Summary
El modelo de lesión de alambre arteria femoral de ratón de la reestenosis es técnicamente difícil. En este protocolo se muestran los detalles técnicos clave esencial para llevar a cabo con éxito la lesión de alambre para inducir neointima consistente para estudios de reestenosis.
Abstract
La enfermedad cardiovascular causada por la aterosclerosis es la causa principal de muerte en el mundo desarrollado. El estrechamiento de la luz del vaso, debido al desarrollo de la placa aterosclerótica o la ruptura de placas establecidos, interrumpe el flujo normal de la sangre que conduce a diversas morbilidades, tales como infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. En los procedimientos endovasculares clínicas como la angioplastia se realizan comúnmente para reabrir el lumen. Sin embargo, estos tratamientos dañan inevitablemente la pared del vaso, así como el endotelio vascular, la activación de una respuesta de cicatrización excesiva y el desarrollo de una placa neointimal que se extiende en el lumen del vaso que causan la reestenosis (re-estrechamiento). La restenosis sigue siendo una causa importante de fracaso de los tratamientos endovasculares para la aterosclerosis. Por lo tanto, los modelos animales preclínicos de reestenosis son de vital importancia para la investigación de los mecanismos fisiopatológicos, así como de la traducción se acerca a las intervenciones vasculares. Entre varios EXPERIME murinomodelos NTAL, lesiones alambre arteria femoral es ampliamente aceptado como el más adecuado para estudios de reestenosis post-angioplastia porque se parece mucho al procedimiento de angioplastia que daña tanto el endotelio y la pared del vaso. Sin embargo, muchos investigadores tienen dificultades para la utilización de este modelo debido a su alto grado de dificultad técnica. Esto es principalmente porque un alambre de metal tiene que ser insertado en la arteria femoral, que es aproximadamente tres veces más delgado que el alambre, para generar suficiente para inducir la lesión neoíntima prominente. A continuación, describimos los detalles quirúrgicos esenciales para superar de manera efectiva las principales dificultades técnicas de este modelo. Siguiendo los procedimientos presentados, la realización de la lesión de alambre de la arteria femoral del ratón se vuelve más fácil. Una vez familiarizado, todo el procedimiento puede ser completado dentro de 20 min.
Protocol
Declaración de Ética: NOTA: Todos los procedimientos se ajustan a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academies Press, 8ª edición, 2011), y los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Wisconsin. Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia con isoflurano (a través de la inhalación, caudal de 2 ml / min), y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los animales fueron sacrificados en una cámara llena gradualmente con CO 2.
1. La inducción de la anestesia general y la incisión de la piel
- Utilice macho C57BL / 6 ratones con una edad de 12-16 semanas y el peso de 23-28 g. Anestesiar al animal mediante isoflurano a través de un aparato de anestesia de circuito cerrado. Confirmar anestesia adecuada apretando su dedo del pie. Aplique un poco de ungüento de lágrimas artificiales en los ojos para evitar la sequedad.
- Coloque el ratón en una posición supina con la extremidad posterior izquierda ligeramente secuestrado y la articulación de la rodilla slightly flexionada. Afeitarse el pelo alrededor de la región superior del muslo izquierdo y desinfectar la piel con clorhexidina, aplicado tres veces con algodón estéril aplicadores con punta. Utilice un esterilizador de cuentas caliente para mantener los instrumentos esterilizados durante la cirugía.
- Coloque un paño de gasa esterilizada sobre la pierna izquierda. Hacer una incisión longitudinal en la piel 1,5 cm recta en el muslo medial izquierdo de la articulación de la rodilla hasta la ingle (Figura 1A).
2. La exposición de la arteria femoral y Ramas
NOTA: La Figura 1B muestra la anatomía vascular grave en la parte superior del muslo. La arteria femoral superficial (SFA) se puede observar a través de un microscopio de disección cuando la incisión de la piel se hace adecuadamente a lo largo de la línea media del muslo medial.
- Abre la fascia delgada que recubre el SFA con finas pinzas y luego bucle del SFA con 9-0 sutura de nylon.
NOTA: En este proceso, el nervio femoral es fácil de poner comoide, pero la vena femoral adyacente requiere mucha atención, porque su pared es tan delgada que perfora y sangra fácilmente. La técnica clave es centrarse en la propia arteria; siempre que la disección se lleva a cabo cerca de la arteria, cualquier daño accidental vena es evitable. - Una vez que la SFA se enlaza, mantenga la sutura con una pinza de mosquito y tire de él ligeramente hacia abajo. Esta maniobra hace más disección más fácil, pero para evitar daños en la arteria no tire con demasiada fuerza.
- Continuar la disección de la arteria proximal para exponer y bucle de la arteria femoral común (CFA) con 9-0 sutura de nylon.
NOTA: Por lo general, rizando el Comité de Libertad Sindical en un punto distal a la arteria epigástrica (Figura 1B) es suficiente para la inserción de cables. Mantenga el lazo de sutura CFA con pinzas de mosquitos de la misma manera. - Tire del lazo de sutura CFA hacia arriba y el lazo de sutura SFA hacia abajo para destapar la bifurcación de SFA y la arteria femoral profunda (DFA). La DFA, la rama principal del Comité de Libertad Sindical,va hacia el músculo del muslo (Figura 1B).
NOTA: El cable se inserta desde la DFA después. - Pase el DFA con mucha precaución debido a que la vena adyacente está enredado por debajo de la arteria. En caso de sangrado de la vena, un 30 a 60 seg compresión simple con una gasa es generalmente suficiente para producir hemostasis.
- Una vez que el DFA se enlaza con 9-0 sutura de nylon, asegúrese de que los tres bucles de sutura están en sus posiciones correctas (Figura 2A).
- Proceder con la disección de la DFA distalmente para ligar la arteria en un punto lo más lejos posible de la bifurcación. Cortar sutura extra, pero dejar una cierta longitud de manera que los dos extremos se pueden celebrar con pinzas de mosquito, que estabilizan la DFA hacer la inserción de cables más fácil.
3. Creación de Lesión alambre
- Inserte el cable a través de DFA
- Colar las suturas CFA, SFA, y DFA para establecer una pinza hemostática temporal.
- Haz un pequeño agujero en el DFA con microtijeras. Insertar las puntas de los micropinzas curvadas para dilatar el agujero suficientemente grande para un alambre con un diámetro de 0,015 pulgadas (Figura 2B demuestra la diferencia de tamaño entre la arteria y el cable).
- Antes de hacer un agujero en la DFA, aflojar el lazo de sutura CFA y suavemente sujetar / apriete el DFA varias veces con micropinzas-opacos punta. Esta maniobra se amplía el diámetro arterial notablemente para facilitar la inserción de cables. Humedecer el alambre a fondo con PBS también es importante para una inserción suave.
- Al hacer un agujero en la DFA, no recortar la pared arterial, pero hacer un pequeño pellizco en forma de V y pellizcar la solapa con micropinzas de punta afilada para la manipulación.
- Inserte el cable por el agujero adecuadamente dilatado en la DFA. Avanzar suavemente el alambre hacia la arteria ilíaca mientras afloja el lazo de sutura alrededor del CFA. 5-8 mm es suficiente para cubrir toda la longitud CFA en la mayoría de los casos (Figura 2C
- Deja alambre dentro de 1 Min
- Después de insertar el cable a la longitud óptima, se deja durante 1 min a estirar demasiado la pared arterial. Humedezca el alambre y las arterias con PBS para evitar que se seque. Otra sutura de nylon 9-0 se puede colocar alrededor de la DFA proximal al punto de inserción de alambre durante este tiempo de espera. Esta sutura se utilizará más adelante para cerrar el orificio de la DFA después de la extracción del alambre.
- Recuperar alambre y reanudar el flujo sanguíneo
- Sujete el cable con pinzas de canulación del vaso, y tirar de ella con suavidad; el cable debe ser recuperada sin problemas. Para superar cualquier resistencia, causada generalmente por la adhesión del alambre a la pared arterial, retroceso del cable con rotación suave es útil. Una vez más, una maniobra contundente podría resultar en la pérdida de los animales.
- Laespués de recuperar el cable, ligar la DFA en el punto de bifurcación con sutura de nylon 9-0. No ligar demasiado cerca de la bifurcación, que pondría en peligro el flujo de salida de sangre a la SFA.
- Aflojar los lazos de sutura SFA y CFA para reanudar el flujo de sangre normal. Tenga en cuenta que el Comité de Libertad Sindical es bien expandimos la inserción del cable (Figura 2D).
4. Cierre de la piel y Cuidado Postoperatorio
- Sangra de control. Exudación Minor puede ser detenida por compresión simple; algunos importantes hemorragias arteriales requieren puntos de sutura con una sutura de nylon 11-0. Estas arterias suturadas eventualmente resultarán en la oclusión arterial.
- Cierre de la piel de la herida con grapadoras de piel (generalmente 3-4 grapas). Mantenga el área de la herida esterilizado mediante la aplicación de solución quirúrgica clorhexidina.
- Aplicar tratamientos post-quirúrgicos. Controlar el dolor del ratón con inyecciones subcutáneas de buprenorfina. Mantenga el ratón en la plataforma de calentamiento hasta que se haya recuperado sufciente conciencia de mantener decúbito esternal. Casa en una jaula limpia y sin compañía de otros animales hasta que se recuperó totalmente.
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Representative Results
Cuatro semanas después de la cirugía, la cosecha de la arteria femoral alambre heridos y hacen muestra de bloque una parafina para analizar la formación de la neoíntima. Inducir la anestesia general como se describió anteriormente. Abra el pecho inmediatamente e inserte una mariposa aguja de calibre 20 al ventrículo izquierdo. Conecte la línea de una botella de infusión. Realizar fijación por perfusión a través de infusión por goteo de PBS seguido de paraformaldehído al 4% (por lo general 10 a 20 ml, cada uno). La botella de infusión que se coloca alrededor de 140 cm por encima del nivel del corazón para que el animal se perfunde en pressure.Wait fisiológica durante 20 minutos y luego sacar la CFA alambre heridos y fijarlo en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C. Hacer un bloque de parafina de la muestra utilizando técnicas histológicas estándar y preparar las secciones transversales de espesor de 5 micras para la tinción histológica.
Tinción hematoxilina-eosina permitirá una visualización clara de la formación de neoíntima en el interior del f alambre heridosarteria emoral (Figura 3A, la arteria femoral de alambre lesionado; 3B, la arteria femoral no lesionado) .El uso de un software adecuado para medir el área de la luz (LA), el área de la lámina elástica interna (IEL), y el área de lámina elástica externa (EEL) de sección transversal (Figura 3C). Calcular el área de la íntima restando área de la luz de la zona de IEL; calcular el área de medios restando área IEL del área EEL. Relación de área / zona íntima-media se utiliza para comparar las formaciones neoíntima entre los diferentes grupos experimentales.
Figura 1: Las ilustraciones esquemáticas de la piel de la incisión y la vasculatura anatomía. (A) una incisión de piel adecuado es de aproximadamente 1,5 cm de longitud, a lo largo de la línea media de la parte superior del muslo medial. (B) Encuentre la arteria femoral superficial en primer lugar, la arteria femoral común siguiente, y por último, laarteria femoral profunda. Diseccionar cada arteria cuidadosamente sin dañar la vena adyacente.
Figura 2: Procedimiento de Lesiones Wire. (A) La arteria femoral común (flecha), la arteria femoral superficial (flecha de puntos), y el profundo arteria femoral (cabeza de flecha) están expuestos y en bucle con suturas. (B) Nota la diferencia de tamaño entre las arterias y el 0,015 pulgadas alambre. (C) El cable se inserta a través de la arteria femoral profunda. Mantenga el cable en el interior durante 1 min para tener la pared arterial sobrecargado. (D) El flujo de sangre se reanuda. La arteria femoral común es bien expandidas después de la lesión de alambre (flecha). Bar indica 1 mm.
Figura3: La tinción de hematoxilina-eosina de las arterias femorales alambre lesionados y no lesionados. (A) Una sección transversal de una arteria femoral de alambre heridos revela una gruesa, la placa neoíntima altamente celular. (B) Una sección transversal de una arteria femoral ileso demuestra estructuras de la pared arterial intactas sin la formación de neoíntima. (C) El verde línea delimita área de la luz, la línea amarilla delinea lámina elástica interna, y la línea azul delinea lámina elástica externa. Bar indica 100 micras.
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Discussion
El procedimiento lesión alambre es aplicable a todas las cepas de ratones, siempre y cuando sus estructuras anatómicas son similares. 4 En este trabajo, hemos utilizado macho C57BL / 6 ratones con una edad de 12 a 16 semanas. Como hemos aprendido de nuestros estudios preliminares, las arterias femorales de ratones más jóvenes de 10 semanas son a menudo tan pequeña que la inserción del alambre es todo un reto. Por otro lado, la inserción del alambre en ratones de más de 16 semanas es técnicamente más fácil, pero tiende a resultar en más hiperplasia neointimal variable. Los ratones hembra tienden a incurrir en una menor formación neointimal que los machos. Aunque el procedimiento de lesión de alambre se puede realizar en cualquiera de los lados de las arterias femorales, preferimos el lado izquierdo debido a la accesibilidad anatómica para los operadores diestros.
Entre todos los modelos de ratón de la reestenosis post-angioplastia, lesiones alambre arterial imita principalmente estrechamente angioplastia por denudación endotelial y la pared del vaso overstreching. 2,5,6 Noson dos importantes arterias de destino para la lesión de alambre: arterias femorales y las arterias carótidas. Desde un punto de vista técnico, la inserción de cables es más fácil para las arterias carótidas, ya que son más anchas que las arterias femorales. Sin embargo, la formación de neoíntima tiende a ser menos robusta en las arterias carótidas que en arterias femorales, probablemente debido a la denudación menos eficaz. Algunos autores utilizan un dispositivo de mano para crear un denudación endotelial más agresivo en las arterias carótidas. 7 Por otra parte, la ventaja de el modelo de lesión de alambre de la arteria femoral es que se puede realizar con manufacturados homogéneamente, cables disponibles comercialmente para inducir hiperplasia neointimal en de manera reproducible.
Para hacer que una lesión alambre éxito en las arterias femorales de ratón, la clave es operar bajo un microscopio de disección con suficiente magnificación y utilizar instrumentos finos - micropinzas y microtijeras en particular. Micropinzas con puntas afiladas son útiles para disecciónt los tejidos que rodean la arteria mientras que los que tienen puntas romas son útiles para colocar un lazo de sutura alrededor de la arteria y para dilatar el orificio de entrada del cable hecha por un fuerte arteriotomía con micro tijeras.
Una disección anatómica de la arteria es otra clave. Alrededor de la adventicia arterial existe un plano delgado donde la disección puede llevarse a cabo fácilmente y sin problemas. Encuentra el avión primero, y luego proceder a la disección. Además, trate de diseccionar la vena adyacente sólo en el sitio de lazos de sutura para evitar daño a la vena, que es la principal causa de la hemorragia en este procedimiento. Aunque en el método original de la arteria y la vena se enlazan entre sí, 4 nos encontramos con que la arteria bucle sólo da un mejor control tanto para la hemostasia y la inserción de cables.
Inserción del cable es la parte más difícil de este procedimiento. Un alambre de 0,015 pulgadas es aproximadamente tres veces más gruesa que la DFA, la arteria de acceso. Las técnicas claves aquíson: la dilatación de la propia DFA antes de arteriotomía; haciendo un pequeño orificio de entrada que se dilata gradualmente con puntas microtweezer; y evitar la inserción de cables contundente - esas técnicas se detallan en la sección de protocolo. Mientras que en el método original de lidocaína se aplica para dilatar la arteria antes de la inserción de alambre 4, nos resulta innecesario.
La formación de neoíntima después de una lesión de alambre de la arteria femoral progresa con el tiempo, los picos en 3-4 semanas después de la lesión, y se mantiene estable a las 8 semanas. 4,8 Los autores suelen esperar durante 4 semanas basado en nuestros datos preliminares que la cantidad de neoíntima a las 3 semanas es generalmente inferior a la cantidad a las 4 semanas después de la lesión de alambre (datos no mostrados).
Curiosamente, las respuestas a la lesión arterial difieren entre las distintas cepas de ratón. De acuerdo con varios informes que investigan las diferencias entre las cepas de ratón después femoral o lesión de la arteria carótida, los ratones FVB / N muestran el más alto amount de formación de neoíntima, seguido de 129 / SvJ, C3H / HeJ, BALB / C, y C57BL / 6, respectivamente. 4,9,10 Estas características deben ser considerados al redactar un plan experimental. El modelo de lesión femoral también puede utilizarse para la investigación de cambios inflamatorios después de la lesión vascular. Infiltración de células inflamatorias se informó a aumentar significativamente tres días después de la lesión. 11
En conclusión, el modelo de lesión de alambre usando arterias femorales de ratón es particularmente adecuado para investigar la restenosis post-angioplastia, y el proceso puede realizarse con seguridad y fácilmente usando el método presentado aquí. Todo el procedimiento se puede acabar dentro de 20 min una vez que las técnicas están completamente familiarizados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
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