Summary
再狭窄的鼠标股动脉线损伤模型在技术上具有挑战性。在这个协议中，我们展示的关键技术细节必不可少的成功执行丝损伤诱导一致内膜再狭窄的研究。
Abstract
引起的动脉粥样硬化的心血管疾病是死亡的在发达国家的首要原因。变窄的血管腔，由于动脉粥样硬化斑块的发展或建立斑块的破裂，中断正常的血流导致各种并发症，如心肌梗塞和中风。在门诊血管内手术，如血管成形术通常进行重新管腔。然而，这些治疗方法不可避免地破坏血管壁以及血管内皮，触发过度愈合反应和新内膜斑块伸入引起血管再狭窄（再狭窄）的内腔的发展。再狭窄仍然是动脉粥样硬化的血管内治疗失败的主要原因。因此，再狭窄的临床前动物模型是用于研究的病理生理机制，以及平移接近血管介入至关重要。在几种鼠experimental模型，股动脉导线损伤被广泛接受作为用于血管成形术后再狭窄的研究最合适的，因为它非常类似于该损伤都内皮和血管壁的血管成形术。然而，许多研究人员利用该模型困难，由于其高的技术难度程度。这主要是因为金属线需要被插入到股动脉，这大约比丝更薄三次，以产生足够的损伤诱导突出的新内膜。在这里，我们描述了必要的手术细节，有效地克服了这一模式的主要技术难点。按照所提出的程序，在执行鼠标股动脉导线损伤变得更容易。一旦熟悉，整个过程可以在20分钟内完成。
Protocol
注：伦理学声明：所有的程序符合在威斯康星大学批准的机构动物护理和使用委员会指南实验动物的护理和使用（美国国家科学院出版社，第8版，2011），和协议。异氟烷麻醉下进行的手术都（通过吸入，流速为2ml /分钟），并作出一切努力，尽量减少痛苦。动物安乐死在室逐渐充满CO 2。
1.全身麻醉诱导和皮肤切口的
- 使用雄性C57BL / 6小鼠的12-16周的年龄23-28克和重量。通过闭路麻醉设备麻醉动物通过异氟烷。按捏脚趾其确认正确的麻醉。取适量涂抹于眼睛有些人工泪液软膏，以防止干燥。
- 鼠标放置在与左后肢略微绑架和膝关节SL仰卧位置ightly弯曲。剃周围的左大腿区域的头发，用消毒的洗必泰皮肤，用消毒棉签应用于三次。使用热珠灭菌，以保持手术过程中消毒的器械。
- 放置消毒纱布覆盖在左腿。使一个1.5厘米直的，纵向切开皮肤的左大腿内侧从膝关节到腹股沟（ 图1A）。
2.暴露股动脉和分支机构
注： 图1B显示了大腿毛血管解剖。股浅动脉（SFA）可通过解剖显微镜来观察时，皮肤切口正确沿着大腿内侧的中线进行。
- 开拓薄筋膜覆SFA用细镊子，然后循环SFA用9-0尼龙线。
注意：在这个过程中，股神经被很容易地把作为IDE，但相邻的股静脉需要密切注意，因为它的壁很薄以致很容易穿孔和出血。关键技术是着眼于动脉本身;只要解剖进行靠近动脉，任何意外静脉损伤是可以避免的。 - 一旦SFA的循环，将与蚊子钳缝合，将其略微向下。这个动作做进一步解剖容易，但要避免损伤动脉不要拉得用力。
- 继续解剖动脉近端揭露和循环股总动脉（CFA）用9-0尼龙线。
注意：通常情况下，循环的CFA的点处远端胃脘动脉（ 图1B）是足够的电线插入。持有CFA缝线环与以同样的方式蚊子钳。 - 向上拉CFA缝合环和SFA缝线环向下发掘SFA和股深动脉（DFA）的分叉。在DFA，终审法院的主要分支，随着朝向所述大腿肌肉（ 图1B）。
注：该线将从DFA后插入。 - 河套DFA额外小心，因为邻近的静脉纠结动脉下方。在情况下，从静脉出血，一个30到60秒的简单的压缩用纱布通常足以产生止血效果。
- 一旦DFA是循环用9-0尼龙线，确保所有三个缝合循环是在正确的位置（ 图2A）。
- 与DFA的解剖继续向远侧结扎动脉处的点尽可能从分叉。切额外缝合，但留下一定长度，使得两个端部可以保持与蚊子钳子，其中稳定的DFA使电线插入更容易。
3.创建导线损伤
- 通过DFA插入线
- 应变CFA，SFA和DFA缝线建立一个临时止血。
- 做一个小口子DFA和microscissors。插入所述弯曲microtweezers的提示，以扩张所述孔为一个导线与0.015英寸直径足够大（ 图2B展示了动脉和导线之间的尺寸差）。
- 在作出一个洞，DFA，松开CFA缝合线环，轻轻夹住/挤压DFA多次沉闷尖microtweezers。这个动作扩展了动脉直径显着缓解电线插入。用PBS彻底滋润线也是顺利插入重要的。
- 当制造在DFA一个孔，不裁剪动脉壁，但使一个小V形压区和捏用尖头microtweezers操纵翼片。
- 通过对DFA的充分散瞳孔插入线。轻轻推动朝丝髂动脉，同时松开围绕终审法院的缝合线环。 5-8毫米足以覆盖所有的CFA长度在大多数情况下（ 图2C
- 离开线内1分钟
- 插入金属丝，以最优长度之后，将其放置1分钟，以过度伸张动脉壁。滋润电线动脉PBS，以防止干燥。另一个9-0尼龙缝线可以在这段等待时间被置于围绕DFA近端的线的插入点。这种缝合线将在稍后用于关闭孔的DFA以下除去线材。
- 检索电线和恢复血流量
- 握住电线与血管插管钳，它拉回来轻轻的;该线应顺利取回。为了克服任何阻力，通常由金属丝到动脉壁的粘附造成的，拉回金属丝轻轻旋转是有益的。再次，一有力的机动可能导致动物的损失。
- 一压脚提升检索线，结扎DFA在分岔用9-0尼龙缝线的点。不要结扎太靠近分叉，这将危及血液流出的SFA。
- 松开SFA和CFA缝合循环恢复正常血流。注意，CFA被很好膨胀通过电线插入（ 图2D）。
4.皮肤缝合和术后护理
- 控制出血。轻微渗血可以通过简单的压缩停止;一些主要的动脉出血需要缝合用11-0尼龙缝合。这些缝合动脉将最终导致动脉阻塞。
- 关闭创面皮肤缝合器（通常是3-4个主食）的皮肤。保持通过施加洗必泰外科溶液灭菌的卷绕区。
- 适用于手术后的治疗。控制鼠标与丁丙诺啡皮下注射的痛苦。按住鼠标上的暖垫，直到它恢复SUF够的意识，保持胸骨斜卧。这房子在一个干净的笼子里没有公司其他动物的，直到完全恢复。
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Representative Results
四周手术后，收获线伤者股动脉，使石蜡块标本分析内膜形成。如上所述诱导全身麻醉。立即打开胸腔，并插入一个20号蝴蝶针至左心室。线连接到输液瓶。 通过 PBS的滴注其次是4％多聚甲醛（通常是10〜20毫升，每次）进行灌注固定。输液瓶放置大约140厘米高于心脏水平，使得该动物被灌注在生理pressure.Wait 20分钟，然后取出线受伤CFA和它固定在4％多聚甲醛过夜，在4℃。使用标准组织学技术的试样的石蜡块，并准备了5微米厚的横截面用于组织学染色。
苏木精 - 曙红染色将使电线受伤˚F内明确的新内膜形成的可视化emoral动脉（ 图3A，线受伤股动脉; 3B，未受伤的股动脉）。用一个合适的软件来测量管腔面积（LA），所述内弹性膜（IEL）区，和外部弹性膜（EEL）面积从横截面（ 图3C）。减去IEL区管腔面积计算内膜面积;从鳗鱼面积减去IEL面积计算的媒体区。内膜面积/媒体面积比用来比较不同的实验组之间的新内膜地层。
图1：皮肤切口和血管系统解剖的示意图。 （A）的合适的皮肤切口的长度约为1.5厘米，沿内侧大腿上部的中线。（B）中查找股浅动脉第一，共用股动脉旁边，最后，将股深动脉。小心解剖每个动脉，而不会损坏相邻静脉。
图2：电线损伤过程。 （A）中的共同的股动脉（箭头），股浅动脉（虚线箭头），并且深股动脉（箭头头部）被暴露并循环用缝线。（B）中说明的动脉和0.015英寸之间的尺寸差丝。（C）的金属线是通过深股动脉插入。保持导线内1分钟以有动脉壁过度紧张。（D）的血流量被恢复。线损伤（箭头）后的股总动脉是公膨胀。条表示1毫米。
人物3：电线受伤和未受伤的股动脉苏木精 - 伊红染色。 （A）丝受伤的股动脉的横截面透着厚重，极具细胞内膜斑块。（B）的未受伤的股动脉的横截面展示了完整的动脉壁结构没有任何内膜形成。（C）绿色线描绘管腔面积，黄线描绘的内部弹性薄片和蓝色线描绘外弹性膜。律师表示100微米。
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Discussion
导线损伤程序适用于小鼠所有菌株，只要它们的解剖结构是相似的。4在本文中，我们使用雄性C57BL / 6小鼠的12-16周的年龄。正如我们从我们的初步研究中了解到，小鼠年龄小于10周的股动脉往往是如此之小，导线插入是相当具有挑战性的。另一方面，在超过16周小鼠丝插在技术上更容易，但倾向于导致更多变新内膜增生。雌性小鼠往往会产生更少的新生内膜形成较男性。虽然丝损伤过程可以在股动脉的任一侧进行，我们优选因为解剖的辅助功能右旋运营商的左侧。
其中血管成形术后再狭窄的所有小鼠模型，动脉线损伤大多是密切模仿血管成形术内皮剥脱和血管壁overstreching。2,5,6有有两个主要目标动脉电线损伤：股动脉和颈动脉。从技术角度来看，电线插入更容易为颈动脉，因为它们比股动脉宽。然而，新内膜形成往往是在颈动脉比股动脉，可能不太可靠，由于不太有效剥蚀。一些作者使用手工装置在颈动脉创造一个更积极的内皮剥蚀7另一方面，股动脉线损伤模型的优点在于，它可以与均匀。制造，市售的电线被执行以诱导新内膜增生中一个可再现的方式。
要成为一个成功的线损伤小鼠股动脉，关键是解剖显微镜具有足够的放大倍率下操作，并使用精密仪器 - microtweezers和microscissors尤其如此。 Microtweezers用锋利的秘诀是有用的dissecT出周围动脉组织，而那些用钝头是有用的放置动脉周围缝合循环，扩张的急剧动脉切开术与microscissors使电线入口孔。
动脉解剖剥离是另一个关键。周围动脉外膜存在一个薄的平面，其中该夹层能够容易且顺利地进行。首先找到了飞机，然后继续进行清扫。另外，尽量解剖出仅在缝合的部位循环，以避免静脉损伤，这是在此过程中的出血的主要原因相邻静脉。虽然在原始方法的动脉和静脉都集合起来，4，我们发现，循环动脉仅给出了两种止血和电线插入更好的控制。
电线插入此过程中最困难的部分。 0.015英寸线比DFA，访问动脉较厚的3倍。这里的关键技术分别是：扩张的DFA本身动脉切开术前;使得它逐渐microtweezer提示扩张小高考孔;避免有力的电线插入 - 这些技术进行了详细的协议部分。而在原始方法利多卡因加到扩张电线插入4前动脉，我们发现它是不必要的。
股动脉线损伤后内膜增生的进展随着时间的推移，在3-4周峰受伤后，并在第8周保持稳定。4,8作者根据我们的初步数据4周，通常等待的内膜3周量一般比的量4周线损伤后较少（数据未显示）。
有趣的是，响应于动脉损伤的各种小鼠品系之间不同。根据一些报告调查股或颈动脉损伤后小鼠品系之间的差异，FVB / N小鼠显示最高AMOUNT的新内膜形成，其次是129 / SVJ，C3H / HeJ小鼠，BALB / c和C57BL / 6，分别4,9,10这些特征应构成一个实验计划时予以考虑。股骨损伤模型也可以用于血管损伤后的炎症变化的调查。炎症细胞浸润报道损伤后三天显著增加，11
总之，使用小鼠股动脉导线损伤模型是特别合适的，调查血管成形术后再狭窄，并能安全，方便地使用这里介绍的方法来进行该过程。整个过程可以在20分钟内完成，一旦该技术完全熟悉。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
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