Summary
Musen femoralisartären trådmodell skada av restenos är tekniskt utmanande. I detta protokoll visar vi de viktigaste tekniska detaljer avgörande för framgångsrikt utföra trådskada att framkalla konsekvent neointima för studier av restenos.
Abstract
Hjärt-kärlsjukdom orsakad av åderförkalkning är den vanligaste dödsorsaken i västvärlden. Förträngning av kärllumen, på grund av aterosklerotisk plackutveckling eller det upplösande av etablerade plack, avbryter normala blodflödet som leder till olika följdsjukdomar såsom hjärtinfarkt och stroke. I kliniken endovaskulära procedurer såsom angioplastik vanligen utförs för att återuppta lumen. Emellertid dessa behandlingar oundvikligen skadar kärlväggen liksom det vaskulära endotelet, utlöser en överdriven läkningssvar och utveckling av en neointimal plack som sträcker sig in i lumen orsakar kärl restenos (åter-förträngning). Restenos fortfarande en viktig orsak till misslyckande endovaskulära behandlingar för åderförkalkning. Således prekliniska djurmodeller för restenos är oerhört viktigt för att undersöka de patofysiologiska mekanismer samt translationell förhållningssätt till kärlinterventioner. Bland flera murina experimejömässig modeller, är lårbensartären trådskada allmänt accepterad som den mest lämpliga för studier av post-angioplastik restenos, eftersom det är mycket lik den angioplastik förfarande som skadar både endotel och kärlväggen. Men många forskare har svårt att utnyttja denna modell på grund av dess höga grad av tekniska svårigheter. Detta beror främst på en metalltråd måste sättas in i lårbensartären, vilket är ungefär tre gånger tunnare än tråd, för att generera tillräckligt med skada för att inducera framträdande neointima. Här beskriver vi de viktigaste kirurgiska detaljerna för att effektivt lösa de stora tekniska svårigheter av denna modell. Genom att följa de presenterade procedurer, utför blir musen lårbensartären trådskada lättare. När familiarized, kan hela förfarandet kan slutföras inom 20 minuter.
Protocol
OBS: Etik Uttalande: Alla förfaranden överensstämmer med Guide för skötsel och användning av försöksdjur (National Academies Press, 8: e upplagan, 2011), samt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Wisconsin. Alla operationer utfördes under isoflurananestesi (genom inandning, flödeshastighet 2 ml / min), och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet. Djuren avlivades i en kammare successivt fylls med CO 2.
1. Induktion av narkos och hudsnitt
- Använd hane C57BL / 6 möss med en ålder av 12-16 veckor och vikt på 23-28 g. Bedöva djuret genom isofluran genom en sluten krets narkosapparat. Bekräfta korrekt anesthetization genom att nypa sin tå. Applicera lite konstgjorda tårar salva på ögonen för att förhindra torrhet.
- Placera musen i ryggläge med vänster bakben något bort och knäleden slightly böjs. Raka håret runt det vänstra regionen övre låret och desinficera huden med Klorhexidin ansökte tre gånger med steril bomull tippas applikatorer. Använd en varm pärla autoklav för att hålla instrumenten steriliserats under operationen.
- Placera en steriliserad gasbinda drapera över vänster ben. Gör en 1,5 cm rak, längsgående snitt i huden på den vänstra mediala låret från knäleden till ljumsken (Figur 1A).
2. Exponering av lårbensartären och grenar
OBS: Figur 1B visar bruttokärlanatomi i övre delen av låret. Den ytliga lårbensartären (SFA) kan iakttas genom ett dissektionsmikroskop när hudsnittet är korrekt gjord längs mittlinjen av den mediala låret.
- Öppna upp den tunna fascia ligger över SFA med fina pincett och sedan slinga SFA med 9-0 nylonsutur.
OBS: I denna process, lårbens nerven lätt lägga såide, men den intilliggande lårbensvenen kräver uppmärksamhet eftersom dess vägg är så tunn att den lätt perforerar och blöder. Nyckeln teknik är att fokusera på artären själva; så länge som dissektion utförs nära till artären, är oavsiktlig skada ven påverkbara. - När SFA loopas, håll suturen med mygga pincett och dra den något nedåt. Denna manöver gör ytterligare dissektion lättare, men för att undvika skador på artären inte dra alltför hårt.
- Fortsätt dissekera artären proximalt att exponera och sling den gemensamma lårbensartären (CFA) med 9-0 nylonsutur.
OBS: Vanligtvis looping CFA vid en punkt distalt epigastrisk artär (Figur 1B) är tillräckligt för tråd insättning. Håll CFA suturslinga med mygga pincett på samma sätt. - Dra CFA suturslinga uppåt och SFA suturslinga nedåt för att avslöja bifurkationen av SFA och djupa lårbensartären (DFA). DFA, den största grenen av CFA,går mot lårmuskeln (Figur 1B).
OBS: Tråden infogas från DFA senare. - Loop DFA extra försiktighet eftersom den intilliggande venen trassligt under artären. Vid blödning från venen, är vanligen tillräcklig för att producera hemostas 30 till 60 sek enkel komprimering med gasbinda.
- När DFA loopas med 9-0 nylonsutur, se till att alla tre sutur slingor är på sina rätta positioner (Figur 2A).
- Fortsätt med dissektion av DFA distalt för att ligera artären vid en punkt så långt som möjligt från bifurkationen. Skär extra sutur men lämna en viss längd så att de två ändarna kan hållas med mygga pincett, som stabiliserar DFA gör trådinför lättare.
3. Skapa Wire Skada
- Sätt Wire via DFA
- Sila av CFA, SFA, och DFA suturer för att upprätta en tillfällig hemostat.
- Gör ett litet hål i DFA med microscissors. Sätt spetsarna av de krökta microtweezers dilateras hålet stort nog för en tråd med en 0,015 tums diameter (Figur 2B demonstrerar skillnaden i storlek mellan artären och tråden).
- Innan du gör ett hål i DFA, lossa CFA suturslinga och försiktigt klämma / pressa DFA flera gånger med slöa spets microtweezers. Denna manöver expanderar artärdiameter anmärkningsvärt att lindra trådinför. Fukta tråden noggrant med PBS är också viktigt för en smidig införing.
- När du gör ett hål i DFA, inte beskära artärväggen, men gör en liten v-formad nyp och nyp luckan med vassa spets microtweezers för manipulation.
- För in tråden genom adekvat-vidgade hål på DFA. Försiktigt föra tråden mot höftartären samtidigt lossa suturslinga runt CFA. 5-8 mm är tillräckligt för att täcka alla CFA längd i de flesta fall (figur 2C
- Lämna Tråd insidan för 1 Min
- Efter insättning av kabeln till den optimala längden, lämna det för 1 minut att överanstränga artärväggen. Fukta tråd och artärer med PBS för att förhindra torkning. En annan 9-0 nylonsutur kan placeras runt DFA proximalt till trådinsättningspunkten under denna väntetid. Denna sutur kommer att användas senare för att stänga hålet på DFA efter avlägsnande av tråden.
- Hämta Wire och Resume blodflödet
- Håll tråden med kärlkanyle pincett och dra den tillbaka försiktigt; tråden ska hämtas smidigt. För att övervinna något motstånd, vanligen orsakade av vidhäftning av kabeln till artärväggen, dra tillbaka tråden med varsam rotation är hjälpsam. Återigen kan en kraftfull manöver resultera i djurförlust.
- ENfter hämta tråden, ligera DFA vid punkten för bifurkation med 9-0 nylonsutur. Inte ligate för nära bifurkation, vilket skulle äventyra blodutflödet till SFA.
- Lossa SFA och CFA sutur slingor för att återuppta den normala blodflödet. Observera att CFA är väl expand genom tråd insättning (Figur 2D).
4. Hud Stängning och postoperativ vård
- Kontroll blöder. Mindre sipprar kan stoppas genom enkel komprimering; några stora arteriella blödningar kräver stygn med 11-0 nylonsutur. Dessa suture artärer kommer så småningom att leda till arteriell ocklusion.
- Stäng huden sår med hud häftapparater (vanligen 3-4 häftklamrar). Håll sårområdet steriliseras genom att tillämpa Klorhexidin kirurgisk lösning.
- Applicera postkirurgiska behandlingar. Styr smärtan av musen med subkutana injektioner av buprenorfin. Håll musen på uppvärmningen pad tills den har återfått SUFlig medvetandet att upprätthålla sternala VILA. Hus den i en ren bur utan sällskap av andra djur tills återhämtat sig helt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fyra veckor efter operation, skörda tråd skadade lårbensartären och göra en paraffin blockera exemplar att analysera neointimabildning. Inducera narkos såsom beskrivet ovan. Öppna kistan direkt och sätter en 20-gauge fjärilsnål till den vänstra ventrikeln. Anslut linjen till en infusionsflaska. Utför perfusion fixering via dropp infusion av PBS följt av 4% paraformaldehyd (vanligen 10-20 ml vardera). Infusionsflaskan är placerad cirka 140 cm högre än hjärtat nivå så att djuret perfusion vid fysiologiskt pressure.Wait 20 min sedan ta ut tråd skadade CFA och fixa det i 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C. Gör en paraffinblock de prov med standard histologiska tekniker och förbereda tvärsnitt av 5-um tjocklek för histologisk färgning.
Hematoxylin-eosin färgning tillåter tydlig visualisering av neointimabildning inuti tråd skadade femoral artär (Figur 3A, tråd skadade lårbensartären, 3B, oskadade lårbensartären) .Använd en riktig programvara för att mäta lumen området (LA), den interna elastiska lamina (IEL) område, och den externa elastisk lamina (EEL) område från tvärsektion (fig 3C). Beräkna intiman området genom att subtrahera lumenarea från IEL område; beräkna medieområdet genom att subtrahera IEL området från EEL området. Intima area / media areaförhållandet används för att jämföra neointima formationer mellan olika experimentella grupper.
Figur 1: schematiska illustrationer av hudsnitt och kärl anatomi. (A) En lämplig hudsnitt är ca 1,5 cm i längd, längs mittlinjen av mediala övre låret. (B) Hitta den ytliga lårbensartären först, den gemensamma lårbensartären nästa, och slutligendjupa lårbensartären. Dissekera varje artär försiktigt utan att skada intilliggande venen.
Figur 2: Wire Injury ordningen. (A) Den gemensamma lårbensartären (pil), den ytliga lårbensartären (streckad pil), och den djupa lårbensartären (pilspets) exponeras och loopas med suturer. (B) Notera skillnaden i storlek mellan artärerna och 0,015 tum tråd. (C) Tråden infogas via djupa lårbensartären. Håll tråden inne i 1 min för att få artärväggen belastade. (D) Blodflödet återupptas. Den gemensamma femoralisartären väl utvidgas efter trådskada (pil). Bar indikerar 1 mm.
Figur3: Hematoxylin-eosin färgning av tråd skadade och oskadade lårbensartärerna. (A) Ett tvärsnitt av en tråd-skadade lårbensartären avslöjar en tjock, mycket cellulära neointima plack. (B) Ett tvärsnitt av en oskadad lårbensartären visar intakta arteriell väggkonstruktioner utan neointimabildning. (C) Den gröna linje skisserar lumen område, den gula linjen delineates intern elastisk lamina, och den blå linjen delineates extern elastisk lamina. Bar indikerar 100 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proceduren trådskada är tillämplig på alla stammar av möss så länge deras anatomiska strukturer är liknande. 4 I denna uppsats har vi använt manligt C57BL / 6 möss med en ålder av 12-16 veckor. Som vi har lärt oss av våra förstudier, lårbens artärerna hos möss yngre än 10 veckor är ofta så små att trådinför är ganska utmanande. Å andra sidan, är tråd insättning hos möss äldre än 16 veckor är tekniskt enklare men tenderar att resultera i mer varierande neointimal hyperplasi. Honmöss brukar ådra mindre neointimalbildning än män. Även om förfarandet trådskada kan utföras på endera sidan av de femorala artärerna, föredrar vi den vänstra sidan på grund av den anatomiska tillgängligheten för högerhänta operatörer.
Bland alla modeller musen för restenos efter angioplastik, arteriell tråd skada efterliknar mestadels tätt angioplastik av endotel denudation och kärlväggen overstreching. 2,5,6 Därär två viktiga målgrupper artärer för trådskada: lårbens artärer och halspulsåder. Ur teknisk synvinkel är trådinför lättare för halspulsåder eftersom de är bredare än lårbensartärerna. Dock tenderar neointimabildning att vara mindre robust i halspulsåder än i lårbens artärer, sannolikt på grund av mindre effektiva denudation. Vissa författare använder en handgjord anordning för att skapa en mer aggressiv endotel denudation i halspulsådrorna. 7 Å andra sidan, är fördelen med lårbensartären trådskada modell som den kan utföras med homogent tillverkade, kommersiellt tillgängliga trådar att inducera neointimal hyperplasi i ett reproducerbart sätt.
För att göra en lyckad tråd skada i mus lårbens artärer, är nyckeln till att arbeta under ett dissekera mikroskop med tillräcklig förstoring och använda fina instrument - microtweezers och microscissors i synnerhet. Microtweezers med vassa spetsar är användbara för dissect ut vävnaderna som omger artären, medan de med trubbiga spetsar är användbara för att placera en suturslinga runt artären och att dilatera trådingångshålet gjord av en skarp arteriotomi med microscissors.
En anatomisk dissektion av artären är en annan tangent. Runt arteriella adventitia existerar ett tunt planet där dissektion kan utföras enkelt och smidigt. Hitta planet först, sedan vidare med dissektion. Försök också att dissekera ut intilliggande venen endast på platsen för sutur slingor att undvika ven skador, vilket är den största orsaken till blödning i detta förfarande. Även i den ursprungliga metoden artären och venen är loopas tillsammans, 4 finner vi att looping artär ger bara bättre kontroll för både hemostas och trådinför.
Wire insättning är den svåraste delen av denna procedur. En 0,015-tums tråd är ungefär tre gånger tjockare än DFA, accessartären. Nyckel tekniker härär: dilating DFA själv innan arteriotomi; gör ett litet ingångshål som gradvis utvidgas med microtweezer tips; och undvika kraftig tråd insättning - dessa tekniker beskrivs i protokollet avsnittet. Medan i den ursprungliga metoden lidokain appliceras dilatera artären före trådinför 4, finner vi det onödigt.
Neointimabildning efter femoralartären trådskada fortskrider med tiden, toppar vid 3-4 veckor efter skada, och förblir stabil vid 8 veckor. 4,8 Författarna vanligtvis vänta 4 veckor baserat på våra preliminära data att mängden av neointima vid 3 veckor är i allmänhet mindre än det belopp på 4 veckor efter trådskada (data visas ej).
Intressant svaren på arteriell skada skiljer sig mellan olika musstammar. Enligt flera rapporter som undersöker skillnader mellan musstammar efter lårbens eller halspulsådern skada, FVB / N-möss visar den högsta amount av neointimabildning, följt av 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / C, och C57BL / 6, respektive. 4,9,10 Dessa egenskaper bör beaktas när du skriver en experimentell plan. Lårbens skada modellen kan också användas för utredning av inflammatoriska förändringar efter kärlskada. Inflammatorisk cellinfiltration rapporterades öka kraftigt tre dagar efter skada. 11
Sammanfattningsvis är trådskada modell med mus lårbensartärerna särskilt lämpliga för att undersöka efter angioplastik restenos, och processen kan utföras på ett säkert och enkelt med hjälp av metoden som presenteras här. Hela proceduren kan vara klar inom 20 minuter när teknikerna är helt bekantat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
