Summary
Il mouse filo arteria femorale modello di lesione di restenosi è tecnicamente impegnativo. In questo protocollo vi mostriamo i principali dettagli tecnici essenziali per eseguire con successo danno filo da indurre neointima coerente per gli studi di restenosi.
Abstract
Le malattie cardiovascolari causate da aterosclerosi è la principale causa di morte nel mondo sviluppato. Restringimento del lume del vaso, a causa dello sviluppo della placca aterosclerotica o la rottura delle placche stabiliti, interrompe il normale flusso di sangue che porta a varie patologie, come l'infarto del miocardio e ictus. Nella clinica procedure endovascolari, come l'angioplastica sono comunemente eseguiti per riaprire il lume. Tuttavia, questi trattamenti inevitabilmente danneggiano la parete del serbatoio, nonché l'endotelio vascolare, innescando una risposta guarigione eccessivo e lo sviluppo di una targa neointimale che si estende nel lume causando restenosi nave (ri-restringimento). Restenosi resta una delle principali cause di fallimento di trattamenti endovascolari per l'aterosclerosi. Così, modelli animali preclinici di restenosi sono di vitale importanza per lo studio dei meccanismi fisiopatologici e traslazionale approcci per interventi vascolari. Tra diversi experime murinomodelli ntale, lesioni filo arteria femorale è ampiamente accettata come il più adatto per gli studi di restenosi post-angioplastica perché assomiglia da vicino la procedura di angioplastica che danneggia sia endotelio e parete del serbatoio. Tuttavia, molti ricercatori hanno difficoltà utilizzando questo modello grazie al suo elevato grado di difficoltà tecnica. Ciò è dovuto soprattutto un filo metallico deve essere inserito nell'arteria femorale, che è circa tre volte più sottile il filo, per generare lesioni sufficiente ad indurre neointima prominente. Qui, descriviamo i dettagli chirurgici essenziali per superare efficacemente le maggiori difficoltà tecniche di questo modello. Seguendo le procedure presentate, eseguendo il pregiudizio del mouse filo femorale diventa più facile. Una volta familiarizzato, l'intera procedura può essere completata entro 20 min.
Protocol
NOTA: Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono conformi alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press, 8 ° edizione, 2011), e dei protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università del Wisconsin. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in anestesia isoflurano (attraverso inalazione, portata 2 ml / min), e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. Gli animali sono stati sacrificati in una camera progressivamente riempita con CO 2.
1. L'induzione di anestesia generale e incisione cutanea
- Utilizzare maschio C57BL / 6 topi con un'età di 12-16 settimane e peso di 23-28 g. Anestetizzare l'animale da isoflurano attraverso un apparato anestesia a circuito chiuso. Verificare il corretto anestesia pizzicando la sua punta. Applicare un po 'lacrime artificiali pomata sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Posizionare il mouse in posizione supina con dell'arto posteriore sinistro leggermente addotto e il ginocchio sl congiuntaightly flesso. Radersi i capelli intorno alla regione coscia sinistra e disinfettare la pelle con clorexidina, applicato tre volte utilizzando cotone sterile applicatori con punta. Utilizzare una perlina sterilizzatrice calda per mantenere gli strumenti sterilizzati durante l'intervento chirurgico.
- Posizionare un drappo garza sterile sulla gamba sinistra. Effettuare una retta 1,5 centimetri, incisione cutanea longitudinale sulla coscia mediale sinistro dal ginocchio all'inguine (Figura 1A).
2. L'esposizione di dall'arteria femorale e Filiali
NOTA: La figura 1B mostra l'anatomia vascolare lordo nella coscia superiore. L'arteria femorale superficiale (SFA) può essere osservato attraverso un microscopio da dissezione quando l'incisione cutanea è correttamente effettuata lungo la linea mediana della coscia mediale.
- Aprire la sottile fascia sovrastante la SFA con le pinzette sottili e poi avvolgere il SFA con 9-0 nylon sutura.
NOTA: In questo processo, il nervo femorale è facilmente messo comeide, ma la vena femorale adiacente richiede molta attenzione perché la sua parete è così sottile che fora e sanguina facilmente. La tecnica chiave è quello di concentrarsi sulla arteria stessa; finché la dissezione avviene vicino all'arteria, danni accidentali vena è evitabile. - Una volta che la SFA è in loop, tenere la sutura con una pinza di zanzare e tirarla leggermente verso il basso. Questa manovra rende ulteriormente dissezione più facile, ma per evitare di danneggiare l'arteria non tirare troppo forza.
- Continuare dissezione dell'arteria prossimale per esporre e ciclo l'arteria femorale comune (CFA) con 9-0 nylon sutura.
NOTA: In genere, looping il CFA in un punto distale all'arteria epigastrico (Figura 1B) è sufficiente per l'inserimento del filo. Tenere il ciclo di sutura CFA con pinze zanzara nello stesso modo. - Tirare l'anello di sutura CFA verso l'alto e il ciclo di sutura SFA verso il basso per scoprire la biforcazione di SFA e profonda arteria femorale (DFA). Il DFAE, la principale filiale del TUF,va verso il muscolo della coscia (Figura 1B).
NOTA: Il filo verrà inserito dal DFA tardi. - Loop la DFA con cautela perché la vena adiacente è aggrovigliato sotto l'arteria. In caso di sanguinamento dalla vena, un 30- a 60 sec compressione semplice con una garza di solito è sufficiente a produrre l'emostasi.
- Una volta che il DFAE è in loop con 9-0 sutura in nylon, assicurarsi che tutti e tre i cicli di sutura sono al loro corrette posizioni (Figura 2A).
- Procedere con la dissezione del DFA distalmente per legare l'arteria in un punto più lontano possibile dalla biforcazione. Tagliare sutura in più, ma lasciare una certa lunghezza in modo che le due estremità possono essere tenuti con una pinza di zanzara, che stabilizzano il DFAE rende l'inserimento filo più facile.
3. Creazione Wire Injury
- Inserire Wire via DFA
- Scolare le suture CFA, SFA, e DFA di stabilire un emostatico temporanea.
- Fai un piccolo foro nel DFA con microscissors. Inserire le punte delle microtweezers curvi per dilatare il foro abbastanza grande per un filo di diametro 0,015 pollici (Figura 2B mostra la differenza di dimensioni tra l'arteria e il filo).
- Prima di fare un buco nel DFA, allentare il cappio di sutura CFA e delicatamente bloccare / spremere il DFA più volte con microtweezers sordo-punta. Questa manovra si espande il diametro delle arterie notevolmente per facilitare l'inserimento del filo. Inumidire accuratamente il filo con PBS è anche importante per un inserimento scorrevole.
- Quando si effettua un foro nel DFA, non tagliare la parete arteriosa, ma fare un piccolo morso a forma di V e pizzicare la patta con microtweezers taglienti a punta per la manipolazione.
- Inserire il filo attraverso il foro adeguato, dilatato in DFA. Avanzare con delicatezza il filo verso l'arteria iliaca mentre allentando l'anello di sutura intorno al CFA. 5-8 mm è sufficiente a coprire tutta la lunghezza CFA in molti casi (Figura 2C
- Lasciare filo all'interno per 1 min
- Dopo aver inserito il filo alla lunghezza ottimale, lasciare per 1 min per deformare eccessivamente la parete arteriosa. Inumidire il filo e le arterie con PBS per evitare l'essiccazione. Un'altra sutura 9-0 nylon può essere collocato intorno prossimale DFA al punto di inserimento filo durante questo tempo di attesa. Questo sutura verrà utilizzato successivamente per chiudere il foro sul DFA dopo la rimozione del filo.
- Recuperare Wire e riprendere il flusso di sangue
- Tenere il filo con una pinza nave incannulamento, e tirarlo indietro delicatamente; il filo deve essere recuperato senza problemi. Per superare alcuna resistenza, di solito causato dalla aderenza del filo alla parete arteriosa, tirando indietro il filo con rotazione dolce è utile. Ancora una volta, una manovra forzata potrebbe provocare la perdita animali.
- Laopo il filo recuperato, legare il DFA nel punto di biforcazione con 9-0 sutura di nylon. Non legare troppo vicino alla biforcazione, che metterebbe a repentaglio il deflusso di sangue al SFA.
- Allentare gli anelli di sutura SFA e CFA di riprendere il normale flusso sanguigno. Si noti che il CFA è ben espansa-by inserimento del filo (Figura 2D).
4. Pelle Chiusura e postoperatoria cura
- Controllo sanguina. Stillicidio Minor può essere fermato con una semplice compressione; alcuni sanguinamenti maggiori arterie richiedono punti di sutura con una sutura 11-0 nylon. Queste arterie suturate finirà per determinare occlusione arteriosa.
- Chiudere la pelle ferita con cucitrici di pelle (di solito 3-4 punti metallici). Mantenere l'area ferita sterilizzata applicando soluzione chirurgica clorexidina.
- Applicare trattamenti post-chirurgici. Controllare il dolore del mouse con iniezioni sottocutanee di buprenorfina. Tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a che non ha recuperato sufciente coscienza per mantenere decubito sternale. Casa in una gabbia pulita senza compagnia di altri animali fino pienamente recuperato.
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Representative Results
Quattro settimane dopo l'intervento, raccolgono l'arteria femorale filo-feriti e rendono esemplare di blocco una paraffina per analizzare la formazione neointima. Indurre anestesia generale come descritto sopra. Aprire immediatamente il torace e inserire un calibro 20 farfalla ago al ventricolo sinistro. Collegare la linea ad una bottiglia di infusione. Eseguire la fissazione perfusione per infusione a goccia di PBS seguito da 4% paraformaldeide (di solito 10-20 ml, ciascuno). La bottiglia di infusione è posta circa 140 cm rispetto al livello del cuore in modo che l'animale è perfuso in pressure.Wait fisiologico per 20 minuti quindi togliere il CFA filo-feriti e fissarlo in 4% paraformaldeide notte a 4 ° C. Fare un blocco di paraffina del campione utilizzando tecniche istologiche standard e preparare sezioni di spessore di 5 micron per la colorazione istologica.
Ematossilina-eosina permetterà chiara visualizzazione di formazione neointima all'interno del f filo-feritiarteria emoral (Figura 3A, arteria femorale filo-lesa; 3B, illeso arteria femorale) Utilizzi un software adeguato per misurare l'area lume (LA), la lamina elastica interna (IEL) zona, e la lamina elastica (EEL) area esterna dalla sezione trasversale (Figura 3C). Calcolare l'area intima sottraendo zona lume dalla zona IEL; calcolare l'area dei media sottraendo zona IEL dalla zona EEL. Intima rapporto di area / zona multimediale viene utilizzato per confrontare le formazioni neointima tra i diversi gruppi sperimentali.
Figura 1: illustrazioni schematiche di pelle Incisione e Vasculature Anatomy. (A) Un incisione cutanea adeguata è di circa 1,5 cm di lunghezza, lungo la linea mediana del mediale della coscia superiore. (B) Trovare l'arteria femorale superficiale prima, l'arteria femorale comune accanto, e, infine, laprofondo arteria femorale. Sezionare attentamente ogni arteria senza danneggiare la vena adiacente.
Figura 2: Procedura Injury Wire. (A) L'arteria femorale comune (freccia), l'arteria femorale superficiale (freccia tratteggiata), e la profonda femorale (freccia testa) sono esposti e in loop con punti di sutura. (B) Si noti la differenza di dimensioni tra le arterie e il 0,015 pollici wire. (C) Il filo viene inserito attraverso l'arteria femorale profonda. Tenere il filo all'interno per 1 min per avere la parete arteriosa overstretched. (D) Il flusso di sangue viene ripreso. L'arteria femorale comune è ben espansa dopo lesioni fili (freccia). La barra indica 1 mm.
Figura3: ematossilina-eosina delle arterie femorali filo-feriti e illeso. (A) Una sezione trasversale di un'arteria femorale wire-lesa rivela una spessa, altamente cellulare neointima placca. (B) Una sezione trasversale di un'arteria femorale uninjured dimostra strutture murarie intatte arteriosa senza formazione di neointima. (C) La verde linea delinea zona lumen, la linea gialla delinea lamina elastica interna, e la linea blu delinea lamina elastica esterna. La barra indica 100 micron.
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Discussion
La procedura lesioni filo è applicabile a tutti i ceppi di topi, purché le strutture anatomiche sono simili. 4 In questo lavoro, abbiamo utilizzato maschio C57BL / 6 topi con un'età di 12-16 settimane. Come abbiamo imparato dai nostri studi preliminari, le arterie femorali di topi più giovani di 10 settimane sono spesso così piccole che l'inserimento del filo è molto impegnativo. D'altra parte, l'inserimento del filo in topi vecchi a 16 settimane è tecnicamente più semplice, ma tende a causare più neointimale variabile. Topi di sesso femminile tendono a sostenere la formazione neointimale meno rispetto ai maschi. Sebbene la procedura pregiudizio filo può essere eseguita su entrambi i lati delle arterie femorali, preferiamo il lato sinistro causa dell'accessibilità anatomica per operatori destri.
Tra tutti i modelli murini di restenosi post-angioplastica, lesioni filo arteriosa imita lo più da vicino angioplastica da denudazione endoteliale e la parete del serbatoio overstreching. 2,5,6 Cisono due arterie principali target per lesioni filo: arterie femorali e arterie carotidi. Da un punto di vista tecnico, inserimento del filo è più facile per le arterie carotidi perché sono più larghe arterie femorali. Tuttavia, la formazione neointima tende ad essere meno robusta in arterie carotidi rispetto che nelle arterie femorali, probabilmente a causa di denudazione meno efficace. Alcuni autori utilizzano un dispositivo a mano per creare un denudazione endoteliale più aggressivo nelle arterie carotidee. 7 D'altra parte, il vantaggio del modello di lesione filo femorale è che può essere eseguita con omogeneamente fabbricati, fili disponibili in commercio per indurre iperplasia neointimale in modo riproducibile.
Per fare un danno filo di successo nel topo arterie femorali, la chiave è di operare sotto un microscopio da dissezione con ingrandimento sufficienti e di utilizzare strumenti raffinati - microtweezers e microscissors in particolare. Microtweezers con punte affilate sono utili per dissezionet i tessuti circostanti l'arteria, mentre quelli con punte smussate sono utili per posizionare un anello di sutura intorno all'arteria e di dilatare il foro di entrata del filo fatto da un forte arteriotomia con microscissors.
Una dissezione anatomica dell'arteria è un'altra chiave. Intorno al avventizia arteriosa esiste un piano sottile dove la dissezione può essere effettuato facilmente e senza intoppi. Trova l'aereo prima, quindi procedere con la dissezione. Inoltre, cercare di sezionare la vena adiacente solo nel sito di sutura loop per evitare danni venosa, che è la principale causa di sanguinamento in questa procedura. Anche se nel metodo originale l'arteria e la vena sono loop insieme, 4 troviamo che il ciclo arteria dà solo un migliore controllo sia per l'emostasi e l'inserimento del filo.
Inserimento del filo è la parte più difficile di questa procedura. Un filo 0,015 pollici è circa tre volte più spesso del DFAE, l'arteria di accesso. Le tecniche chiave quisono: dilatare l'DFA stesso prima arteriotomia; facendo un piccolo foro di entrata, che è progressivamente dilatato con punte microtweezer; e di evitare l'inserimento filo forte - queste tecniche sono dettagliate nella sezione del protocollo. Mentre nel metodo lidocaina originale è applicata per dilatare l'arteria prima dell'inserimento del filo 4, troviamo inutile.
Formazione della neointima dopo l'infortunio filo arteria femorale progredisce con il tempo, picchi a 3-4 settimane dopo l'infortunio, e rimane stabile a 8 settimane. 4,8 Gli autori di solito aspettare per 4 settimane sulla base dei nostri dati preliminari che la quantità di neointima 3 settimane è generalmente inferiore a quello a 4 settimane dopo la lesione filo (dati non mostrati).
È interessante notare che le risposte alla lesione arteriosa differiscono tra i vari ceppi di topi. Secondo diversi rapporti che analizzano le differenze tra ceppi di topi dopo femorale o carotideo lesioni dell'arteria, FVB / N topi mostrano il più alto amount di formazione neointima, seguito da 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / C, e C57BL / 6, rispettivamente. 4,9,10 Queste caratteristiche dovrebbero essere considerati quando la composizione di un piano sperimentale. Il modello di lesione femorale può anche essere utilizzato per indagini di alterazioni infiammatorie dopo la lesione vascolare. Infiltrazione di cellule infiammatorie è stato segnalato per aumentare significativamente tre giorni dopo l'infortunio. 11
In conclusione, il modello di lesione filo usando topo arterie femorali è particolarmente adatto per indagare restenosi post-angioplastica, e il processo può essere eseguito in modo sicuro e facilmente utilizzando il metodo qui presentato. L'intera procedura può essere finito entro 20 minuti una volta che le tecniche sono completamente familiarità.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
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