Summary
재 협착 마우스 대퇴 동맥 와이어 손상 모델 기술적 도전이다. 이 프로토콜에서 우리는 성공적으로 재 협착의 연구에 대한 일관성있는 신생 내막을 유도하는 와이어 부상을 수행하기위한 주요 기술 세부 사항은 필수 보여줍니다.
Abstract
아테롬성 동맥 경화증으로 인한 심장 혈관 질환은 선진국에서 사망의 주요 원인이다. 동맥 경화 반으로 인해 개발 성립 플라크 파열로, 혈관 내강 좁아, 심근 경색이나 뇌졸중 등의 각종 합병증 선도 정상적인 혈류를 중단. 이러한 혈관 성형술과 같은 병원 혈관 절차에서 일반적으로 루멘을 다시 수행한다. 그러나, 이러한 치료법은 필연적 과도한 치유 반응과 혈관 재 협착 (재 협착)을 일으키는 루멘 내로 연장 내막 플라크의 발전을 유발, 혈관 벽뿐만 아니라, 혈관 내피 세포를 손상. 재 협착은 동맥 경화 혈관 내 치료 실패의 주요 원인이 남아있다. 따라서, 재 협착의 전임상 동물 모델은 병진 혈관 개입 접근법뿐만 아니라 병리 생리 학적 메카니즘을 조사하는 매우 중요하다. 여러 쥐 experime 중이 밀접하게 내피 세포와 혈관 벽을 모두 상해를당한 혈관 성형술 절차를 닮았다고 ntal 모델은 대퇴 동맥 와이어 부상 널리 후 혈관 성형술 재 협착의 연구에 가장 적합한으로 허용됩니다. 그러나, 많은 연구자들은 기술적 난이도 높은 수준으로이 모델을 사용하는 어려움이있다. 이 금속 선재가 눈에 띄는 신생 내막을 유도하기에 충분한 손상을 생성하기 위해, 약 와이어보다 3 배 더 얇은 대퇴 동맥에 삽입 될 필요가 있기 때문에 주로이다. 여기서 우리는 효율적으로이 모델의 주요 기술적 인 어려움을 극복하기 위해 필수적인 외과 세부 사항을 설명합니다. , 제시된 절차에 따라 수행함으로써 마우스 대퇴 동맥 와이어 부상이 쉽게된다. 친숙하면 전체 공정을 20 분 내에 완료 될 수있다.
Protocol
참고 : 윤리 문 : 모든 절차는 위스콘신 대학에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서 (국립 아카데미 프레스, 8 판, 2011), 및 프로토콜을 준수합니다. 모든 수술 (유량 2 mL / 분, 흡입을 통해) 이소 플루 란 마취 하에서 수행하고, 모든 노력은 고통을 최소화 하였다. 동물은 점차적으로 CO 2로 채워진 챔버에서 안락사시켰다.
전신 마취 및 피부 절개 1. 유도
- 23-28g의 12-16주의 나이와 무게 남성 C57BL / 6 마우스를 사용합니다. 폐회로 마취 장치를 통해 이소 플루 란으로 마취 동물. 그 발가락을 곤란하게하여 적절한 마취를 확인합니다. 건조 함을 방지하기 위해 눈에 일부 인공 눈물 연고를 적용합니다.
- 약간 납치 왼쪽 뒷다리와 무릎 관절 SL와 부정사 위치에 마우스를 놓습니다ightly 근육이 수축. 왼쪽 허벅지 지역 주변의 머리를 면도하고 클로르헥시딘으로 피부를 소독, 멸균면 팁 어플리케이터를 사용하여 세 번인가. 수술 중 멸균 악기를 유지하기 위해 뜨거운 구슬 살균기를 사용합니다.
- 왼쪽 다리를 통해 멸균 거즈 드레이프를 놓습니다. 사타구니 (그림 1A)에 무릎 관절에서 왼쪽 허벅지 중앙에 1.5 cm 직선, 세로 피부 절개를합니다.
대퇴 동맥과 나뭇 가지 2. 노출
주 : 그림 1B는 허벅지에 총 혈관 해부학을 보여줍니다. 피부 절개가 제대로 허벅지 중앙의 정중선을 따라 이루어질 때 표재성 대퇴 동맥 (SFA)를 해부 현미경으로 관찰 할 수있다.
- 미세 핀셋 다음 루프 9-0 나일론 봉합사와 SFA와 SFA를 덮는 얇은 근막을 엽니 다.
주 :이 공정에서, 대퇴 신경 용이로두고그 벽은 쉽게 관통하고 및 출혈 너무 얇은 때문에 IDE,하지만 인접 대퇴 정맥은주의가 필요합니다. 키 기술은 동맥 자체에 집중할 수있다; 한 절개가 가까운 동맥에 수행 될 때, 실수로 정맥의 손상을 피할 수있다. - SFA가 반복되면, 모기 집게와 봉합을 잡고 약간 아래쪽으로 당깁니다. 이 기동 쉽게 추가 해부한다,하지만 너무 무리하게 잡아 당기지 마십시오 동맥의 손상을 방지 할 수 있습니다.
- 근위 9-0 나일론 봉합사와 대퇴 동맥 (CFA)를 노출 및 루프하는 동맥을 해부 계속합니다.
참고 : 일반적으로 상복부 동맥 (그림 1B)에 점 말단에서 CFA를 반복하는 와이어 삽입을위한 충분하다. 같은 방법으로 모기 집게로 CFA 봉합 루프를 잡습니다. - 위로 CFA 봉합 루프를 당겨 SFA 봉합 루프는 아래 SFA과 깊은 대퇴 동맥 (DFA)의 분기점을 발견 할 수 있습니다. DFA, CFA의 주요 지점,허벅지 근육 (그림 1B)를 향해 간다.
주 : 와이어 나중에 DFA에서 삽입됩니다. - 특별한주의와 루프 DFA는 인접한 정맥은 동맥 아래에 얽힌되기 때문이다. 정맥 출혈 발생시, 거즈로 30 내지 60 초 간단한 압축은 일반적으로 지혈을 제조하기에 충분하다.
- DFA는 9-0 나일론 봉합사 반복되면, 세 봉합 루프 (그림 2A) 올바른 위치에 있는지 확인하십시오.
- 말단 가능한 한 분기에서 지점에서 동맥을 결찰하는 DFA의 해부를 진행합니다. 여분의 봉합사를 절단하지만 양단은 DFA는 전선을 삽입하기 쉽게 안정화 모기 겸자로 유지 될 수 있도록 일정 길이를 남겨.
3. 와이어 부상 만들기
- DFA를 통해 와이어를 삽입
- 임시 지혈을 설정하는 CFA, SFA, 및 DFA 봉합 스트레인.
- DF에 작은 구멍을 확인microscissors와. 0.015 인치 직경을 갖는 와이어 충분히 큰 구멍을 팽창하는 곡면 microtweezers의 선단을 삽입 (도 2b는 동맥과 와이어 간의 크기 차이를 보여준다).
- DFA에 구멍을하기 전에, CFA 봉합 루프를 풀고 부드럽게 클램프 / 무딘 팁 microtweezers와 DFA를 여러 번 짠다. 이 기동 와이어 삽입을 용이하게하기 위해 현저 동맥 직경이 확장된다. PBS로 철저하게 선을 습기를하면 부드러운 삽입을 위해 중요하다.
- DFA에 구멍을 만들 때, 동맥 벽을자를 수 있지만, 작은 V 자 모양의 닙을 확인하고 조작을위한 뾰족한 microtweezers와 플랩을 끼이지 않습니다.
- DFA에 적절하게-팽창 구멍을 통해 와이어를 삽입합니다. CFA 주위 봉합 루프를 완화하면서 조심스럽게 장골 동맥으로 와이어를 진행합니다. 5-8mm가 대부분의 경우에 모든 CFA 길이를 커버하기에 충분하다 (도 2C
- 최소 1 내부에 와이어를 남겨
- 최적의 길이로 와이어를 삽입 한 후, 동맥 벽을 잡아 늘 1 분 정도 둡니다. 건조를 방지하기 위해 PBS로 와이어 및 동맥을 적셔. 또 9-0 나일론 봉합사이 대기 시간 동안 와이어 삽입 지점에 인접한 DFA 주위에 배치 될 수있다. 이 봉합 와이어 제거 다음 DFA에 구멍을 닫습니다 나중에 사용됩니다.
- 와이어를 검색하고 혈액의 흐름을 다시 시작
- 선박 삽관 집게와 와이어를 잡고 그것을 조심스럽게 당겨; 와이어가 원활하게 검색 할 수 있어야합니다. 부드러운 회전 전선을 후퇴, 일반적으로 동맥 벽에 와이어의 부착으로 인한 저항을 극복하는 것은 도움이된다. 또, 강력한 기동 동물 손실이 발생할 수 있습니다.
- 와이어를 검색 따고는 9-0 나일론 봉합사와 분기의 시점에서 DFA를 결찰. SFA에 혈액 유출을 위태롭게 분기, 너무 가까이 결찰하지 마십시오.
- 정상적인 혈액의 흐름을 재개 SFA와 CFA 봉합 루프를 풉니 다. CFA 와이어 삽입 (그림 2D)에 의해 잘 확장합니다.
4. 피부 폐쇄 및 수술 후 케어
- 제어 출혈. 마이너 돌아 다니며 간단한 압축에 의해 중단 될 수있다 몇 가지 주요 동맥 출혈은 11-0 나일론 봉합사와 바늘이 필요합니다. 이 봉합 동맥은 결국 동맥 폐색 발생합니다.
- 피부 스테이플러 (보통 3-4 스테이플)와 피부 창상을 닫습니다. 클로르헥시딘 수술 솔루션을 적용하여 멸균 상처 유지하십시오.
- 수술 후 치료를 적용합니다. 부 프레 노르 핀의 피하 주사와 마우스의 고통을 제어 할 수 있습니다. 이 SUF을 회복 할 때까지 온난화 패드에 마우스를 유지흉골 드러 누움을 유지하기 위해 의식을 ficient. 다른 동물의 회사가없는 깨끗한 케이지의 집이 완전히 회복 될 때까지.
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Representative Results
수술을 다음과 같은 네 가지 주, 와이어 부상 대퇴 동맥을 수확하고 신생 내막 형성을 분석하는 파라핀 블록 표본을합니다. 상술 한 바와 같이 전신 마취를 유도한다. 바로 가슴을 열고 좌심실에 20 게이지 나비 바늘을 삽입합니다. 주입 병에 선을 연결합니다. 4 % 파라 포름 알데히드 (일반적으로 10 ~ 20 ml의 각) 다음 PBS의 점적 주입을 통해 관류 고정을 수행합니다. 동물은 다음 와이어 부상 CFA를 꺼내 4 ℃에서 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드에서 수정 20 분 동안 생리 pressure.Wait에서 관류되도록 주입 병은 심장 수준보다 약 140cm 이상 배치됩니다. 표준 조직 학적 기법을 이용하여 시료의 파라핀 블록을 만들어 조직 학적 염색을 위해 5 ㎛의 두께의 단면을 준비한다.
헤 마톡 실린 - 에오신 염색 와이어 부상 F 내부 신생 내막 형성의 명확한 시각화를 수emoral 동맥 (그림 3A, 와이어 부상 대퇴 동맥, (b), 손상되지 않은 대퇴 동맥) 적절한 소프트웨어 .Use 루멘 영역 (LA), 내부 탄성 얇은 판 (IEL) 영역 및 외부 탄성 얇은 판 (EEL) 영역을 측정하는 단면에서 (그림 3C). IEL 지역으로부터의 루멘 면적을 뺀 내막 영역을 계산하게하고; EEL 영역으로부터 IEL 면적을 감산하여 미디어 영역을 계산한다. 내막 면적 / 미디어 면적율 다른 실험군 간의 신생 혈관 내막 형성을 비교하는 데 사용된다.
그림 1 : 피부 절개 및 혈관 해부학의 개략도. (A) 적절한 피부 절개가 내측 허벅지의 중간 선을 따라 길이 약 1.5 cm이다. (B)는 마지막으로, 다음, 먼저 대퇴 동맥을 피상적 대퇴 동맥을 찾아깊은 대퇴 동맥. 인접한 혈관에 손상을주지 않고 신중하게 각각의 동맥을 해부하다.
그림 2 : 와이어 부상 절차. (A) 대퇴 동맥 (화살표), 표재성 대퇴 동맥 (점선 화살표), 및 깊은 대퇴 동맥 (화살촉)은 노출되고 봉합 반복된다. (B) 동맥과 0.015 인치 사이의 크기 차이에 유의 선. (C) 와이어 깊은 대퇴 동맥을 통해 삽입됩니다. 과도하게 동맥벽이 1 분 동안 내부의 전선을 유지합니다. (D) 혈액 흐름이 다시 시작됩니다. 대퇴 동맥 와이어 부상 (화살표) 후 잘 확장됩니다. 바 1mm를 나타냅니다.
그림3 : 와이어 부상을 당하지 않은 대퇴 동맥의 헤 마톡 실린 - 에오신 염색. (A) 와이어 부상 대퇴 동맥의 단면은 두께가 매우 셀룰러 신생 혈관 내막 플라크를 알 수있다. (B) 손상되지 않은 대퇴 동맥의 단면은 임의의 신생 혈관 내막 형성을하지 않고 그대로 동맥벽 구조를 설명한다. (C), 녹색 라인은 노란색 선이 내부 탄성 얇은 판을 묘사, 루멘 영역을 묘사하고, 파란색 선은 외부 탄성 얇은 판을 묘사한다. 바는 100 μm의를 나타냅니다.
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Discussion
와이어 부상 절차는, 우리가 12~16주의 연령 수컷 C57BL / 6 마우스를 사용하는만큼 그 해부학 적 구조가 유사한 된 바와 같다.이 논문 4 생쥐 균주 모두에 적용 가능하다. 우리가 우리의 예비 연구에서 배운 바와 같이 10 주 미만 쥐의 대퇴 동맥은 종종 와이어 삽입은 매우 도전 너무 작습니다. 한편, 16주보다 이전 마우스에서 와이어 삽입 기술적 쉽지만 이상의 가변 신생 내막 과형성 초래하는 경향이있다. 여성 마우스는 남성보다 적은 신생 내막 형성을 초래하는 경향이있다. 와이어 부상 절차 대퇴 동맥의 양쪽에서 수행 될 수 있지만, 우리는 때문에 우원 사업자 해부학 접근성 왼쪽을 선호한다.
후 혈관 성형술 재 협착의 모든 마우스 모델 중 동맥 와이어 부상은 대부분 밀접하게. 내피 발가 벗김과 혈관 벽 overstreching에 의한 혈관 성형술을 모방이 2,5,6대퇴 동맥과 경동맥 : 2 와이어 부상에 대한 주요 대상 동맥이다. 그들은 대퇴 동맥보다 넓은 때문에 기술적 인 관점에서, 와이어 삽입은 경동맥에 대한 쉽습니다. 그러나 신생 내막 형성으로 인해 덜 효과적 삭박에 가능성이 대퇴 동맥에 비해 경동맥 덜 강력한 경향이있다. 몇몇 저자가 경동맥에 공격적인 내피 삭박을 만드는 제 장치를 사용한다. (7) 한편, 대퇴 동맥 와이어 손상 모델의 장점은에서 신생 내막의 증식을 유도하는 균일 제조 시판 와이어로 수행 될 수 있다는 것이다 재현 방법.
특히 microtweezers 및 microscissors - 마우스 대퇴 동맥에서 성공적인 와이어 부상을하려면, 키는 충분한 배율의 해부 현미경 하에서 작동하고 좋은 악기를 사용하는 것입니다. 날카로운 팁 Microtweezers는 dissec하는데 유용하다무딘 팁 사람은 동맥 주위의 봉합 루프를 배치하고 microscissors와 날카로운 arteriotomy에 의해 만들어진 와이어 입구 구멍을 넓히는 데 유용합니다 반면 동맥을 둘러싸고있는 조직을 t.
동맥의 해부학 적 절개는 또 다른 핵심입니다. 동맥 외막 주위 절개를 용이하고 원활하게 실시 할 수 얇은 평면이 존재한다. 먼저 비행기를 찾아 다음 해부를 진행합니다. 또한, 봉합의 사이트가이 절차에서 출혈의 주요 원인 인 혈관 손상을 방지하기 위해 루프 만에 인접한 정맥을 해부하려고합니다. 원래의 방법으로 동맥과 정맥이 함께 반복하고 있지만, 4 우리는 반복 동맥은 지혈 및 와이어 삽입 모두를위한 더 나은 제어 할 수 있음을 발견한다.
와이어 삽입이 절차의 가장 어려운 부분이다. 0.015 인치의 와이어 DFA, 액세스 동맥보다 약 세 배 더 두껍다. 여기서 핵심 기술위치 : arteriotomy 전에 DFA 자체를 확장시키고; 점차 microtweezer 팁으로 팽창되는 작은 입구 구멍을 만드는; 과 강력한 와이어 삽입을 방지 - 그 기술은 프로토콜 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. 원래 방법 리도카인에 와이어 (4) 삽입 전에 동맥 팽창을 적용하는 예를 설명했지만, 우리는 불필요한 발견.
대퇴 동맥 와이어 손상 후 신생 혈관 내막 형성을 손상 후, 시간이 3-4 주에 피크를 진행, 8 주에 안정적으로 유지. 4,8- 저자는 보통 우리 예비 데이터를 기준 사주 기다려 3주에서 신생 혈관 내막의 양은 그 와이어 부상, 4 주째 양보다 대체로 작다 (데이타 미기재).
흥미롭게도, 동맥 손상에 대한 반응은 다양한 마우스 변종 사이에 차이가있다. 대퇴 경동맥 손상 후 마우스 균주의 차이를 조사 몇몇보고에 따르면, FVB / N 마우스는 높은 표시 AMO실험 계획을 작성할 때 129 / SVJ, C3H / HEJ, BALB / C, 각각 C57BL / 6,. 4,9,10 다음, 신생 내막 형성의 UNT는 이러한 특성이 고려되어야한다. 대퇴 손상 모델은 또한 혈관 손상 후의 염증성 변화의 조사를 위해 사용될 수있다. 염증 세포의 침윤 사흘 손상 후 상당히 증가하는 것으로보고 하였다. 11
결론적으로, 마우스를 사용하여 대퇴 동맥 와이어 손상 모델은 혈관 성형술 후 재 협착을 조사하는 것이 특히 적합하고, 공정은 안전하고 쉽게 여기에 제시된 방법을 사용하여 수행 될 수있다. 기술들은 완전히 익히 일단 전체 공정을 20 분 내에 완료 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
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