Summary
再狭窄のマウス大腿動脈ワイヤ傷害モデルは、技術的に困難である。このプロトコルでは、我々は成功し、再狭窄の研究のための一貫性の新生内膜を誘導するために、ワイヤ傷害を実施するための不可欠なキー技術的な詳細を示している。
Abstract
アテローム性動脈硬化症により引き起こされる心血管疾患は、先進国における死亡の主な原因である。動脈硬化性プラークの開発や確立プラークの破裂による血管内腔の狭窄は、このような心筋梗塞や脳卒中などの様々な病的状態につながる正常な血流を遮断する。診療所では、そのような血管形成術などの血管内の手順は、一般的に内腔を再度開くために行われている。しかし、これらの治療は、必然的に、過剰な治癒反応と血管狭窄（再狭窄）を引き起こすルーメン内に延びて、新生内膜プラークの発達を誘発する、血管壁、ならびに血管内皮を損傷する。再狭窄は、アテローム性動脈硬化症のための血管内治療の失敗の主要な原因である。したがって、再狭窄の前臨床動物モデルは、病態生理学的機序ならびに脈管介入翻訳アプローチを調査するために極めて重要である。いくつかのネズミexperimeうち、それは密接に内皮および血管壁の両方を傷つける血管形成術に似ているので、NTALモデルは、大腿動脈ワイヤ傷害は広く血管形成術後の再狭窄の研究のために最も適していると認められている。しかし、多くの研究者が、技術的難易度の高い程度に、このモデルを利用して困難である。金属ワイヤが顕著新生を誘導するのに十分な損傷を生成するために、ワイヤの約3倍薄い大腿動脈に挿入する必要があるため、これは主にある。ここでは、効果的に、このモデルの主要な技術的困難を克服するために不可欠の手術の詳細を説明します。 、提示された手順に従って実行することによって、マウスの大腿動脈ワイヤ傷害が容易になる。慣れた後、全体の手順は、20分以内に完了することができる。
Protocol
注：倫理に関する声明：すべての手順は、実験動物の管理と使用に関する指針（全米アカデミープレス、第8版、2011）、およびウィスコンシン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに準拠しています。すべての手術は（速度2ml /分流量、吸入を介して）、イソフルラン麻酔下で実施し、全ての努力が苦痛を最小限にするために行われた。動物を、徐々にCO 2で満たされたチャンバー内で安楽死させた。
全身麻酔と皮膚切開の1の誘導
- 23〜28グラムの12〜16週の年齢と体重と雄のC57BL / 6マウスを使用してください。閉回路の麻酔装置を通過イソフルランにより動物を麻酔。そのつま先をつまんで、適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、目にいくつかの人工涙液軟膏を適用します。
- 少し拉致左後肢膝関節のSLと仰臥位でマウスを置きますightly撓む。左大腿上部領域の周囲の毛を剃るとクロルヘキシジンで皮膚を消毒、滅菌した綿先端アプリケーターを用いて3回を適用した。手術中に滅菌楽器を保つためにホットビーズ滅菌器を使用してください。
- 左足の上に滅菌ガーゼドレープを配置します。鼠径部（ 図1A）に膝関節からの左大腿内側に1.5センチメートルストレート、縦皮膚切開を行います。
大腿動脈と枝の2暴露
メモ： 図1（b）は、大腿上部における総血管系の解剖学を示している。皮膚切開が適切に大腿内側の正中線に沿って行われたとき浅大腿動脈（SFA）は、解剖顕微鏡で観察することができる。
- 細かいピンセットでSFAの上にある薄い筋膜を開き、9-0ナイロン縫合糸とループSFA。
注：このプロセスでは、大腿神経が容易ように置かれたその壁は、それが簡単に穿孔と出血していることを非常に薄いので、IDEが、隣接する大腿静脈は細心の注意が必要です。キー技術は動脈自体に集中することです。限り切開が近い動脈に行われるように、任意の偶発的静脈の損傷が回避される。 - SFAがループされると、モスキート鉗子で縫合糸を保持し、やや下向きに引き出します。この操縦は簡単にさらに解剖になりますが、あまりにも強制的に引っ張らないでください動脈を損傷しないように。
- 9-0ナイロン縫合糸で総大腿動脈（CFA）を露出し、ループするように近位に動脈を解剖続行。
注：通常、上腹部動脈（ 図1B）に遠位の点でCFAのループは、電線を挿入するための十分です。同じようにモスキート鉗子でCFAの縫合糸ループを保持します。 - 上向きのCFAの縫合糸ループを引いて、SFAの縫合糸ループを下方にSFAと深い大腿動脈（DFA）の分岐を明らかに。 DFA、CFAの主要な枝、大腿筋（ 図1B）に向かう。
注：ワイヤーは後でDFAから挿入されます。 - 余分な慎重にループDFA隣接静脈を動脈の下に絡まっているため。静脈からの出血の場合には、ガーゼで30〜60秒程度の単純な圧縮は、止血をもたらすのに通常は十分である。
- DFAは 、9-0ナイロン縫合糸でループされると、すべての3つの縫合糸ループは、（ 図2A）が正しい位置にあることを確認してください。
- 遠位に可能な限り分岐からポイントで動脈を結紮するDFAの解剖を続行します。余分な縫合糸をカットしますが、両端がDFAは、ワイヤの挿入を作るより簡単に安定させるモスキート鉗子で保持できるように一定の長さにしておきます。
3.ワイヤー傷害を作成する
- DFAを経由して電線を挿入
- 一時的な止血を確立するために、CFA、SFA、およびDFAの縫合糸をひずみ。
- DFに小さな穴を作るmicroscissorsとA。 0.015インチ径のワイヤーのために十分な大きさの穴を拡張するために湾曲したmicrotweezersの先端を挿入します（ 図2Bは、動脈とワイヤとの間のサイズの違いを示しています）。
- DFAに穴を行う前に、CFAの縫合糸ループを緩め、静かにクランプ/鈍い先端がmicrotweezersでDFA数回絞る。この操縦ワイヤの挿入を容易にするために著しく動脈の直径を拡大する。 PBSで徹底的にワイヤーを加湿することもスムーズに挿入するために重要である。
- DFAに穴を作るときは、動脈壁をトリミングが、小さなV字型のニップを作成し、操作するための鋭い先端がmicrotweezersとフラップを挟まないでください。
- DFAに適切に-拡張穴を通してワイヤーを挿入します。 CFAの周りに縫合糸ループを緩めながらゆっくりと腸骨動脈に向かって線を進める。 5〜8ミリメートルはほとんどの場合、すべてのCFAの長さをカバーするために十分である（ 図2C
- 1分間の中にワイヤーを残し
- 最適な長さにワイヤーを挿入した後、動脈壁を伸び過ぎ1分間放置する。乾燥を防ぐためにPBSワイヤおよび動脈を湿らせる。別の9-0ナイロン縫合糸は、この待ち時間の間にワイヤ挿入ポイントにDFA近位の周りに配置することができる。この縫合糸は、ワイヤの除去後DFAに穴を閉じるために後で使用される。
- ワイヤーを取得し、血流を再開
- 血管カニュレーション鉗子で線を持ち、ゆっくりと引き戻す。ワイヤーがスムーズに取得されるべきである。通常動脈壁へのワイヤの付着によって生じるいかなる抵抗を克服するために、穏やかに回転してワイヤーを引き戻すと便利です。ここでも、力強い操縦は、動物の損失につながる可能性があります。
- Aワイヤーを取り出すFTERは、9-0ナイロン縫合糸との分岐点でDFAを連結する。 SFAへの血液流出を危うく分岐、に近づきすぎ連結しないでください。
- 正常な血流を再開するためにSFAとCFAの縫合糸ループを緩めます。 CFAは、ワイヤの挿入（ 図2D）で十分に展開されていることに注意してください。
4.皮膚閉鎖と術後ケア
- コントロールが出血。マイナーにじみ出るは、簡単な圧縮によって停止することができる。いくつかの主要な動脈採血を11-0ナイロン縫合糸でステッチが必要になります。これらの縫合動脈は、最終的には動脈閉塞になります。
- スキンステープラー（通常3-4ステープル）で皮膚創傷を閉じます。クロルヘキシジン外科ソリューションを適用することにより、滅菌創傷領域にしてください。
- 術後の治療法を適用します。ブプレノルフィンの皮下注射でマウスの痛みを制御します。それはSUFを取り戻したまでは温暖化パッド上でマウスを保つ胸骨の横臥位を維持するために意識をficient。他の動物の会社のない清潔なケージ内のハウスには、完全に回復するまで。
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Representative Results
手術後4週間、ワイヤー損傷大腿動脈を収穫し、新生内膜形成を分析するためにパラフィンブロック標本を作る。上記のように全身麻酔を誘導する。すぐに胸を開き、左心室に20ゲージの翼状針を挿入します。点滴ボトルにラインを接続します。 4％パラホルムアルデヒド（通常は10〜20ミリリットル、各）に続いて、PBSの点滴を経由して灌流固定を行います。動物は、ワイヤ損傷CFAを取り出し、4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒド中で固定し、20分間生理pressure.Waitで灌流されるように、輸液ボトル、心臓レベルよりも約140センチメートル高く配置されている。標準的な組織学的技術を使用して、試料のパラフィンブロックを作成し、組織学的染色のために5μmの厚さの断面を準備します。
ヘマトキシリン - エオシン染色は、ワイヤ負傷したF内部の新生内膜形成の明確な可視化を可能にしますemoral動脈（ 図3A、ワイヤー損傷大腿動脈、3B、無傷の大腿動脈）内腔面積（LA）を測定するための適切なソフトウェア.USE、内弾性板（IEL）面積、および外弾性板（EEL）エリア断面から（ 図3C）。 IEL領域から内腔面積を減算することにより内膜の面積を計算する。 EEL領域からIEL面積を減算することでメディア領域を計算。内膜面積/メディア面積比は、異なる実験群間の新生内膜形成を比較するために使用される。
図1：皮膚切開と血管系の解剖学の概略図。最終的には（A）適切な皮膚切開が内側大腿上部の正中線に沿って、長さが約1.5cmである。（B）最初の浅大腿動脈、次の総大腿動脈を見つけ、そして、大腿深動脈。隣接する静脈を損傷することなく、慎重に各動脈を解剖。
図2：ワイヤー傷害手順。 （A）総大腿動脈（矢印）、浅大腿動脈（点線の矢印）、及び大腿深動脈（矢頭）が露出し、縫合糸でループバックされます。（B）動脈と0.015インチの間のサイズの違いに注意してくださいワイヤ（C）は、ワイヤが大腿深動脈を介して挿入されている。疲弊動脈壁を有して1分間内部電線を保持する。（D）血流が再開される。総大腿動脈ワイヤ傷害（矢印）後に十分に拡張される。バーは1ミリメートルを表します。
フィギュア3：ワイヤー負傷し、無傷の大腿動脈のヘマトキシリン - エオシン染色。 （A）は、ワイヤ損傷大腿動脈の断面が厚い、非常に携帯新生内膜プラークを明らかにする。（B）無傷の大腿動脈の断面が任意の新生内膜形成せずに無傷の動脈壁構造を示している。（C）緑ラインが管腔面積の輪郭を描く、黄色い線は内弾性板の輪郭を描く、そして青い線は外弾性板の輪郭を描く。バーは、100μmを示している。
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Discussion
ワイヤ傷害手順は、我々は12-16週齢の雄C57BL / 6マウスを使用する限り、それらの解剖学的構造が類似しているように4本研究では、マウスのすべての株に適用可能である。私たちは私たちの予備的研究から学んだように、10週より若いマウスの大腿動脈は、多くの場合、線挿入は非常に困難であることが非常に小さい。一方、16週間以上経過したマウスにおける電線挿入は、技術的に容易であるが、より多くの変数新生内膜過形成をもたらす傾向がある。雌マウスは、雄よりも低い新生内膜形成を招く傾向がある。ワイヤー傷害手順は大腿動脈のいずれかの側で行うことができますが、我々が原因右利きの演算子のための解剖のアクセシビリティの左側を好む。
血管形成術後の再狭窄のすべてのマウスモデルのうち、動脈ワイヤ傷害はほとんど密接内皮裸出と血管壁overstrechingによる血管形成を模倣あり2,5,6-大腿動脈および頚動脈：ワイヤー傷害のための2つの主要な標的動脈がある。彼らは大腿動脈よりも幅が広いので、技術的な観点から、電線挿入は頸動脈のために簡単です。しかし、新生内膜形成があまり効果的侵食の可能性が、大腿動脈よりも頸動脈内に弱くなる傾向がある。一部の著者は、頸動脈内に、より積極的な内皮裸出を作成する手作りのデバイスを使用する。7一方、大腿動脈ワイヤ傷害モデルの利点は、内新生内膜過形成を誘発するために均一に製造され、市販されているワイヤを用いて行うことができるということである再現性のある方法。
特にmicrotweezersとmicroscissors - マウス大腿動脈に成功ワイヤー傷害を作成するには、キーは十分な倍率で解剖顕微鏡下で動作するように、微細な楽器を使用することです。鋭い先端を持つMicrotweezersはdissecするために有用である鈍い先端を有するものは、動脈の周りに縫合糸ループを配置するとmicroscissorsと鋭い動脈切開によるワイヤーの入り口穴を拡張するために有用であるのに対し、動脈周囲の組織をトン。
動脈の解剖学的解剖は別のキーです。動脈の外膜の周囲切開を容易かつ円滑に行うことができる薄い平面が存在する。解剖を続行その後、第一の平面を検索します。また、唯一の縫合部位に隣接する静脈を切開しようとする、この手順での出血の主な原因である静脈の損傷を避けるためにループする。原法では動脈と静脈を一緒にループされていますが、4我々 は 、ループ動脈は唯一の止血とワイヤ挿入の両方のためのよりよい制御を与えることを見つける。
ワイヤー挿入は、この手順の中で最も難しい部分です。 0.015インチのワイヤがDFA、アクセス動脈よりも約3倍厚い。ここで重要なテクニック以下のとおりです。動脈切開の前にDFA自体を拡張する。徐々にmicrotweezerのヒント拡張されている小さな入口穴を作る。と力強い線挿入を避けること - これらの技術は、プロトコルセクションで詳述されている。原法リドカインワイヤ挿通4の前に動脈を拡張するために適用されているが、我々はそれが不要見つける。
大腿動脈ワイヤ傷害後の新生内膜形成は損傷後、時間で3〜4週間でピークを進行し、8週で安定している。4,8著者は通常、私たちの予備データに基づいて、4週間待つ3週間での新生内膜の量そのワイヤー損傷後4週目の量よりも一般的に低い（データは示さず）。
興味深いことに、動脈損傷に対する応答は、様々なマウス系統間で異なる。大腿動脈または頸動脈損傷後のマウス系統間の違いを調査するいくつかの報告によると、FVB / Nマウスは、最高アモを表示実験計画を構成する際に、それぞれ129 / SVJ、C3H / HEJ、BALB / C、およびC57BL / 6に続いて新生内膜形成、のUNT。4,9,10これらの特性は考慮されるべきである。大腿骨損傷モデルはまた、血管損傷後の炎症性変化の調査のために利用することができる。炎症性細胞浸潤3日傷害後に有意に増加することが報告された。11
結論として、マウスの大腿動脈を用いたワイヤ傷害モデルは、血管形成術後の再狭窄を調査するために特に適しており、プロセスは、ここに提示した方法を用いて、安全かつ容易に行うことができる。技術が十分に習熟されると、全体の手順は、20分以内に終了させることができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
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