Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En Muse Modell av arteriell restenose: tekniske aspekter ved Femoral Wire Injury

Published: March 10, 2015 doi: 10.3791/52561

Summary

Musen femoralarterie ledning skade modell av restenose er teknisk utfordrende. I denne protokollen viser vi de viktigste tekniske detaljer avgjørende for å lykkes med å utføre ledning skade for å indusere konsekvent neointima for studier av restenose.

Abstract

Kardiovaskulær sykdom forårsaket av aterosklerose er den ledende dødsårsaken i den industrialiserte verden. Innsnevring av årehulrommet, på grunn av aterosklerotisk plakkutvikling eller revner som følge av etablerte plaques, avbryter normal blodstrøm fører til ulike lidelser slik som myokardial infarkt og slag. I klinikken endovaskulære prosedyrer som angioplastikk blir ofte utført for å gjenåpne lumen. Imidlertid er disse behandlinger uunngåelig skade på karveggen, samt det vaskulære endotel, utløser en overdreven helbredelse respons og utviklingen av en neointimal plakk som strekker seg inn i hulrommet forårsaker fartøyet restenose (re-innsnevring). Restenose forblir en viktig årsak til svikt av endovaskulære behandlinger for aterosklerose. Dermed prekliniske dyremodeller av restenose er av vital betydning for å undersøke de patofysiologiske mekanismer samt translasjonsforskning tilnærminger til vaskulære intervensjoner. Blant flere murine experimental modeller er femoralarterie ledning skade allment akseptert som den mest egnet for studier av post-angioplastikk restenose fordi det ligner den angioplastikk prosedyre som skader både endotelet og åreveggen. Men mange forskere har problemer med å benytte denne modellen på grunn av høy grad av tekniske problemer. Dette skyldes hovedsakelig at en metalltråd som må settes inn i den femorale arterien, noe som er omtrent tre ganger tynnere enn ledningen, å generere tilstrekkelig skade til å indusere fremtredende neointima. Her beskriver vi de grunnleggende kirurgiske detaljer for å effektivt overvinne de store tekniske problemer med denne modellen. Ved å følge de presenterte prosedyrer, utføre musen femoralarterie ledning skade blir enklere. Når kjent, kan hele prosedyren være fullført innen 20 min.

Protocol

MERK: Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (National Academies Press, 8. utgave, 2011), og protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Wisconsin. Alle operasjoner ble utført under isoflurananestesi (gjennom innånding, strømningshastighet 2 ml / min), og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Dyrene ble avlivet i et kammer som gradvis fylles med CO 2.

1. Induksjon av generell anestesi og Skin Innsnitt

  1. Bruk mannlig C57BL / 6 mus med en alder av 12-16 uker og vekten på 23-28 g. Bedøve dyret ved isofluran gjennom en lukket krets bedøvelse apparat. Bekreft riktig anesthetization ved å knipe sin tå. Påfør litt kunstig tårer salve på øynene for å forhindre tørrhet.
  2. Plasser musen i liggende stilling med venstre bakben bortført litt og kneleddet slightly bøyd. Barbere håret rundt venstre låret regionen og desinfiser huden med Klorhexidin, anvendt tre ganger ved hjelp av steril bomull tippet applikatorer. Bruk en varm perle sterilisator for å holde instrumentene sterilisert under operasjonen.
  3. Plasser en sterilisert gasbind drapere over venstre ben. Lag en 1,5 cm rett, langsgående snitt i huden på venstre mediale lår fra kneleddet til lysken (figur 1A).

2. Eksponering av femoralarterie og Branches

MERK: Figur 1B viser brutto vasculature anatomi i øvre del av låret. Den overfladiske lårarterie (SFA) kan observeres gjennom et disseksjonsmikroskop når huden innsnitt er riktig gjort langs midtlinjen av den mediale lår.

  1. Åpne opp den tynne fascia liggende den SFA med fine pinsett og deretter sløyfe SFA med 9-0 nylon sutur.
    MERK: I denne prosessen, femoral nerve er lett å sette somide, men den tilstøtende femoralvenepunksjon krever tett oppmerksomhet fordi veggen er så tynn at det lett perforerer og blør. Nøkkelen teknikk er å fokusere på arterien selv; så lenge disseksjonen utføres i nærheten av arterien, er enhver utilsiktet veneskade unngås.
  2. Når SFA er loopet, hold sutur med mygg pinsett og dra den litt nedover. Denne manøveren gjør videre disseksjon lettere, men for å unngå å skade arterien ikke trekke altfor hardt.
  3. Fortsett å dissekere arterien proximally å avsløre og sløyfe den felles lårarterie (CFA) med 9-0 nylon sutur.
    MERK: Vanligvis looping CFA på et punkt distal til magesekkens arterie (figur 1B) er nok for tråd innsetting. Hold CFA suturløkken med mygg tang på samme måte.
  4. Trekk CFA suturløkken oppover og SFA suturløkken nedover for å avdekke den delinger av SFA og dyp lårarterie (DFA). DFA, den viktigste grenen av CFA,går mot låret muskelen (figur 1B).
    MERK: Ledningen vil bli satt inn fra DFA senere.
  5. Loop DFA med ekstra forsiktighet fordi den tilstøtende vene er filtret under arterien. I tilfelle av blødning fra vene, er en 30- til 60 sek enkel kompresjon med gasbind vanligvis tilstrekkelig til å produsere hemostase.
  6. Når DFA er loopet med 9-0 nylon sutur, sørge for at alle tre sutur sløyfer er i riktig posisjon (Figur 2A).
  7. Fortsett med disseksjon av DFA distalt for å ligere arterien på et punkt så langt som mulig fra forgreningen. Skjær ekstra sutur men la en viss lengde slik at de to endene kan holdes med mygg tang, som stabiliserer DFA gjør ledningen innsetting enklere.

3. Opprette Wire Injury

  1. Sett Wire via DFA
    1. Sil de CFA, SFA, og DFA sting for å etablere en midlertidig hemostat.
    2. Lag et lite hull i DFEn med microscissors. Sett tuppene av de buede microtweezers for å strekke hull som er stort nok for en ledning med en 0,015 mm diameter (figur 2B viser forskjellen i størrelse mellom arterien og wire).
      1. Før du foretar et hull i DFA, løsne CFA suturløkken og forsiktig klemme / presse DFA flere ganger med sløve-tipped microtweezers. Denne manøveren utvider diameter arteriell bemerkelsesverdig å lette inn ledningene. Fukting av ledningen grundig med PBS er også viktig for en jevn innsetting.
      2. Når du lager et hull i DFA, ikke beskjære arterieveggen, men gjør en liten v-formet dram og klemme klaff med skarpe spisser microtweezers for manipulasjon.
    3. Sett ledningen gjennom tilstrekkelig-dilatert hull på DFA. Avansere forsiktig ledningen mot bekkenarterien mens løsne sutur sløyfe rundt CFA. 5-8 mm er nok til å dekke hele lengden CFA i de fleste tilfeller (figur 2C
  2. La Wire inne for 1 Min
    1. Etter innsetting av ledningen til den optimale lengden, la den i 1 min sprenger arterieveggen. Fukte wire og arterier med PBS for å hindre uttørking. En annen nylon 9-0 sutur kan plasseres rundt DFA proksimalt for wire-innsettingspunktet i løpet av denne ventetid. Dette sutur vil bli brukt senere for å lukke hullet på DFA etter fjerning av ledningen.
  3. Hente Wire og Gjenoppta Blood Flow
    1. Hold ledningen med fartøyet kanylering tang, og trekk det forsiktig tilbake; ledningen skal hentes jevnt. Å overvinne enhver motstand, vanligvis forårsaket av etterlevelse av ledningen til arterieveggen, trekke tilbake ledningen med milde rotasjon er nyttig. Igjen, kan en kraftig manøver føre dyr tap.
    2. After hente ledningen, ligate DFA på det punktet av delinger med 9-0 nylon sutur. Ikke ligere for nær til forgreningen, ville kunne medføre at blodet utstrømningen til SFA.
    3. Løsne SFA og CFA sutur loops for å gjenoppta normal blodstrøm. Merk at CFA er godt utvidet med ledning innsetting (figur 2D).

4. Skin Closure og Postoperativ Care

  1. Kontroll blør. Minor oser kan stoppes ved enkel kompresjon; noen store arterielle blødninger vil kreve masker med en 11-0 nylon sutur. Disse suturerte arterier vil til slutt føre til arteriell okklusjon.
  2. Lukke huden sår med hud stiftemaskiner (vanligvis 3-4 stifter). Hold såret området sterilisert ved å påføre Klorheksidin kirurgisk løsning.
  3. Påfør etter kirurgi behandlinger. Kontrollere smerte av musen med subkutane injeksjoner av buprenorfin. Hold musen på oppvarming puten før det har gjenvunnet SUFkelig bevissthet for å opprettholde sternum recumbency. Huset det på et rent bur uten selskap av andre dyr før fullt restituert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fire uker etter operasjonen, høste wire-skadde femoralarterie og lage en parafin blokk prøven til analysere neointima formasjon. Indusere generell anestesi som beskrevet ovenfor. Åpne brystet umiddelbart og sette en 20-gauge butterfly nålen til venstre ventrikkel. Koble linje til en infusjonsflaske. Utfør perfusjon fiksering via drypp infusjon av PBS etterfulgt av 4% paraformaldehyde (vanligvis 10-20 ml hver). Infusjonsflasken er plassert ca 140 cm høyere enn hjertet nivå slik at dyret er perfusert ved fysiologisk pressure.Wait i 20 min deretter ta ut ledningen skadet CFA og fikse det i 4% paraformaldehyde natten ved 4 ° C. Lag en parafin blokk av prøven ved hjelp av standard histologiske teknikker og forberede tverrsnitt av 5-mikrometer tykkelse for histologisk farging.

Hematoksylin-eosin farging vil tillate klar visualisering av neointima dannelse inne i wire-skadde femoral arterie (figur 3A, wire-skadet lårarterie, 3B, uskadd lårarterie) Sag med en passende programvare for å måle lumen området (LA), den interne elastiske lamina (IEL) område, og den eksterne elastiske lamina (ål) område fra tverrsnitt (figur 3C). Beregn intima området ved å trekke lumen område fra IEL området; beregne medieområdet ved å trekke IEL område fra EEL område. Intima området / media-området ratio brukes til å sammenligne neointima formasjoner mellom ulike eksperimentelle grupper.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk Illustrasjoner av Skin Incisjon og blodkar Anatomy. (A) En passende hud snitt er ca 1,5 cm i lengde, langs midtlinjen av mediale øvre del av låret. (B) Finn den overfladiske femoralarterie første, felles lårarterie neste, og til slutt,dyp lårarterie. Dissekere hver arterie forsiktig uten skade på tilstøtende vene.

Figur 2
Figur 2: Wire Injury Prosedyre. (A) Den felles lårarterie (pil), den overfladiske lårarterie (stiplet pil), og den dype femoralarterie (pilhode) er utsatt og løkker med suturer. (B) Legg merke til forskjellen i størrelse mellom arterier og 0,015 tommer wire. (C) Det wire er innsatt via den dype femoralarterie. Hold tråden inne i 1 min å ha arterieveggen overstretched. (D) Blodstrømmen er gjenopptatt. Den felles femoralarterie er godt utvidet etter ledningen skade (pil). Linjen indikerer en mm.

Figur 3

Figur3: Hematoxylin-eosin farging av tråd-skadde og uskadde lårarteriene. (A) Et tverrsnitt av en wire-skadet lårarterie avslører en tykk, meget cellulær neointima plakk. (B) Et tverrsnitt av en uskadet lårarterie demonstrerer intakte arteriell veggkonstruksjoner uten neointima dannelse. (C) Det grønne linje avtegner lumen området, den gule linjen markerer innvendig elastisk lamina, og den blå linjen markerer ekstern elastisk lamina. Strek viser 100 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ledningen skade prosedyren gjelder for alle stammer av mus så lenge deres anatomiske strukturer er like. 4 I denne artikkelen har vi brukt mannlige C57BL / 6 mus med en alder av 12-16 uker. Som vi har lært av våre forstudier, lårarteriene av mus yngre enn 10 uker er ofte så små at ledningen innsetting er ganske utfordrende. På den annen side er ledningen innsetting i mus som er eldre enn 16 uker, er teknisk enklere, men har en tendens til å resultere i mer variabel neointimal hyperplasi. Hunnmus tendens til å pådra seg mindre neointimal dannelse enn menn. Selv om trådskade prosedyre kan utføres på hver side av de femorale arterier, foretrekker vi venstre side på grunn av den anatomiske tilgjengeligheten for høyrehendte operatører.

Blant alle musemodeller av post-angioplastikk restenose, arteriell ledning skade stort sett etterligner angioplastikk ved endothelial denudasjon og åreveggen overstreching. 2,5,6 Deter to viktige mål arterier for ledning skade: lårarteriene og carotis. Fra et teknisk synspunkt, er ledning innsetting enklere for carotis fordi de er bredere enn lårarteriene. Imidlertid har en tendens til neointima dannelse til å være mindre robust i carotis enn i lårarteriene, sannsynligvis på grunn av mindre effektiv denudasjon. Noen forfattere bruker et håndlaget enhet for å skape en mer aggressiv avdekning av endothelceller i carotis. 7. På den annen side er fordelen av lårarterien trådskade modell som det kan utføres med homogent produsert, kommersielt tilgjengelige ledninger for å indusere neointimal hyperplasi i en reproduserbar måte.

For å gjøre en vellykket ledning skade i muse lårarteriene, er nøkkelen til å operere under en disseksjonsmikroskop med tilstrekkelig forstørrelse og å bruke gode instrumenter - microtweezers og microscissors spesielt. Microtweezers med skarpe tips er nyttig å dissect ut vevet rundt arterien mens de med sløv tips er nyttig å plassere en sutur sløyfe rundt arterien og å strekke ledningen inngang hull laget av en skarp arteriotomi med microscissors.

En anatomisk disseksjon av arterien er en annen viktig. Rundt den arterielle adventitia eksisterer det en tynn plan hvor disseksjon kan utføres lett og jevnt. Finn flyet først, og deretter fortsette med disseksjon. Også prøve å dissekere ut tilstøtende vene bare på stedet av sutur looper å unngå vene skader, som er den viktigste årsaken til blødning i denne prosedyren. Selv i den opprinnelige metoden arterien og venen er loopet sammen, 4 finner vi at looping arterie bare gir bedre kontroll for både hemostase og wire innsetting.

Wire innsetting er den vanskeligste delen av denne prosedyren. En 0,015-tommers ledning er omtrent tre ganger tykkere enn DFA, tilgang arterien. De viktigste teknikkene herer: strekke DFA selv før arteriotomi; å lage en liten inngang hull som er gradvis utvidet med microtweezer tips; og unngå kraftig ledning innsetting - disse teknikkene er beskrevet i protokollen delen. Mens i den opprinnelige metoden lidokain anvendes for å strekke arterien før innsetting ledningen 4, er det funnet unødvendig.

Neointima dannelse etter lårarterien trådskade utvikler seg med tiden, topper ved 3-4 uker etter skade, og forblir stabilt på 8 uker. 4,8 Forfatterne vanligvis vente i 4 uker basert på våre preliminære data at mengden av neointima ved 3 uker er generelt mindre enn mengden i 4 uker etter trådskade (data ikke vist).

Interessant, svarene på arteriell skade varierer mellom ulike musestammer. Ifølge flere rapporter som undersøker forskjeller mellom musestammer etter femoralis eller arteria carotis skade, FVB / N mus viser den høyeste amount av neointima formasjon, etterfulgt av 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / C, og C57BL / 6, henholdsvis. 4,9,10 Disse egenskapene bør vurderes når du komponerer et eksperimentelt plan. Lårbens skade modellen kan også benyttes for etterforskning av inflammatoriske endringer etter vaskulær skade. Inflammatorisk celleinfiltrasjon ble rapportert å øke betydelig tre dager etter skade. 11

I konklusjonen, er det trådskademodellen bruker muse lårarteriene spesielt egnet til å undersøke post-angioplastikk restenose, og prosessen kan utføres trygt og enkelt ved hjelp av metoden presenteres her. Hele prosedyren kan være ferdig innen 20 min når teknikkene er fullt kjent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fixed Core Wire Guide Cook G02426 Diameter 0.015 inch, Straight
Dilation Forceps Roboz RS-4927 Curved, blunt tips
Dumont Tweesers #5 World Precision Instruments 14095 Straight, sharp tips
Dumont Vessel Cannulation Forceps World Precision Instruments 503373
McPherson-Vannas Scissors World Precision Instruments 501234
Mosquito Forceps World Precision Instruments 501291
Ethilon Nylon Suture 9-0 Ethicon 7717G 9-0, Black Nylon Monofilament
Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point AROSurgical VT4A00N07 11-0, Black Nylon Monofilament
3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler 3M DS-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
  2. Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
  3. Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
  4. Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
  5. Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
  6. Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
  7. Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
  8. Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
  9. Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
  10. Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
  11. Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).

Tags

Medisin Restenose neointimal Hyperplasi Mouse femoralarterie Wire Injury Model
En Muse Modell av arteriell restenose: tekniske aspekter ved Femoral Wire Injury
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Takayama, T., Shi, X., Wang, B.,More

Takayama, T., Shi, X., Wang, B., Franco, S., Zhou, Y., DiRenzo, D., Kent, A., Hartig, P., Zent, J., Guo, L. W. A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury. J. Vis. Exp. (97), e52561, doi:10.3791/52561 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter