Summary
De muis dijbeenslagader draad letsel model van restenose is technisch uitdagend. In dit protocol laten we de belangrijkste technische gegevens van essentieel belang voor het succesvol uitvoeren van draad letsel aan consistente neointima voor studies van restenose induceren.
Abstract
Cardiovasculaire ziekte veroorzaakt door atherosclerose is de belangrijkste doodsoorzaak in de ontwikkelde wereld. Vernauwing van de lumen van het vat, door atherosclerotische plaque ontwikkeling of het scheuren van gevestigde plaques, onderbreekt normale bloedstroom leidt tot verschillende morbiditeit zoals myocardiaal infarct en beroerte. In de kliniek endovasculaire procedures zoals angioplastie worden gewoonlijk uitgevoerd om het lumen te heropenen. Echter, deze behandelingen onvermijdelijk de vaatwand en het vasculaire endotheel beschadigen triggering een overmatige genezingsrespons en de ontwikkeling van nieuwe intima plaque die zich in het lumen waardoor vat restenose (opnieuw vernauwen). Restenose is een belangrijke oorzaak van het falen van endovasculaire behandelingen voor atherosclerose. Zo preklinische diermodellen van restenose zijn van vitaal belang voor het onderzoeken van de pathofysiologische mechanismen alsook translationeel benaderingen van vasculaire interventies. Tussen verschillende muizen experimental modellen wordt femorale slagader draad letsel algemeen aanvaard als het meest geschikt voor onderzoek van post-angioplastiek restenose omdat het lijkt op de angioplastieprocedure dat zowel endotheel en vaatwand verwondt. Veel onderzoekers hebben moeite gebruikmaking dit model door de hoge technische moeilijkheidsgraad. Dit komt vooral omdat een metalen draad moet worden ingebracht in de femorale slagader, die ongeveer drie maal dunner dan de draad voldoende schade genereren prominente neointima induceren. Hier beschrijven we de essentiële chirurgische gegevens om effectief het overwinnen van de grote technische moeilijkheden van dit model. Door het volgen van de gepresenteerde procedures, het uitvoeren van de muis dijbeenslagader draad letsel wordt makkelijker. Eenmaal vertrouwd, kan de hele procedure worden voltooid binnen 20 min.
Protocol
OPMERKING: Ethiek Verklaring: Alle procedures voldoen aan de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (National Academies Press, 8e editie, 2011), en de protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Wisconsin goedgekeurd. Alle operaties werden uitgevoerd onder isofluraan anesthesie (door inademen, debiet 2 ml / min), en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. De dieren werden gedood in een kamer geleidelijk gevuld met CO2.
1. Inductie van algehele anesthesie en huidincisie
- Gebruik mannelijke C57BL / 6 muizen met een leeftijd van 12-16 weken en gewicht van 23-28 g. Verdoven van het dier door isofluraan via een gesloten circuit anesthesie-apparatuur. Bevestig de juiste verdoving door knijpen haar teen. Breng wat kunsttranen zalf op de ogen tot droog te voorkomen.
- Plaats de muis in een liggende positie met de linker achterpoot iets ontvoerd en het kniegewricht slightly gebogen. Scheer de haren rond de linker bovenbeen regio en ontsmet de huid met chloorhexidine, toegepast drie keer met steriele wattenstaafje applicators. Gebruik een hete kraal sterilisator om de instrumenten gesteriliseerd tijdens de operatie te houden.
- Plaats een gesteriliseerde gaas laken over het linkerbeen. Maak een 1,5 cm recht, longitudinale incisie in de huid op de linker mediale dij van het kniegewricht aan de lies (Figuur 1A).
2. Blootstelling van Femorale Artery en Takken
OPMERKING: Figuur 1B toont de bruto vaatstelsel anatomie in het bovenbeen. De oppervlakkige femorale slagader (SFA) kan worden waargenomen door een dissectie microscoop wanneer de huid incisie correct gebeurt langs de middellijn van het mediale dij.
- Openstellen van de dunne fascia bovenop de SFA met fijne pincet en dan loop de SFA met 9-0 nylon hechtdraad.
Opmerking: In dit proces, de femorale zenuw makkelijk weer alside, maar de aangrenzende dijader vereist veel aandacht, omdat de muur is zo dun dat het gemakkelijk perforeert en bloedt. De belangrijkste techniek is gericht op de slagader zelf; Zolang de dissectie dichtbij de slagader plaatsvindt, onopzettelijke ader schade vermeden. - Zodra de SFA wordt gelust, houdt u de hechtdraad met mosquitoklem en trek deze iets omlaag. Deze manoeuvre maakt verdere dissectie gemakkelijker, maar om te voorkomen dat schade aan de slagader niet te hard te trekken.
- Blijven het ontleden van de slagader proximaal bloot te leggen en loop de gemeenschappelijke dijbeenslagader (CFA) met 9-0 nylon hechtdraad.
OPMERKING: Meestal looping de CFA op een punt distaal van de epigastrische slagader (Figuur 1B) is genoeg voor draad inbrengen. Houd de CFA hechtdraadlus met mosquitoklem op dezelfde manier. - Trek de CFA hechtdraadlus omhoog en de SFA hechtdraadlus naar beneden tot aan de splitsing van de SFA en diepe dijbeenslagader (DFA) bloot te leggen. De DFA, de belangrijkste tak van de CFA,gaat naar de dijspier (Figuur 1B).
OPMERKING: De draad wordt van de DFA later worden ingebracht. - Loop de DFA met extra voorzichtigheid omdat de aangrenzende ader is verward onder de slagader. Bij bloeden uit de ader, 30 tot 60 sec eenvoudige compressie met gaas is meestal voldoende om hemostase te produceren.
- Zodra de DFA is doorgelust met 9-0 nylon hechtdraad, zorg ervoor dat alle drie de hechtdraad lussen zijn op hun juiste positie (Figuur 2A).
- Ga verder met de dissectie van de DFA distaal van de slagader ligeren op een punt zo ver mogelijk van de bifurcatie. Snij extra hechting maar laat een bepaalde lengte, zodat de twee uiteinden worden gehouden met mosquitoklem die stabiliseren de DFA waardoor de draad inbrengen makkelijker.
3. Het creëren van Wire Injury
- Steek de draad via DFA
- Zeef de CFA, SFA, en DFA hechtingen om een tijdelijke vaatklem vestigen.
- Maak een klein gaatje in de DFEen met microscissors. Steek de uiteinden van de gebogen microtweezers het gat groot genoeg voor een draad met een 0,015 inch diameter verwijden (Figuur 2B toont het verschil in grootte tussen de slagader en de draad).
- Alvorens een gat in de DFA, maak de CFA hechtdraadlus en voorzichtig klem / knijp de DFA meerdere malen met doffe-getipt microtweezers. Deze manoeuvre breidt de arteriële diameter opmerkelijk om de draad plaatsen vergemakkelijken. Het bevochtigen van de draad grondig met PBS is ook belangrijk voor een gemakkelijk inbrengen.
- Bij het maken van een gat in de DFA, hoeft de slagaderwand niet bijsnijden, maar een kleine v-vormige nip en knijp de flap met scherpe-getipt microtweezers voor manipulatie.
- Steek de draad door het adequaat-verwijde gat op de DFA. Zachtjes vooruit de draad in de richting van de bekkenslagader terwijl het losdraaien van de hechtdraad lus rond de CFA. 5-8 mm is voldoende om de lengte CFA meestal dekking (figuur 2C
- Verlaat Wire binnen voor 1 Min
- Nadat de draad om de optimale lengte, laat het gedurende 1 min tot de slagaderwand uitrekken. Bevochtig de draad en slagaders met PBS om uitdroging te voorkomen. Een ander 9-0 nylon hechting kan rond de DFA proximale om de draad-invoegpunt geplaatst worden gedurende deze wachttijd. Deze hechting wordt later gebruikt om het gat af op DFA na verwijdering van de draad.
- Ophalen Wire en hervatten van de bloedstroom
- Houd de draad met vat infusen tang, en trek het voorzichtig naar achteren; de draad moet soepel worden opgehaald. Om weerstand, meestal veroorzaakt door hechting van de draad aan de slagaderwand te overwinnen, terugtrekken van de draad met zachte rotatie nuttig. Ook zou een krachtig manoeuvre leiden tot dier.
- EenN a het ophalen van de draad, afbinden van de DFA op het punt van de splitsing met 9-0 nylon hechtdraad. Niet te dicht bij de splitsing, die het bloed uitstroom naar de SFA in gevaar zou brengen afbinden.
- Maak de SFA en CFA hechtdraad lussen naar de normale bloedstroom te hervatten. Merk op dat de CFA is goed uitgebreid met draad inbrengen (figuur 2D).
4. Wondsluiting en postoperatieve zorg
- Controle bloedt. Minor lekt kan worden gestopt door eenvoudige compressie; enkele belangrijke arteriële bloedingen zal steken met een 11-0 nylon hechtdraad nodig. Deze gehecht slagaders uiteindelijk tot arteriële occlusie.
- Sluit de huid wond met de huid nietmachines (meestal 3-4 nietjes). Houd de wond gebied gesteriliseerd door het toepassen van chloorhexidine chirurgische oplossing.
- Van toepassing na de operatie behandelingen. De controle van de pijn van de muis met subcutane injecties van buprenorfine. Houd de muis op de opwarming pad totdat het suf heeft herwonnendoende bewustzijn borstligging behouden. Huis in een schone kooi zonder gezelschap van andere dieren tot ze volledig hersteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vier weken na de operatie, oogsten de draad gewonden dijbeenslagader en maak een paraffineblok monster tot het neointimavorming analyseren. Laten algemene anesthesie zoals hierboven beschreven. Open de kist onmiddellijk en plaats een 20-gauge vleugelnaald op de linker hartkamer. Sluit de lijn aan een infuus fles. Voer perfusiefixatie via druppelinfuus PBS gevolgd door 4% paraformaldehyde (meestal 10-20 ml elk). De infusie fles is ongeveer 140 cm hoger geplaatst dan de hoogte van het hart, zodat het dier wordt doorbloed bij fysiologische pressure.Wait 20 min neem vervolgens de draad gewonden CFA en bevestig het in 4% paraformaldehyde overnacht bij 4 ° C. Maak een paraffineblok van het monster met behulp van standaard histologische technieken en bereiden dwarsdoorsneden van 5 micrometer dik voor de histologische kleuringen.
Hematoxyline- eosinekleuring zal duidelijk visualisatie van neointimavorming binnenin de draad gewonden f toestaanemoral slagader (figuur 3A-wire gewond dijbeenslagader; 3B, ongedeerd dijbeenslagader) .Gebruik een juiste software om het lumen gebied (LA), de interne elastische lamina (IEL) gebied, en de externe elastische lamina (EEL) gebied te meten van doorsnede (figuur 3C). Bereken de intima gebied door het aftrekken lumen gebied van IEL gebied; bereken de media gebied door het aftrekken van IEL gebied van EEL gebied. Intima gebied / media gebied ratio wordt gebruikt om de neointima formaties tussen de verschillende experimentele groepen te vergelijken.
Figuur 1: Schematische Illustraties van huidincisie en vaatstelsel Anatomie. (A) een geschikte incisie ongeveer 1,5 cm lang, langs de middellijn van mediale bovenbeen. (B) Vind de oppervlakkige femorale slagader eerste, de femoralis communis volgende, en tenslotte dediepe dijbeenslagader. Ontleden elke slagader voorzichtig zonder de naburige ader.
Figuur 2: Wire Injury Procedure. (A) De gemeenschappelijke dijbeenslagader (pijl), de oppervlakkige dijbeenslagader (gestippelde pijl), en de diepe dijbeenslagader (pijlpunt) worden blootgesteld en een lus met hechtingen. (B) Let op het verschil in grootte tussen de slagaders en de 0,015 inch wire. (C) De draad wordt door de diepe femorale slagader. Houd de draad binnen voor 1 min tot de slagaderwand hebben overbelast. (D) De bloedstroom wordt hervat. De gemeenschappelijke dijbeenslagader is goed uitgebouwd na draad letsel (pijl). Balk geeft 1 mm.
Figuur3: Hematoxyline-eosine kleuring van-draad gewonden en ongedeerd dijbeenslagaders. (A) Een dwarsdoorsnede van een draad gewonden femoralis onthult een dik, zeer cellulaire neointima plaque. (B) een dwarsdoorsnede van een niet-beschadigde femorale slagader illustratie intacte vaatwand structuren zonder neointimavorming. (C) De groene lijn bakent lumen gebied, de gele lijn bakent interne elastische lamina, en de blauwe lijn bakent externe elastische lamina. Balk geeft 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De draad letsel procedure voor alle muizenstammen zolang hun anatomische structuren lijken. 4 In dit document, gebruikten we mannelijke C57BL / 6 muizen met een leeftijd van 12-16 weken. Zoals we hebben geleerd van onze voorstudies, de dijbeenslagaders van muizen jonger dan 10 weken zijn vaak zo klein dat draad inbrengen is heel uitdagend. Anderzijds, draad insertie in muizen ouder dan 16 weken technisch eenvoudiger maar pleegt te leiden tot variabele neointima hyperplasie. Vrouwelijke muizen hebben de neiging om minder vorming van nieuwe intima dan mannen oplopen. Hoewel de draad schade procedure kan worden uitgevoerd op beide zijden van de femorale slagaders verkiezen we de linkerkant vanwege de anatomische toegankelijkheid voor rechtshandige operators.
Van alle muismodellen van post-PTA restenose, arteriële draad letsel meestal nabootst angioplastiek door endotheliale denudatie en vaatwand overstreching. 2,5,6 Erzijn twee belangrijke doelgroep slagaders voor draad letsel: dijbeenslagaders en halsslagaders. Vanuit technisch oogpunt draad insertie makkelijker halsslagaders omdat ze breder zijn dan femorale arteriën. Echter, neointima vorming neiging minder robuust halsslagaders dan die femorale slagaders, waarschijnlijk vanwege minder effectief denudatie. Sommige auteurs gebruiken een handgemaakte inrichting een meer agressieve endotheliale denudatie creëren halsslagaders. 7 Aan de andere kant, het voordeel van de femorale slagader draad letsel model is dat kan worden uitgevoerd met homogene vervaardigd handel verkrijgbare draden neointima hyperplasie in reproduceerbare wijze.
Om een succesvolle draad blessure in de muis dijbeenslagaders maken, de sleutel is om te werken onder een dissectiemicroscoop met voldoende vergroting en om fijne instrumenten te gebruiken - microtweezers en microscissors in het bijzonder. Microtweezers met scherpe tips zijn nuttig om dissect uit de weefsels rond de slagader, terwijl degenen met stompe tips zijn nuttig om een hechting lus rond de slagader te plaatsen en om de draad ingang gat gemaakt door een scherpe arteriotomie met microscissors verwijden.
Een anatomische dissectie van de slagader is een ander belangrijk. Rond de arteriële adventitia er een dun vlak waarbinnen de dissectie gemakkelijk en soepel kunnen worden uitgevoerd. Vind het vliegtuig eerst, dan verder met de dissectie. Probeer ook ontleden de aangrenzende ader alleen op de plaats van hechting loops ader schade, die de belangrijkste oorzaak van bloedingen bij deze procedure te vermijden. Hoewel in de oorspronkelijke methode van de slagader en ader samen een lus, 4 vinden we dat looping slagader geeft alleen een betere controle voor zowel hemostase en draad inbrengen.
Draad inbrengen is het moeilijkste deel van deze procedure. Een 0.015-inch draad is ongeveer drie keer dikker dan de DFA, de toegang slagader. De belangrijkste technieken die hierzijn: het verwijden van de DFA zelf voordat arteriotomie; het maken van een kleine entree gat dat geleidelijk wordt verwijd met micropincet tips; en het vermijden van krachtige draad inbrengen - die technieken worden beschreven in de sectie protocol. Terwijl in de oorspronkelijke methode lidocaïne wordt toegepast op de slagader voor draad inbrengen 4 verwijden, vinden we het overbodig.
Neointima formatie na femoralis draad schade vordert tijd, pieken bij 3-4 weken na verwonding, en blijft stabiel op 8 weken. 4,8 De auteurs meestal wacht 4 weken gebaseerd op onze voorlopige gegevens die de hoeveelheid van neointima op 3 weken het algemeen kleiner dan het bedrag 4 weken na draads schade (gegevens niet getoond).
Interessant is dat de reacties op arteriële verwonding verschillen tussen verschillende muizenstammen. Volgens verschillende rapporten onderzoeken verschillen tussen muizenstammen na femorale of halsslagaderverwonding, FVB / N-muizen tonen de hoogste amount van neointimavorming, gevolgd door 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / C, en C57BL / 6, resp. 4,9,10 Deze kenmerken moeten worden overwogen bij het opstellen van een experimenteel plan. De femorale letsel model kan ook worden gebruikt voor onderzoek ontstekingsreactie na vasculaire verwonding. Infiltratie van ontstekingscellen werd gemeld om een aanzienlijke verhoging van drie dagen na het letsel. 11
Concluderend, de draad traumamodel middels muis femorale arteriën is bijzonder geschikt voor post-angioplastiek restenose te onderzoeken, en het proces kan worden uitgevoerd veilig en gemakkelijk met de hier gepresenteerde methode. De hele procedure kan worden afgewerkt binnen 20 minuten nadat de technieken volledig vertrouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
