Summary
restenoz fare femoral arter yaralanması tel modeli teknik olarak zordur. Bu protokolde başarıyla restenoz çalışmaları için tutarlı neointima ikna etmek tel yaralanması gerçekleştirmek için anahtar teknik detaylar önemlidir göstermektedir.
Abstract
Ateroskleroz neden Kardiyovasküler hastalık gelişmiş dünyada önde gelen ölüm nedenidir. Nedeniyle aterosklerotik plak gelişimi veya kurulmuş plakların çatlaması, damar lümeninin daralması gibi miyokard enfarktüsü ve inme gibi çeşitli hastalıklar giden normal kan akışını keser. Anjiyoplasti gibi klinik endovasküler işlemlerde yaygın lümen yeniden açmak için yapılır. Bununla birlikte, bu tedaviler, kaçınılmaz olarak bir fazla iyileşme yanıtı ve damar restenozu (yeniden daralma) neden olan lümen içine uzanan bir neointimal plak gelişimini tetikleme, damar duvarı hem de vasküler endotel hasar. Restenoz ateroskleroz için endovasküler tedavi başarısızlığı önemli bir nedenidir. Böylece, restenoz preklinik hayvan modelleri öteleme vasküler müdahalelere yaklaşımları yanı sıra patofizyolojik mekanizmaları araştırmak için hayati önem taşımaktadır. Bir çok murin experime arasındayakından endotel ve damar duvarını hem yaralı anjiyoplasti işlemi benzer çünkü ntal modelleri, femoral arter tel yaralanması yaygın anjiyoplasti sonrası restenoz çalışmaları için en uygun olarak kabul edilir. Ancak, birçok araştırmacı nedeniyle teknik zorluk yüksek derecede bu modeli kullanan zorluk. Bu, bir metal tel belirgin neointima indüklemek için yeterli darbe üretmek için, yaklaşık olarak tel üç kat daha incedir femoral arter içine takılması gerekir öncelikle çünkü. Burada, biz etkili bu modelin önemli teknik zorlukların üstesinden gelmek için gerekli cerrahi ayrıntıları açıklar. , Sunulan prosedürleri takip gerçekleştirerek fare femoral arter tel yaralanması kolaylaşır. Aşina sonra, bütün işlem 20 dakika içinde tamamlanabilir.
Protocol
NOT: Etik Açıklama: Tüm işlemler Wisconsin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu (Ulusal Akademiler Press, 8. baskı, 2011), ve protokollere uygun. Tüm ameliyatlar (oran 2 ml / dak akış, teneffüs yoluyla) izofluran anestezi altında, ve tüm çabalar acı en aza indirmek için yapılmıştır. Hayvanlar kademeli CO2 ile doldurulmuş bir odacığm içine kurban edilmiştir.
Genel Anestezi ve Cilt Kesiden 1. İndüksiyon
- 23-28 g bir 12-16 haftalık yaş ve vücut ağırlığı, erkek C57BL / 6 fareleri kullanın. Kapalı-devre anestezi aparatı ile izofluran ile hayvan anestezisi. Onun ayak kısma doğru anesthetization onaylayın. Kuruluğunu önlemek için gözlerin bazı yapay gözyaşı merhemi sürün.
- Biraz kaçırılan sol arka bacak ve diz eklem sl ile yatar pozisyonda fare yerleştirinightly gerdi. Sol üst uyluk yöresinde saç tıraş ve klorheksidin ile cilt dezenfekte, steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak üç kez uygulandı. Ameliyat sırasında sterilize aletler tutmak için sıcak bir boncuk sterilizatör kullanın.
- Sol bacak üzerinde bir sterilize gazlı bez örtü yerleştirin. Kasık (Şekil 1A) diz ekleminin sol medial uyluk üzerinde 1.5 cm düz, uzunlamasına deri kesi yapmak.
Femoral Arter ve Şube 2. Pozlama
NOT: Şekil 1B üst uyluk brüt damar anatomisini gösterir. cilt kesi düzgün medial uyluk orta hat boyunca yapıldığında yüzeyel femoral arter (SFA) bir mikroskop aracılığıyla görülebilir.
- Ince cımbız ve daha sonra döngü 9-0 naylon sütür ile SFA ile SFA örten ince fasya açın.
NOT: Bu süreçte, femoral sinir kolayca konuronun duvara kolayca deler ve kanamaları çok ince olduğu için ide, ancak bitişik femoral ven yakın ilgi gerektirir. anahtar teknik arter kendisine odaklanmak; sürece diseksiyon yakın arterin yürütülen olarak, herhangi bir kaza sonucu damar hasarı önlenebilir. - SFA döngüye sonra, sivrisinek forseps ile dikiş tutun ve hafifçe aşağı doğru çekin. Bu manevra kolay daha diseksiyon yapar, ama çok zorla çekmeyin arter zarar vermemek için.
- Proksimale 9-0 naylon sütür ile femoral arter (CFA) ortaya çıkarmak ve döngü arter diseksiyon devam edin.
NOT: Genellikle, epigastrik arter (Şekil 1B) bir nokta distalinde CFA döngü tel yerleştirilmesi için yeterli. Aynı şekilde sivrisinek forseps ile CFA dikiş döngü tutun. - Yukarı CFA sütür döngü çekin ve SFA sütür döngü aşağı SFA ve derin femoral arter (DFA) çatallaşmayı ortaya çıkarmak. DFA, CFA büyük şube,uyluk kas (Şekil 1B) doğru gider.
NOT: tel sonra DFA'dan eklenecektir. - Ekstra dikkatli Döngü DFA bitişik ven arterin altında karışık çünkü. Venden kanama durumunda, gazlı bez ile bir 30- ila 60 sn, basit bir sıkıştırma genellikle hemostaz üretmek için yeterlidir.
- DFA 9-0 naylon sütür ile döngüye sonra, her üç dikiş döngüler (Şekil 2A) onların doğru pozisyonlarda olduğundan emin olun.
- Distale mümkün olduğunca bifurkasyonundan bir noktada arter bağlanması için DFA diseksiyonu ile devam edin. Ekstra dikiş kesin ama iki ucu DFA tel ekleme yapma kolay stabilize sivrisinek forseps ile tutulabilir, böylece belli bir uzunluğa bırakın.
3. Tel Yaralanması oluşturma
- DFA aracılığıyla Tel takın
- Geçici hemostat kurmak için CFA, SFA ve DFA sütür süzün.
- DF küçük bir delik açınMicroscissors için uygun değildir. Bir 0.015 inç çaplı bir tel için yeterince büyük bir delik genişletmek için kavisli microtweezers ipuçlarını yerleştirin (Şekil 2B arter ve tel arasındaki boyut farkı gösterir).
- DFA'da bir delik yapmadan önce, CFA sütür döngü gevşetin ve hafifçe kelepçe / donuk uçlu microtweezers ile DFA birkaç kez sıkın. Bu manevra tel ekleme kolaylaştırmak için son derece arteriyel çapını genişletir. PBS ile iyice tel Rutubet zamanda yumuşak sokulması için önemlidir.
- DFA'da bir delik yaparken, arter duvarı kırpmak, ama küçük bir v şekilli nip yapmak ve manipülasyon için keskin uçlu microtweezers ile flep çimdik yok.
- DFA üzerinde yeterince-genişlemiş delikten teli takın. CFA etrafında dikiş döngü gevşeterek ederken yavaşça iliak arter doğru tel ilerlemek. 5-8 mm çoğu durumda tüm CFA uzunluğu karşılamak için yeterli olduğunu (Şekil 2C
- Min 1 için içeride Tel bırakın
- Optimal uzunlukta tel taktıktan sonra, arter duvarı daraltabilir 1 dakika bırakın. Kurumasını önlemek için PBS ile tel ve arterler ıslatın. Başka bir 9-0 naylon dikiş bu bekleme süresi boyunca kablo ekleme noktasına DFA proksimal çevresinde yerleştirilebilir. Bu dikiş tel çıkarılmasını takiben DFA delik kapatmak için daha sonra kullanılacaktır.
- Tel Al ve Kan Akışı Devam
- Damar kanülasyon forseps ile tel tutun ve onu nazikçe geri çekin; Tel sorunsuz alınabilir olmalıdır. Nazik rotasyon ile tel geri çekerek, genellikle arter duvarına tel bağlılık kaynaklanan herhangi bir direnç, üstesinden gelmek için yardımcı olur. Yine, güçlü bir manevra hayvan kaybına neden olabilir.
- Birtel almak fter, 9-0 naylon sütür ile çatallanma noktasında DFA Arter. SFA kan çıkışı tehlikeye atacağını bifürkasyonun, çok yakın Arter etmeyin.
- Normal kan akışını sürdürmek için SFA ve CFA dikiş döngüler gevşetin. CFA tel yerleştirme (Şekil 2B) tarafından iyi genişletilmiş olduğunu unutmayın.
4. Cilt Kapatma ve Ameliyat Sonrası Bakım
- Kontrol kanar. Küçük sızıntı basit sıkıştırma durdurulabilir; bazı büyük arter kanamaları bir 11-0 naylon sütür ile dikiş gerektirir. Bu dikildi arterler sonunda arter tıkanıklığına neden olur.
- Cilt Zımbalar (genellikle 3-4 zımba) ile yara cilt kapatın. Klorheksidin cerrahi çözüm uygulayarak sterilize yara alan tutun.
- Ameliyat sonrası tedavileri uygulayın. Buprenorfin subkutan enjeksiyonu ile fare ağrıyı kontrol. Bu suf kavuşana kadar ısınma pad üzerinde fare tutmaksternum yatma korumak için bilinç ficient. Diğer hayvanların şirket olmadan temiz bir kafes içinde Evi onu tamamen iyileşene kadar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ameliyatı takiben dört hafta, tel yaralı femoral arter hasat ve neointima oluşumunu analiz etmek için bir parafin blok örneği olun. Yukarıda tarif edilen genel anestezi neden. Hemen göğüs açın ve sol ventrikül bir 20-gauge kelebek iğne takın. Bir infüzyon şişe hattını bağlayın. % 4 paraformaldehid (genellikle 10-20 ml, her biri), ardından PBS damla infüzyon yoluyla perfüzyon fiksasyon gerçekleştirin. Hayvan daha sonra tel yaralı CFA çıkar ve 4 ° C'de gece boyunca% 4 paraformaldehid düzeltmek 20 dakika fizyolojik pressure.Wait perfüze böylece infüzyon şişesi kalp seviyesinden yaklaşık 140 cm yüksek yerleştirilir. Standart histolojik teknikler kullanılarak numunenin bir parafin blok yapın ve histolojik boyama için 5 mikron kalınlığında enine kesitler hazırlamak.
Hematoksilen-Eozin boyama tel yaralı f içindeki neointima oluşumu açıkça görüntülenmesini sağlayacakemoral arter (Şekil 3A, tel hasarlı femoral arter, 3B, yaralanmamış femoral arter) uygun bir yazılım yararlanabileceğinizi lümen alanına (LA), internal elastik lamina (IEL) alanı ve dış esnek lamina (yılan balığı) alanının otomatik olarak ölçülmesi için kesitten (Şekil 3C). IEL alanından lümen alanı çıkarılarak intima alanını hesaplayın; EEL alanından IEL alanı çıkarılarak medya alanı hesaplamak. Intima alanı / medya alanı oranı farklı deneysel gruplar arasındaki neointima oluşumları karşılaştırmak için kullanılır.
Şekil 1: Cilt Kesiden ve damarları Anatomi şematik Çizimler. (A) uygun bir cilt kesisi medial üst uyluk orta hat boyunca, uzunluğu yaklaşık 1,5 cm. (B) nihayet sonraki ilk femoral arter yüzeyel femoral arter bulun, vederin femoral arter. Bitişik ven zarar vermeden dikkatli bir şekilde her arteri ayır.
Şekil 2: Tel Sakatlık Prosedürü. (A) femoral arter (ok), yüzeyel femoral arter (noktalı ok) ve derin femoral arter (ok başı) maruz kalan ve dikiş ile döngüye. (B) arterler ve 0.015 inç arasındaki boyut farkı Not Tel. (C) tel derin femoral arter yoluyla eklenir. Egilimidir arter duvar var 1 dakika içinde tel tutun. (D) Kan akışı devam eder. femoral arter yaralanması tel (ok) sonra iyi genişletilmiştir. Bar 1 mm gösterir.
Şekil3: Tel-yaralı ve yaralanmamış femoral arter Hematoksilen-eozin boyama. (A), bir tel yaralı femoral arterin bir kesit kalın, yüksek hücre neointima plak ortaya koymaktadır. (B) bir zarar görmemiş femoral arterin bir çapraz kesiti, herhangi bir neointima oluşumunun olmadan sağlam arter duvar yapılarını gösterir. (C), yeşil hat sarı çizgi internal elastik lamina delineates, lümen alanı delineates ve mavi çizgi dış elastik lamina anlatır. Bar 100 mikron gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tel yaralanma prosedürü, biz 12-16 haftalık bir yaş erkek C57BL / 6 fareler kullanıldı sürece onların anatomik yapıları benzer olarak. 4 Bu yazıda farelerin tüm suşları için geçerlidir. Bizim ön çalışmalardan öğrendiğimiz gibi, 10 haftadan küçük farelerin femoral arter genellikle tel ekleme oldukça zorlu olduğunu çok küçük. Diğer yandan, 16 haftadan daha yaşlı farelerin tel ekleme teknik olarak daha kolay olan, ancak çok büyük bir çeşitlilik neointimal hiperplazi neden olma eğilimindedir. Dişi fareler erkeklerden daha az neointimal oluşumu tabi eğilimindedir. Tel yaralanma prosedürü femoral arter iki tarafında yapılabilir rağmen, biz çünkü sağ elini operatörler için anatomik erişilebilirlik sol tarafını tercih.
Anjiyoplasti sonrası restenoz tüm fare modellerinde arasında, arteriyel tel yaralanması çoğunlukla yakından. Endotelyal soyulma ve damar duvarı overstreching ile anjiyoplasti taklit Orada 2,5,6femoral arter ve karotid arterler: İki telli yaralanma için büyük hedef arterler vardır. Femoral arterler daha geniş çünkü bakış teknik açıdan, tel ekleme karotis arterler için daha kolaydır. Ancak, neointima oluşumu nedeniyle daha az etkili soymadan muhtemelen femoral arterlerde, bu daha karotis arterlerde daha az güçlü olma eğilimindedir. Bazı yazarlar, karotid arterlerde daha agresif bir endotel denüdasyonu oluşturmak için bir el yapımı bir cihaz kullanın. 7 Öte yandan, femoral arter tel yaralanması modelinde avantajı, neointimal hiperplaziyi indükleme homojen imal ticari olarak temin teli ile gerçekleştirilebilir olmasıdır tekrarlanabilir şekilde.
Özellikle microtweezers ve Microscissors - fare femoral arterlerde başarılı bir tel yaralanması yapmak için, anahtar yeterli büyütme ile bir mikroskop altında faaliyet ve ince araçları kullanmaktır. Keskin ipuçları Microtweezers dissec yararlıdırkünt ipuçları olanlar arter etrafında bir dikiş döngü yerleştirmek ve microscissors keskin Arteriyotomi tarafından yapılan tel giriş deliği genişletmek için yararlıdır ise arter çevreleyen dokuların dışarı t.
Arterin anatomik diseksiyon başka anahtarıdır. Arteriyel adventisyasında etrafında diseksiyonu kolayca ve sorunsuz yapılabilir ince bir uçağı vardır. İlk uçağı bul, sonra diseksiyon ile devam edin. Ayrıca, dikiş site bu prosedürde kanama en önemli nedenidir damar hasarı önlemek için döngüler sadece komşu ven teşrih çalışın. Orijinal yöntemde atardamar ve toplardamar birlikte döngüye rağmen, 4 biz döngü arter sadece hemostaz ve tel yerleştirme hem de daha iyi kontrol sağladığını bulmak.
Tel ekleme Bu prosedürün en zor kısmıdır. Bir 0.015-inç tel DFA, erişim arter daha kabaca üç kat daha kalındır. Buradaki anahtar tekniklerşunlardır: arteriotomi önce DFA kendisini dilate; yavaş yavaş microtweezer ipuçları ile dilate küçük bir giriş deliği yapmak; ve güçlü tel ekleme kaçınarak - bu teknikler protokol bölümünde ayrıntılı olarak verilmiştir. Orijinal yöntem lidokain tel takılması 4 önce arter dilate uygulanır iken, biz gereksiz buluyorum.
Femoral arter tel yaralanma sonrasında neointima oluşumunun yaralanmadan sonra zamanla 3-4 hafta tepe noktaları ilerler ve 8 hafta stabil kalır. 4,8 yazarlar genellikle eden ön verilere göre 4 hafta beklemek 3 hafta neointimaya miktarı bu Tel yaralanmadan sonra 4 hafta miktardan daha az olacaktır (veriler gösterilmemiştir).
İlginçtir, arteriyel yaralanma tepkiler çeşitli fare suşları arasında farklılık gösterir. Femoral veya karotis arter yaralanması sonrası fare suşları arasındaki farklılıkları araştıran birkaç haberlere göre, FVB / N fareler yüksek amo görüntülerBir deney planı oluştururken 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / C ve sırasıyla, C57BL / 6. 4,9,10, ardından neointima oluşumunun olduğu akla Bu özellikler göz önünde bulundurulmalıdır. Femoral yaralanma modeli aynı zamanda damar yaralanma sonrası inflamatuar değişikliklerin araştırılması için kullanılabilir. İltihabi hücre infiltrasyonu üç gün yaralanma sonrası önemli ölçüde artış bildirilmiştir. 11
Sonuç olarak, fare, femoral artere kullanarak tel zedelenme modeli anjiyoplasti sonrası restenoz araştırmak için özellikle uygun olan ve işlem güvenli ve kolay bir Burada yer alan yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir. teknikleri tam tanıtılır kez tüm prosedürü 20 dakika içinde bitmiş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
