Summary
מודל פציעת חוט עורק הירך העכבר של היצרות הוא מאתגר מבחינה טכנית. בפרוטוקול זה אנו מציגים את הפרטים הטכניים מפתח חיוניים לביצוע בהצלחה פציעת חוט כדי לגרום neointima העקבי למחקרים של היצרות.
Abstract
מחלת לב וכלי דם הנגרמת על ידי טרשת עורקים היא הגורם המוביל למוות בעולם המפותח. צמצום של לומן הכלי, בשל התפתחות רובד טרשתית או פקיעת הפלאק הוקם, קוטע את זרימת דם נורמלית מובילה לתחלואות שונות כגון אוטם שריר לב ושבץ. בנהלי מרפאת endovascular כגון אנגיופלסטיקה מבוצעים בדרך כלל לפתוח מחדש את לומן. עם זאת, טיפולים אלה באופן בלתי נמנע נזק קיר הכלי, כמו גם את האנדותל של כלי הדם, מפעילה תגובת ריפוי מוגזמת ופיתוח של לוחית neointimal המשתרעת לתוך הלום גורם היצרות כלי (מחדש היצרות). היצרות נשארה גורם עיקרי לכישלון של טיפולי endovascular לטרשת עורקת. לפיכך, מודלים של בעלי חיים פרה-קליניים של היצרות הם חשובים וחיוני לחקירת מנגנוני pathophysiological כמו גם translational גישות להתערבות של כלי דם. בין כמה experime העכברימודלים פתיחות opening סגירות closures, פגיעת חוט עורק הירך מקובלת כמתאים ביותר ללימודים של היצרות לאחר אנגיופלסטיקה כי זה דומה להליך הצנתור שפוגע גם האנדותל וקיר כלי מקרוב. עם זאת, יש לי חוקרים רבים קושי ניצול מודל זה בשל הרמה הגבוהה של קושי טכני. זה בעיקר בגלל חוט מתכת צריך להיות מוכנס לתוך עורק הירך, שהם כ שלוש פעמים דקות יותר מהחוט, כדי ליצור פגיעה מספיק כדי לגרום neointima הבולט. כאן, אנו מתארים את הפרטים הניתוחיים ההכרחיים כדי להתגבר ביעילות על הקשיים הטכניים העיקריים של מודל זה. על פי הנהלים שהוצגו, ביצוע פציעת חוט עורק הירך עכבר הופכת להיות יותר קלה. ברגע להכיר, ההליך כולו יכול להסתיים בתוך 20 דקות.
Protocol
הצהרת אתיקה:: הערה כל הנהלים עומדים במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (אקדמיות העיתונות הארצית, המהדורה 8, 2011), ופרוטוקולים שאושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת ויסקונסין. כל הניתוחים בוצעו בהרדמה isoflurane (באמצעות שאיפה, לזרום 2 מיליליטר / דקת שיעור), וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. בעלי חיים היו מורדמים בחדר המלא בהדרגה עם CO 2.
1. אינדוקציה של הרדמה כללית וחתך בעור
- השתמש זכר C57BL / 6 עכברים עם גיל 12-16 שבועות ומשקל של 23-28 גרם. להרדים את החיה על ידי isoflurane באמצעות מנגנון הרדמה במעגל סגור. לאשר הרדמה תקינה על ידי צובט את הבוהן שלו. החל משחת דמעות מלאכותית על עיניים כדי למנוע יובש.
- מניחים את העכבר במצב שכיבה עם האיבר השמאלי האחורי מעט נחטף ומשותף sl הברךמכווץ ightly. לגלח את השיער סביב אזור הירך השמאלי העליון ולחטא את העור עם chlorhexidine, הוחל שלוש פעמים באמצעות החלת מכותנה שקצה סטרילי. השתמש מעקר חרוז חם כדי לשמור על המכשירים מעוקרים במהלך הניתוח.
- הנח וילון גזה מעוקרת על רגל השמאל. ביצוע חתך 1.5 סנטימטרים ישר, אורך עור על הירך המדיאלי השמאלית ממפרק הברך למפשעה (איור 1 א).
2. חשיפה של עורק הירך וסניפים
הערה: איור 1 מציג את האנטומיה כלי דם הגולמית בחלק העליון של הירך. עורק הירך השטחי (SFA) ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ לנתח כאשר החתך בעור נעשה כראוי לאורך קו האמצע של הירך המדיאלי.
- פתח את fascia הדק מעל SFA עם פינצטה בסדר, ואז לולאת SFA עם 9-0 תפר ניילון.
הערה: בתהליך זה, עצב הירך הוא לשים בקלות כIDE, אבל וריד הירך הסמוך דורש תשומת לב משום שקירה הוא כל כך דק שבו בקלות perforates והמדמם. טכניקת המפתח היא להתמקד בעורק עצמו; כל עוד לנתיחה מתבצעת בסמוך לעורק, וריד כל נזק מקרי הוא מיותר. - ברגע שSFA סובב, להחזיק את התפר עם מלקחיים יתוש ולמשוך אותו מעט כלפי מטה. תמרון זה עושה נתיחה נוספת קל יותר, אבל כדי למנוע נזק לעורק לא למשוך יותר מדי בכוח.
- תמשיך לנתח את העורק proximally לחשוף ולולאת עורק הירך הנפוצה (CFA) עם 9-0 תפר ניילון.
הערה: בדרך כלל, looping CFA בדיסטלי הצבע על העורק ברום הבטן (איור 1) הוא מספיק להכנסת חוט. החזק את תפר לולאת CFA עם מלקחיים יתוש באותה הדרך. - משוך את תפר לולאת CFA כלפי מעלה וכלפי מטה תפר לולאת SFA לחשוף את הסתעפות של SFA ועורק הירך עמוק (DFA). DFA, הסניף המרכזי של CFA,הולך לכיוון שריר הירך (איור 1).
הערה: החוט יתווסף מDFA מאוחר יותר. - לולאת DFA במשנה זהירות בגלל הווריד הסמוך הוא סבוך מתחת לעורק. במקרה של דימום מהעורק, דחיסה פשוטה 30 עד 60 שניות עם גזה היא בדרך כלל מספיק כדי לייצר עצירת דימום.
- ברגע שDFA סובב עם 9-0 תפר ניילון, לוודא שכל שלוש לולאות התפר נמצאות בעמדות הנכונות שלהם (איור 2 א).
- להמשיך עם דיסקציה של DFA distally ולקשור את העורק בנקודה רחוקה ככל האפשר מההסתעפות. חותך תפר נוסף אך להשאיר באורך מסוים, כך שיכולים להיות מוחזקים שני הקצוות עם מלקחיים יתוש, שלייצב את DFA מה שהופך את הכנסת החוט קל יותר.
3. יצירת חוט פגיעה
- הכנס חוט באמצעות DFA
- מסננים את תפרי CFA, SFA, וDFA להקים hemostat זמני.
- לעשות חור קטן בDFעם microscissors. הכנס את הטיפים של microtweezers המעוקל כדי להרחיב את החור גדול מספיק עבור חוט בקוטר 0.015 אינץ '(איור 2 מדגים את ההבדל בגודל בין העורק והחוט).
- לפני ביצוע חור בDFA, לשחרר את תפר לולאת CFA ועדינות מהדקת / לסחוט את DFA מספר פעמים עם microtweezers שקצהו משעמם. התמרון הזה מרחיב את הקוטר העורק להפליא כדי להקל על החדרת התיל. מלחלח את החוט ביסודיות עם PBS חשוב גם להחדרה חלקה.
- בעת ביצוע חור בDFA, לא לחתוך את הדופן העורקת, אבל להפוך את צביטה בצורת V קטנה ולצבוט את הדש עם microtweezers המחודד למניפולציה.
- הכנס את החוט דרך החור כראוי-מורחב על DFA. בעדינות לקדם את החוט לכיוון עורק הכסל תוך התרופפות תפר הלולאה סביב CFA. 5-8 מ"מ זה מספיק כדי לכסות את כל אורך CFA ברוב המקרים (איור 2 ג
- השאר חוט בתוך עבור 1 Min
- לאחר הכנסת החוט לאורך האופטימלי, להשאיר אותו לדקות 1 ללהתמתח יתר הדפנות העורקים. להרטיב את החוט ועורקים עם PBS כדי למנוע התייבשות. תפר 9-0 ניילון נוסף ניתן להציב סביב הפרוקסימלי DFA לנקודת תיל-ההכנסה בזמן ההמתנה הזה. תפר זה ישמש מאוחר יותר כדי לסגור את החור בDFA לאחר פינוי התיל.
- אחזר חוט ולחדש את זרימת הדם
- החזק את החוט עם מלקחיים cannulation הכלי, ולמשוך בחזרה אותו בעדינות; החוט צריך להאסף בצורה חלקה. כדי להתגבר על כל התנגדות, בדרך כלל נגרמת על ידי דבקות של החוט לדפנות העורקים, שהפיל את החוט עם סיבוב עדין מועיל. שוב, תמרון חזק יכול לגרום לאובדן של בעלי חיים.
- חרה אחזור התיל, לקשור DFA בנקודת הסתעפות עם תפר 9-0 ניילון. לא לקשור קרוב מדי להסתעפות, שיסכן את תזרים הדם לSFA.
- שחרר את לולאות תפר SFA וCFA לחדש את זרימת הדם הנורמלית. שים לב שCFA מורחב היטב על ידי החדרת תיל (איור 2 ד).
4. עור סגר ולאחר ניתוח טיפול
- שליטת מדמם. דליפה קטנה יכולה להיעצר על ידי דחיסה פשוטה; כמה דימומי עורקים גדולים ידרשו תפרים עם תפר 11-0 ניילון. עורקים נתפרו אלה סופו של דבר יגרמו לחסימת עורקים.
- סגור את עור פצע עם סיכות עור (בדרך כלל 3-4 סיכות). לשמור על אזור הפצע מעוקר על ידי יישום פתרון כירורגי chlorhexidine.
- החל טיפולים שלאחר ניתוח. לשלוט בכאב של העכבר עם זריקות תת עורית של עצירות. שמור את העכבר על כרית החימום עד שהוא חזר סוףficient תודעה לשמור כיבה sternal. הבית אותו בכלוב נקי בלי החברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ארבעה שבועות לאחר ניתוח, לקצור את עורק הירך-נפצע חוט ולעשות דגימת בלוק פרפין לנתח את היווצרות neointima. לגרום הרדמה כללית כפי שתואר לעיל. פתח את החזה באופן מיידי ולהכניס מחט פרפר 20-מד לחדר השמאלי. חבר את הקו לבקבוק עירוי. בצע קיבעון זלוף באמצעות עירוי טפטוף של PBS ואחריו 4% paraformaldehyde (בדרך כלל 10-20 מיליליטר, כל אחת). בקבוק העירוי ממוקם כ 140 סנטימטר גבוה יותר מרמת הלב כדי שבעל החיים הוא perfused בpressure.Wait הפיזיולוגי במשך 20 דקות ואז לקחת את CFA-נפצע התיל ולתקן אותה בparaformaldehyde 4% בין לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הפוך בלוק פרפין של הדגימה תוך שימוש בטכניקות היסטולוגית סטנדרטיים ולהכין חתכים בעובי 5 מיקרומטר לצביעה היסטולוגית.
צביעת Hematoxylin-eosin תאפשר להדמיה ברורה של היווצרות neointima בתוך f-נפצע החוטעורק emoral (איור 3 א, עורק הירך-נפצע תיל; 3B, עורק הירך וללא כל פגע) .Use תוכנה מתאימה כדי למדוד את שטח לומן (LA), lamina אלסטי הפנימי האזור (IEL), וlamina אלסטי אזור החיצוני (צלופח) מחתך (איור 3 ג). לחשב את שטח אינטימה על ידי הפחתת שטח לומן מאזור IEL; לחשב את שטח תקשורת על ידי הפחתת שטח IEL מאזור הצלופח. יחס שטח / אזור תקשורת אינטימה משמש להשוואת תצורות neointima בין קבוצות ניסוי שונות.
איור 1: איור ורישום סכמטי של חתך בעור וכלי דם האנטומיה. (א) חתך בעור מתאים הוא כ -1.5 סנטימטר אורך, לאורך קו האמצע של חלק עליון של ירך המדיאלי. (ב) מצא את עורק הירך השטחי ראשון, עורק הירך הנפוץ הבא, ולבסוף,עורק הירך עמוק. לנתח כל עורק בזהירות מבלי לפגוע בווריד הסמוך.
איור 2: חוט פגיעה נוהל. (א) בעורק הירך המשותף (חץ), עורק הירך השטחי (חץ מקווקו), ועורק (ראש החץ) הירך העמוקה נחשפים וכרך עם תפרים. (ב) שים הלב להיבדל בין גודל העורקים והאינץ '0.015 חוט. (ג) החוט מוכנס דרך עורק הירך העמוק. שמור את החוט בתוך דקות 1 ליש לי הדופן העורקת מתוח יתר על מידה. הזרימה (ד ') דם התחדשה. עורק הירך הנפוץ מורחב היטב לאחר פציעת חוט (חץ). בר מציין 1 מ"מ.
איור3: מכתים Hematoxylin-eosin של עורקי הירך-נפצע חוט וללא כל פגע. חתך של עורק הירך-נפצע חוט () חושף רובד עבה, סלולארי מאוד neointima. (ב) חתך של עורק הירך וללא כל פגע מדגים מבני דופן עורקות בשלמות ללא כל היווצרות neointima. (C) הירוק קו משרטט אזור לום, הקו הצהוב מתווה lamina אלסטי הפנימי, והקו הכחול מתאר lamina אלסטי החיצוני. בר מציין 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך פציעת החוט הוא ישים כל עוד המבנים אנטומיים שלהם דומים. 4 במאמר זה את כל הזנים של עכברים, שנהגנו C57BL / 6 עכברי זכרים עם גיל 12-16 שבועות. כפי שלמדנו מהמחקרים הראשוניים שלנו, עורקי הירך של עכברים צעירים מ -10 שבועות הם לעתים קרובות כל כך קטנים שהכנסת חוט היא די מאתגרת. מצד השני, הכנסת חוט בעכברים מבוגרים מ -16 שבועות היא מבחינה טכנית קלה יותר אבל נוטה לגרום להיפרפלזיה neointimal משתנה יותר. נקבות עכברים נוטים ליטול על עצמו פחות היווצרות neointimal מאשר גברים. למרות הליך פציעת חוט יכול להתבצע בכל צד של עורקי הירך, אנחנו מעדיפים את צד השמאל בגלל הנגישות אנטומיים למפעילים בידיים הנכונים.
בין כל המודלים העכבר של היצרות לאחר אנגיופלסטיקה, פגיעת חוט עורקים מחקה בעיקר באופן הדוק על ידי אנגיופלסטיקה denudation אנדותל וקיר כלי overstreching. 2,5,6 יששני עורקים מרכזיים היעד לפגיעה חוט: עורקי הירך ועורקי ראש. מנקודת המבט טכנית, הכנסת חוט היא קלה יותר לעורקי ראש כי הם רחבים יותר מעורקי הירך. עם זאת, היווצרות neointima נוטה להיות פחות חזק בעורקי ראש מאשר בעורקי הירך, כנראה עקב denudation פחות יעיל. חלק מהחברים להשתמש בהתקן בעבודת יד כדי ליצור denudation אנדותל אגרסיווי יותר בעורקי ראש. 7 מצד השני, היתרון של מודל פציעת חוט עורק הירך הוא שזה יכול להתבצע עם חוטים מיוצרים בצורה הומוגנית, זמינים מסחרי כדי לגרום hyperplasia neointimal ב אופן לשחזור.
כדי להפוך פציעת חוט מוצלחת בעורקי הירך עכבר, המפתח הוא לפעול תחת מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה מספקת ולהשתמש במכשירים עדינים - microtweezers וmicroscissors בפרט. Microtweezers עם טיפים שימושיים לחדים dissect את הרקמות המקיפות את העורק ואילו אלה עם טיפים בוטים שימושיים למקום תפר לולאה סביב העורק וכדי להרחיב את חור כניסת חוט שנעשה על ידי arteriotomy חד עם microscissors.
נתיחה האנטומי של העורק היא מפתח נוסף. סביב adventitia העורקים קיימים מטוס דק שבו הנתיחה יכולה להתבצע בקלות ובצורה חלקה. מצא את המטוס הראשון, ולאחר מכן להמשיך עם הניתוח. כמו כן, אנסה לנתח את הווריד הסמוך רק באתר של תפר לולאות כדי למנוע נזק וריד, המהווה את הגורם העיקרי לדימום בהליך זה. למרות בשיטה המקורית העורק לווריד הם כרך יחד, 4 אנו מוצאים כי עורק לולאה נותן שליטה טובה יותר לשתי עצירת דימום והחדרת חוט בלבד.
הכנסת חוט היא החלק הקשה ביותר של הליך זה. חוט 0.015 אינץ 'הוא בערך שלוש פעמים עבה יותר DFA, עורק הגישה. טכניקות המפתח כאןהם: מתרחב DFA עצמו לפני arteriotomy; מה שהופך את חור כניסה קטן המורחב בהדרגה עם טיפים microtweezer; והימנעות הכנסת חוט חזקה - טכניקות אלה המפורטים בסעיף הפרוטוקול. בעוד שבשיטה המקורית לידוקאין מיושם כדי להרחיב את העורק לפני החדרת חוט 4, אנו מוצאים אותו מיותר.
היווצרות Neointima לאחר פציעת חוט עורק הירך מתקדמת עם זמן, פסגות ב 3-4 שבועות לאחר פציעה, ונשארה יציב ברמה של 8 שבועות. 4,8 המחברים בדרך כלל לחכות 4 שבועות המבוססים על נתונים הראשוניים שלנו, כי הסכום של neointima ב 3 שבועות הוא בדרך כלל פחות מהסכום ב 4 שבועות לאחר פציעת חוט (מידע לא מוצג).
מעניין לציין, כי התגובות לפציעת עורקים שונות בין זנים השונים עכבר. על פי כמה דיווחים חוקרים הבדלים בין זני עכבר לאחר הירך או פגיעה בעורק התרדמה, עכברי FVB / N להציג amo הגבוה ביותרUNT של היווצרות neointima, ואחריו 129 / SvJ, C3H / HeJ, BALB / C, וC57BL / 6, בהתאמה. 4,9,10 צריכים להיחשב מאפיינים אלה בעת כתיבת תכנית ניסיונית. מודל פציעת הירך יכול גם להיות מנוצל לחקירה של שינויים דלקתיים לאחר פציעה של כלי דם. חדירת תא דלקתית דווחה להגדיל באופן משמעותי שלושה ימים לאחר פציעה. 11
לסיכום, מודל פציעת החוט באמצעות עורקי הירך עכבר מתאים במיוחד לחקור היצרות לאחר אנגיופלסטיקה, והתהליך יכול להתבצע בבטחה ובקלות תוך שימוש בשיטה שהוצגה כאן. ההליך כולו יכול להסתיים בתוך 20 דקות מהרגע שהטכניקות להכיר באופן מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
