Поверхностной бедренной артерии (SFA) может наблюдаться через вскрытии микроскопом при разрез кожи правильно сделаны вдоль средней линии медиальной бедра.
- Откройте тонкий фасции, покрывающий SFA с мелкими пинцетом, а затем цикл SFA с 9-0 нейлоновой нити.
Примечание: В этом процессе, бедренный нерв легко поместить вязь, но рядом бедренную вену требует пристального внимания, так как его стены настолько тонкие, что это легко пефорирует и кровоточит. Ключевой прием, чтобы сосредоточиться на самой артерии; при условии, что рассечение осуществляется близко к артерии, любое случайное повреждение вены можно предотвратить. - После того, как SFA оборачивается, удерживая нить с москитной пинцетом и вытащить его немного вниз. Этот маневр делает возможным дальнейшее рассечение проще, но, чтобы избежать повреждения артерии не тяните слишком сильно.
- Продолжить рассекает артерию проксимально, чтобы разоблачить и петля общей бедренной артерии (CFA) с 9-0 нейлоновой нити.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, петлю CFA в точке дистальнее эпигастральной артерии (рис 1B) достаточно для вставки провода. Держите шов петля CFA с москитной щипцов таким же образом. - Потяните шва петлю CFA вверх и шов петля SFA вниз, чтобы раскрыть бифуркации ОТВС и глубокой бедренной артерии (DFA). DFA, важнейшая отрасль ЦФО,идет к мышцы бедра (Фиг.1В).
ПРИМЕЧАНИЕ: провод будет вставлено с DFA позже. - Loop DFA с максимальной осторожностью, потому что рядом жила запуталась под артерии. В случае кровотечения из вены, от 30 до 60 сек простое сжатие марлей, как правило, достаточно для получения гемостаза.
- После того, как DFA оборачивается с 9-0 нейлоновой нити, убедитесь, что все три петли шовные находятся на правильных позициях (рис 2а).
- Продолжайте рассечения DFA дистальнее перевязывать артерию в точке, насколько это возможно, от бифуркации. Сокращение дополнительный шов, но оставить определенную длину, так что два конца могут быть проведены с москитной щипцов, которые стабилизируют DFA делает вставку проволоки легче.
3. Создание провода Травмы
- Вставьте провод с помощью DFA
- Процедить швы CFA, SFA, и DFA для установления временного кровоостанавливающего.
- Сделайте небольшое отверстие в DFС microscissors. Вставьте кончики изогнутых microtweezers, чтобы расширить отверстие, достаточно большое для провода с диаметром 0,015 дюйма (2В демонстрирует разницу в размерах между артерией и провода).
- Прежде чем сделать отверстие в DFA, ослабьте шовный цикл CFA и аккуратно зажать / сжать DFA несколько раз скучных наконечником microtweezers. Этот маневр расширяет диаметр артерий замечательно, чтобы облегчить вставление провода. Увлажнение провод тщательно PBS также важно для гладкой вставки.
- При сверлении отверстия в DFA, не обрезать артериальной стенки, но сделать небольшой V-образный зазор и щепотку клапан с острыми наконечниками microtweezers для манипуляций.
- Вставьте провод через адекватно-дилатационной отверстие на DFA. Аккуратно продвижения провод к подвздошной артерии при ослаблении шва петлю вокруг CFA. 5-8 мм достаточно, чтобы покрыть всю длину CFA в большинстве случаев (фиг.2С
- Оставьте провода внутри в течение 1 мин
- После установки этого провод к оптимальной длины, оставьте его в течение 1 мин затягивать артериальной стенки. Смочите провод и артерии с PBS, чтобы предотвратить высыхание. Еще 9-0 нейлон шовный могут быть размещены вокруг DFA, приближенную к точке проволоки вставки в это время ожидания. Это шов будет использоваться в дальнейшем, чтобы закрыть отверстие на DFA после удаления провода.
- Получить провода и резюме кровотока
- Держите провод с судна катетеризации щипцов, и вытащить его обратно аккуратно; Провод должен быть восстановлен гладко. Чтобы преодолеть любое сопротивление, как правило, вызваны приверженности провода к артериальной стенки, потянув на себя провод с легким вращением полезно. Опять же, сильный прием может привести к потере животных.
- осле извлечения проволоки, лигирования DFA в точке бифуркации с 9-0 нейлоновой нити. Не перевязывать слишком близко к развилке, которая может поставить под угрозу оттока крови к SFA.
- Ослабить шовные петли SFA и КФА возобновить нормальный кровоток. Обратите внимание, что CFA хорошо расширена за счет вставки провода (рис 2D).
4. Кожа Закрытие и Послеоперационный период
- Управление кровоточит. Малой сочилась может быть остановлен путем простого сжатия; некоторые крупные артериальные кровотечения потребует стежками 11-0 нейлона шва в. Эти пришиваются артерии, в конечном счете привести к артериальной окклюзии.
- Закрыть кожной раны с степлеры кожи (обычно 3-4 скобы). Держать рану площадь стерилизовать путем применения хирургического решения хлоргексидина.
- Применить послеоперационных процедур. Контролировать боль мыши с подкожными инъекциями бупренорфина. Держите мышь на потепление площадку, пока он не пришел в Sufциента сознание поддерживать грудины лежачее положение. Дом его в чистом клетке без компании других животных, пока полностью выздоровел.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Четыре недели после операции, урожай провода повредил бедренную артерию и сделать парафинового блока образца проанализировать формирование неоинтимы. Общей анестезии, как описано выше. Немедленно откройте сундук и вставить 20 калибра бабочки иглу в левый желудочек. Подключите линию в инфузии бутылки. Выполните перфузии фиксации с помощью капельного вливания PBS с последующим 4% параформальдегида (обычно 10-20 мл, каждый). Бутылка вливания помещают приблизительно 140 см выше уровня сердца таким образом, что животное перфузии при физиологическом pressure.Wait в течение 20 мин, затем вынуть провод с повреждением CFA и закрепить его в 4% параформальдегид в течение ночи при 4 ° С. Сделать парафинового блока образца с использованием стандартных гистологических методов и подготовить сечения толщиной 5 мкм для гистологического окрашивания.
Окрашивание гематоксилином-эозином позволит четкую визуализацию образования неоинтимы внутри проволочной ранения Femoral артерии (3А, проволока повредил бедренную артерию; 3В, неповрежденной бедренной артерии) .Используйте надлежащего программного обеспечения для измерения площади просвета (Луизиана), внутренней упругой пластинки (IEL) области, а внешний упругой пластинки (угорь) области от сечения (3С). Вычислить площадь интимы путем вычитания просвета область от IEL области; вычислить площадь средствах массовой информации путем вычитания IEL области от EEL области. Интима отношение площади / площадь массовой информации используется для сравнения неоинтиме образования между различными экспериментальными группами.
Рисунок 1: Схема иллюстрации кожи разрез и сосудистой анатомии. () Целесообразно разрез кожи составляет около 1,5 см в длину, вдоль средней линии медиальной верхней части бедра. (B) Найти поверхностную бедренную артерию во-первых, общей бедренной артерии рядом и, наконец,глубокой бедренной артерии. Проанализируйте каждый артерию тщательно, не повреждая прилегающие вены.
Рисунок 2: Проволока Порядок травмы. (А) общей бедренной артерии (стрелка), поверхностной бедренной артерии (пунктирная стрелка), и глубокой бедренной артерии (стрелка головки) и подвергаются петли со швами. (Б) Примечание размер разницы между артерий и 0,015 дюйма Провод. (С) провод вставляется через глубокой бедренной артерии. Держите провод внутри в течение 1 мин, чтобы иметь артериальной стенки на пределе. (D) Кровоток возобновляется. Общей бедренной артерии хорошо расширен после травмы проволоки (стрелка). Бар показывает 1 мм.
Фигура3: гематоксилин-эозином проволочных-повреждениями и без повреждений бедренных артерий. (А) поперечное сечение проволочной повреждением бедренной артерии показывает толстую высокой клеточной неоинтимы налета. (В) поперечное сечение с неповрежденной бедренной артерии демонстрирует интактные структуры артериальной стенки без образования неоинтимы. (С) Зеленый линия очерчивает область просвета, желтая линия очерчивает внутренней упругой пластинки, и синяя линия очерчивает внешнюю упругую пластинку. Бар показывает 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура травмы провод применимо ко всем линий мышей, пока их анатомические структуры похожи. 4 В этой работе, мы использовали самцов мышей C57BL / 6 мышей в возрасте 12-16 недель. Как мы узнали от наших предварительных исследований, бедренные артерии мышей моложе 10 недель, часто настолько мала, что установка проволоки довольно сложно. С другой стороны, вставка проволоки у мышей в возрасте старше 16 недель технически проще, но, как правило, приводит к дополнительной переменной гиперплазии неоинтимы. Самок мышей обычно несут меньше формирование неоинтимы, чем мужчины. Хотя процедура травмы проволоки может быть выполнена с любой стороны бедренных артерий, мы предпочитаем левую сторону из-за анатомической доступности для правых операторов.
Среди всех мышиных моделях после ангиопластики рестеноза, артериальная провод травмы в основном точно имитирует ангиопластики по эндотелия и стенки сосуда overstreching. 2,5,6 Тамдва основных целевых артерий для повреждения провода: бедренные артерии и сонной артерии. С технической точки зрения, вставка проволоки легче сонных артерий, потому что они шире, чем бедренных артерий. Тем не менее, образование неоинтимы имеет тенденцию быть менее надежными в сонной артерии, чем в бедренной артерии, вероятно из-за менее эффективного денудации. Некоторые авторы используют ручной устройство для создания более агрессивный эндотелия в сонной артерии. 7 С другой стороны, преимущество модели бедренной артерии провод травмы в том, что она может быть выполнена с равномерно изготовлены, коммерчески доступных проводов, чтобы вызвать гиперплазию неоинтимы в воспроизводимым способом.
Чтобы сделать успешную травмы провода в мышиных бедренных артерий, ключ для работы под микроскопом рассекает При достаточном увеличении и используют мелкие инструменты - microtweezers и microscissors в частности. Microtweezers с острыми наконечниками полезны для dissecт из ткани, окружающие артерии, тогда как те, с тупыми концами полезны разместить шовный петлю вокруг артерии и расширяются провод входное отверстие, сделанное острой артериотомии с microscissors.
Анатомическая диссекция артерии является еще одним ключевым. Вокруг артериальной оболочкой существует тонком плане, где вскрытие может осуществляться легко и гладко. Найти самолет, а затем приступить к диссекции. Кроме того, постарайтесь рассекать из соседнего вену только на сайт шва петли, чтобы избежать повреждения вен, которое является основной причиной кровотечения в этой процедуре. Хотя в оригинальном методе артерия и вена замыкаются вместе, 4 мы видим, что цикл артерии дает только лучше контролировать, как для гемостаза и вставки провода.
Вставка провода является наиболее трудной частью этой процедуры. 0,015-дюймовый провод примерно в три раза толще, чем DFA, артерии доступа. Ключевые методы здесьявляются: расширяя саму DFA до артериотомии; сделав небольшой входное отверстие которого постепенно расширились от советов microtweezer; и избегая силового вставление провода - эти методы подробно описаны в разделе протокола. В то время как в оригинальном способе лидокаина применяется для расширения артерии перед введением проволоки 4, мы обнаружили, что нет необходимости.
Образования неоинтимы после бедренной артерии травмы проволоки прогрессирует со временем, пики при 3-4 недель после травмы, и остается стабильным в 8 недель. 4,8 Авторы обычно ждать в течение 4 недель на основе предварительных данных, что количество неоинтимы на 3 недели как правило, меньше, чем количество в течение 4 недель после травмы проволоки (данные не показаны).
Интересно, что ответы на повреждения артерий отличаться в разных линиях мышей. По некоторым сообщениям следственных различия между штаммами мыши после бедренной или травмы сонной артерии, FVB / N мыши проявляют максимальную АМОЕНТ формирования неоинтимы, а затем 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / C, и C57BL / 6, соответственно. 4,9,10 Эти характеристики должны быть учтены при составлении экспериментальный план. Бедренной модель травмы также может быть использован для исследования воспалительных изменений после сосудистой травмы. Воспалительной инфильтрации клеток, как сообщается, значительно увеличить через три дня после травмы. 11
В заключение, модель проволоки травмы с помощью мыши бедренных артерий особенно подходит для исследования после ангиопластики рестеноза, и процесс может быть выполнена легко и безопасно, используя метод, представленный здесь. Вся процедура может быть завершена в течение 20 мин после того, как методы полностью ознакомился.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
